Бактерицидная активность Т-лимфоцитов коров до и после лечения хронического эндометрита

Размещено на http://www.allbest.ru/

1

2

БАКТЕРИЦИДНАЯ АКТИВНОСТЬ Т-ЛИМФОЦИТОВ КОРОВ ДО И ПОСЛЕ ЛЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ЭНДОМЕТРИТА

В.П. РАДЧЕНКОВ,

B.C. ХЛОПОНИН,

Л.Ф. МОРОЗ

Оценивали эффективность термоинактивированной суспензии штаммов синегнойных бактерий (Pseudomonas aeruginosa) при лечении коров, больных хроническим гнойно-катаральным эндометритом. Определяли бактерицидную активность Т-лимфоцитов крови по отношению к Actinomyces pyogenes. Обсуждается механизм действия предложенного препарата для лечения гнойно-катарального эндометрита коров.

Summary

BACTERICIDAL ACTIVITY OF T-LYMPHOCYTES IN COWS BEFORE AND AFTER THE TREATMENT OF CRONIC ENDOMETRITIS

V.P. Radchenkov, V.S. Khloponin, L.F. Moroz

The efficiency of thermoinactivated suspension of blue pus bacillus (Pseudomonas aeruginosa) was estimated during treatment of cows with chronic purulent-catarrhal endometritis. The bactericidal activity of blood T-lymphocyte with respect to Actinomyces pyogenes was determined. The authors are discussed the mechanism of action of proposed preparation for treatment of purulent-catarrhal endometritis in cows. It was shown, that intrauterine injection to ill cows of thermoinactivated suspension of blue pus bacteria stimulates the migration of phagocytes and T-lymphocytes to place of inflammation. This cells effect directly on microorganisms and take effect at first an proinflammatory, and then -- anti-inflammatory action, that causes the activation of regenerative processes in uterus and the disappearance of inflammation.

штамм бактерия катаральный эндометрит корова

В последнее время большое внимание уделяется изысканию иммунологических способов лечения хронических эндометритов. Это связано с тем, что терапия антибиотиками, сульфаниламидами и нитрофуранами имеет ряд существенных недостатков, к которым относятся высокая резистентность штаммов микроорганизмов к перечисленным препаратам, возникающая даже после непродолжительного курса лечения, подавление иммунитета, снижение качества молока (1, 2). Известно, что основная причина возникновения хронических эндометритов у коров -- угнетение иммунной системы и особенно ее клеточного звена (3). Показано, что за 1-2 нед до и после отела и особенно в период отела у коров резко снижается количество Т-лимфоцитов, экспрессирующих поверхностные антигены (СD2⁺, СD3⁺, СD4⁺, СD8⁺), и В-лимфоцитов (4). К тому же по сравнению с серединой лактации большинство СD4⁺ Т-клеток продуцирует интерлейкины (IL-4 и IL-10) -- противовоспалительные цитокины, подавляющие формирование специфических Т-киллеров и усиливающие пролиферативные процессы в тканях (5). У коров, больных хроническим эндометритом, наблюдается угнетение синтеза как провоспалительных, так и противовоспалительных цитокинов (1).

Ранее нами была обнаружена прямая бактерицидная активность Т-лимфоцитов крупного рогатого скота по отношению к некоторым штаммам условно-патогенной микрофлоры, наиболее часто выделяемым у коров, больных гнойно-катаральным эндометритом (6). Отличительной особенностью этого вида иммунитета является, с одной стороны, строгая специфичность индукции, а с другой, -- секреция Т-клетками бактерицидных лимфокининов, вызывающих неспецифический лизис ряда микроорганизмов, включая представителей разных родов и семейств. Мы также выявили высокую эффективность инактивированной суспензии семи штаммов синегнойной палочки при лечении хронического гнойно-катарального эндометрита (7).

В связи с этим целью настоящей работы было исследование бактерицидной активности Т-лимфоцитов больных хроническим гнойно-катаральным эндометритом коров до и после лечения препаратом, полученным на основе термоинактивированной суспензии семи штаммов Pseudomonas aeruginosa (ТИССП).

