Биологическая оценка воздействия на организм кроликов рекомбинантных штаммов лактобацилл с геном рилизинг-фактора гормона роста

У кроликов, получавших исходные штаммы пробиотиков (II и IV группы), цитоплазма большинства нейронов супраоптического ядра была заполнена гранулами нейросекрета, которые проникали в отростки клеток; площадь ядра и тела нейронов была несколько ниже, чем в контроле.

Показано, что нонапептиды супраоптического ядра стимулируют ДНК-синтетическую активность многих клеток, в том числе, усиливают пролиферативную активность аденогипофиза (13). Учитывая, что аденогипофиз в норме характеризуется низкой скоростью пролиферации клеточных популяций, следует полагать, что не все клетки участвуют в этом процессе. Результаты наших исследований свидетельствуют о стимуляции пролиферации эпителиоцитов под влиянием экзогенного соматолиберина (табл. 2). Как известно, ростовые и метаболические процессы начинаются с импульсной эпизодической секреции СТГ гипофизом, регулируемой соматолиберином и соматостатином (14).

Рис. 1. Электронные микрофотографии клеток гипоталамуса (а), аденогипофиза (б и в) и печени (г) кроликов, получавших перорально рекомбинантные штаммы Lactobacillus sp.: а -- крупные «светлые» нейроны содержат большое пузырьковидное ядро и небольшое количество мелкозернистых гранул (окраска по Гомори, Ѕ400); б -- гипертрофия ядрышек, которые имеют разрыхленный вид за счет увеличения содержания нитчатого компонента (Ѕ20000); в -- активация синтеза и секреции гранул в соматотрофах (Ѕ10000); г -- полиплоидные клетки гепатоцитов содержат по два или три ядра с хорошо развитыми ядрышками (окраска по Акимченкову, Ѕ400).

В гипофизе кроликов III и V групп (второй опыт) было на 5 % больше соматотропоцитов, чем у животных в контроле. В активированных клетках аденогипофиза отмечено возрастание числа свободных рибосом, гипертрофия ядер и особенно ядрышек, которые приобретали разрыхленный вид за счет увеличения содержания нитчатого компонента (рис., б). Интенсивность синтеза и секреции гранул в соматотропоцитах были несколько выше, чем в контроле (рис., в).

Митотический коэффициент клеток аденогипофиза кроликов в зависимости от продолжительности перорального введения препаратов на основе штаммов Lactobacillus sp.

В печени кроликов III и V групп наблюдалось увеличение количества гипертрофированных гепатоцитов с полиплоидными ядрами. Цитоплазма клеток была обогащена органеллами, имела хорошо выраженную гранулярную и агранулярную эндоплазматическую сеть, что свидетельствует об интенсивном синтезе белка. Большинство гепатоцитов содержали по два или три ядра с хорошо развитыми ядрышками нуклеолонемного характера, что характерно для незрелых (бластных) форм клеток (рис., г).

Мышечная, подкожная жировая и костная ткани. Наибольший диаметр мышечных волокон отмечен у крольчат, получавших рекомбинантные штаммы лактобацилл в течение 3 мес; площадь ядра клеток у кроликов III и V групп была выше, чем в остальных группах (табл. 3).

Диаметр волокна (мкм) и площадь ядра (мкм2) клеток четырехглавой мышцы бедра кроликов в зависимости от продолжительности перорального введения препаратов на основе штаммов Lactobacillus sp.

В подкожной жировой ткани обнаружено уменьшение диаметра адипоцитов у кроликов, получавших рекомбинантные штаммы, тогда как у животных II и IV групп отмечено достоверное увеличение размеров адипоцитов (табл. 4).

Диаметр адипоцитов подкожной жировой ткани кроликов в зависимости от продолжительности скармливания препаратов на основе штаммов Lactobacillus sp. (мкм)

В эпифизарной ростовой пластинке бедренной кости кроликов III и V групп выявлено незначительное увеличение митотической активности хондроцитов. Длина трубчатых костей грудной и тазовой конечностей у животных, получавших рекомбинантный штамм Lactobacillus sp. 8PA3 (pLF-SL2), была больше (Р < 0,05-0,01), чем у сверстников из других групп, что согласуется с данными об увеличении линейных параметров кроликов III и V групп (табл. 5).

Длина трубчатых костей конечностей кроликов в зависимости от перорального введения препаратов на основе штаммов Lactobacillus sp. в течение 2 мес (второй опыт) (см)

Органы иммунной системы. Под влиянием рекомбинантных штаммов в тимусе отмечены изменения клеточного состава коркового и мозгового вещества: значительное увеличение числа средних лимфоцитов, лимфобластов, эпителиоретикулоцитов и митотически делящихся клеток. Размеры тимуса были увеличены как за счет коркового, так и мозгового вещества. При использовании исходных штаммов происходили однонаправленные изменения, но слабее были выражены пролиферативные процессы.

В брыжеечных лимфоузлах при действии рекомбинантных штаммов бактерий выявлен комплекс морфологических изменений, свидетельствующих об усилении иммунопоэтической функции, что подтверждается увеличением площади коркового вещества и количества лимфоидных узелков с герминативными центрами. Во всех структурах лимфатических узлов наблюдалась тенденция к увеличению числа молодых форм лимфоцитов и митотически делящихся клеток. При использовании исходных пробиотических штаммов бактерий были отмечены аналогичные изменения, но выраженные в меньшей степени; кроме того, в мякотных тяжах увеличивалось число макрофагов.

Применение как рекомбинантных, так и исходных штаммов Lactobacillus sp. вызывало перераспределение клеток по всем исследованным зонам селезенки. Так, незначительно увеличивалось общее число клеток, приходящихся на единицу площади в центре лимфоидных узелков, главным образом за счет почти 4-кратного увеличения по сравнению с контролем доли ретикулярных клеток; число малых лимфоцитов уменьшалось в 2 раза. Количество лимфоцитов (средних и больших) и митотических клеток возрастало соответственно в 3, 9 и 2,5 раза. Аналогичные результаты получены у кроликов, в рацион которых входили исходные штаммы бактерий, но число митозов при этом было немного ниже.

В тонком кишечнике подопытных животных усиливалась митотическая активность эпителиоцитов крипт и возрастало число межэпителиальных лимфоцитов -- соответственно в 3 раза и на 27 % (по сравнению с контролем). В лимфоидной ткани слепой кишки под влиянием пробиотиков увеличивались число молодых форм лимфоцитов (на 18 % по сравнению с контролем), плотность расположения клеток между узлами, число плазматических и розеткообразующих клеток (в 1,5 раза).

Рост, развитие, продуктивность и качество мяса. В обоих опытах кролики во всех группах были клинически здоровыми, имели хороший аппетит, нормально росли и развивались. Существенной разницы в потреблении кормов между животными разных групп не отмечено.

В первом опыте