Методика. Объектом исследования служили коровы черно-пестрой породы (n = 30). Лимфоциты периферической крови выделяли традиционным способом на градиенте плотности фиколл-верографина (1,077) или посредством гемолиза эритроцитов 0,83 % раствором хлористого аммония. Т-лимфоциты выделяли посредством избирательной адгезии В-лимфоцитов на поверхности пластика, нагруженного кроличьими антителами к иммуноглобулинам крупного рогатого скота (8). Макрофаги получали традиционным способом, затем их отмывали и доводили культуральной средой до конечной концентрации 110⁴ кл/мл суспензии, вносили в лунки микропланшета по 0,1 мл и культивировали в СО₂-инкубаторе (5 % СО₂) в течение ночи (16-18 ч) при 37^о С, после чего отмывали от неприлипающих к пластику клеток.

Известно, что взрослое поголовье крупного рогатого скота, как правило, сенсибилизировано к штаммам синегнойной палочки. В связи с этим для максимальной ресенсибилизации Т-лимфоцитов мы использовали термоинактивированную суспензию семи наиболее распространенных штаммов Ps. aеruginosa, выделенных ранее из клинического материала. Полученную субпопуляцию Т-лимфоцитов отмывали и доводили до конечной концентрации 410⁵ кл/мл средой RPMI-1640, содержащей 2 мМ L-глутамина, 25 мМ HEPES-буфера, 50 мкг гентамицин-сульфата, 10 % инактивированной сыворотки плода крупного рогатого скота и 10⁸ кл/мл ТИССП, культивировали в СО₂-инкубаторе в течение ночи при 37 ^оС. Далее лимфоциты отмывали от микробных клеток, вновь ресуспендировали в культуральной среде без гентамицина и ТИССП, но содержащей инактивированный штамм, входящий в ТИССП, и культивировали с макрофагами или без них в СО₂-инкубаторе в течение 3 ч при 37 ^оС. Затем Т-клетки вновь отмывали от бактерий и ресуспендировали в культуральной среде без гентамицина и ТИССП.

В качестве клеток-мишеней при определении прямой бактерицидной активности Т-лимфоцитов использовали штамм Actinomyces pyogenes, выделенный нами ранее от коровы, больной хроническим гнойно-катаральным эндометритом, по методу Теньковой с соавт. (9).

Бактерицидную активность Т-лимфоцитов определяли по Marcham с соавт. (10). Для этого в лунки микропланшета вносили по 0,1 мл суспензии лимфоцитов (410⁵ клеток на лунку) и взвесь суспензии Act. pyogenes (1-210² клеток на лунку) культивировали в СО₂-инкубаторе в течение 4 ч при 37 ^оС, после чего содержимое лунок осторожно ресуспендировали и отбирали по две пробы объемом 50 мкл. Первую пробу высевали на мясо-пептонный агар в чашки Петри, вторую разбавляли в 10 раз и также высевали на эту же среду. На следующий день подсчитывали число выросших колоний. Степень бактерицидной активности Т-лимфоцитов определяли по разнице между числом колоний контрольной и опытной пробы.

Коровам, больным хроническим гнойно-катаральным эндометритом, внутриматочно вводили ТИССП в 4-кратной повторности с интервалом в 24 ч из расчета 50 мл на одну дозу (10⁸ кл/мл). Животным в контрольной группе по идентичной схеме вводили левоэритросульфин из расчета 75-100 мл на одну дозу.

На первом этапе исследований изучали прямую бактерицидную активность по отношению к Act. pyogenes. Т-лимфоцитов здоровых и больных хроническим гнойно-катаральным эндометритом коров. В следующих экспериментах оценивали эффективность лечения больных коров препаратом на основе ТИССП и изменение у последних бактерицидной активности Т-лимфоцитов.

Результаты. Прямая бактерицидная активность нрТ- и рТ-лимфоцитов, инкубированных с макрофагами и без них, была практически одинаковой как у здоровых, так и у больных хроническим гнойно-катаральным эндометритом коров (табл. 1). В то же время отмечена незначительная тенденция уменьшения антимикробной активности Т-лимфоцитов у больных животных по сравнению со здоровыми.

Одинаковая бактерицидная активность Т-лимфоцитов периферической крови здоровых и больных коров может быть связана с тем, что относительно невысокая концентрация микроорганизмов в зоне воспаления недостаточна для интенсивной миграции к ней Т-лимфоцитов. Кроме того, известно, что бактерии синтезируют факторы, препятствующие их адгезии с клетками иммунной системы. Ранее было показано, что прямая антимикробная активность Т-лимфоцитов имеет местный (локальный) характер и проявляется лишь при непосредственном контакте с бактериями (10).

1. Сравнительная антимикробная активность Т-лимфоцитов по отношению к Actinomyces pyogenes здоровых и больных хроническим гнойно-катаральным эндометритом коров

Бактерицидная активность нрТ-клеток возрастала у коров после лечения хронического гнойно-катарального эндометрита ТИССП. При этом наибольшая эффективность отмечена при совместном культивировании Т-лимфоцитов с макрофагами (табл. 2).

2. Антибактериальная функция Т-лимфоцитов коров, больных хроническим гнойно-катаральным эндометритом, до и после лечения препаратом, полученным на основе термоинактивированной суспензии семи штаммов Pseudomonas aeruginosa (ТИССП)

У коров на 2-е сут после обработки ТИССП резко увеличивалось выделение гнойных масс и нередко повышалась температура тела, то есть воспалительный процесс обострялся, что обусловлено синтезом бактерицидных цитокинов, интерлейкинов (IL-2, IL-12), факторов некроза опухолей (TNF-) и интерферона (IFN-) (5). Спустя 3-4 сут после начала лечения, как правило, выделение гнойных масс прекращалось, и на 8-12-е сут размер матки возвращался к исходному. Такая резкая активация регенерационных процессов в матке, видимо, объясняется изменением соотношения провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в сторону последних. Как известно, противовоспалительные цитокины осуществляют важную роль в процессах регенерации, обеспечивая антиапоптотический эффект (11).

У больных коров после обработки ТИССП сокращалось время от начала лечения до плодотворного осеменения, и повышалась результативность последнего как при первом осеменении, так и при повторных (в течение 90 сут).

Таким образом, у здоровых и больных хроническим гнойно-катаральным эндометритом коров бактерицидная активность Т-лимфоцитов существенно не различается. Слабая элиминация микроорганизмов у больных животных обусловлена недостаточной миграцией Т-лимфоцитов и фагоцитарных клеток в зону воспаления. При внутриматочном введении термоинактивированной суспензии семи штаммов Pseudomonas aeruginosa наблюдается стимуляция миграции Т-клеток и фагоцитов в зону воспаления, а также повышается антибактериальная активность Т-лимфоцитов, благодаря чему происходит элиминация микроорганизмов и регенерация клеток и тканей матки.

ЛИТЕРАТУРА

1.Dosogne H., Hoeben D., Burvenich C. Effect of cepharin and mecillinamon the phagocytic and respiratory burst activity of neutrophill leukocytes isolated from bovine blood. Y. Vet. Pharmacol. Therap., 2001, 21, 6: 421-427.

2.Schwars S., Chaslus - Danela E. Use of antimicrobials in veterinary medicine and mechanisms of resistance. Vet. Res., 2001, 32, 314: 201-236.

3.Van Rampen C., Mallard B.A. Effect of peripartum stress and healton circulating bovine lymphocyte subsets. Vet. Immunol., Immunopath., 1997, 59, 1/2: 79-91.

4.Kimura K.G, Yoff J.P., Kehrli M.E. Phenotype analysis of peripheral blood mononuclear cells in periparturient dairy cows. Y. Dairy Sci., 1999, 82, 2: 315

5.Chafer - Weaver K.A., Corl C.M., Sordillo L.M. Shifts in bovine CD4+ subpopulation increase T-helper-2 compared with postpartum period. J. Dairy Sci., 1999, 82: 1696-1706.

6.Радченков В.П., Стоянов В.К. Новый препарат в лечении эндометритов у коров. Зоотехния, 1995, 9: 21-22.

7.Радченков В.П., Турко Т.И., Скоморохова С.В. и др. Иммуномодуляция Т-лимфоцитов в лечении эндометритов у коров. Аграрная наука, 2000, 3: 23-24.

8.Мейсон Д., Пенхейи Д., Седжуик Д. Выделение различных субпопуляций лимфоцитов. В кн.: Лимфоциты. Методы /Под ред. Д. Клауса. М., 1990: 69

9.Тенькова О.В., Иренков И.П., Лучко М.А. Методические указания по выделению и идентификации Actinomyces pyogenes (Corinebacterium) при патологии репродуктивных органов у крупного рогатого скота. М., 1991.

10.Marcrham P.B., Pior G.B., Goelluer S. In vitro T-mediated killing Pseudomonas aeruginosa. The role of macrophages and T-cell killing. J. Immunol., 1985, 134, 6: 4112-4117.

11.Dayer J .M. Regulati on of IL/TNF, their natural inhibitors, and other cytocines in chronic inflammation. Immunologist, 1997, 5, 6: l92-196.

Размещено на Allbest.ru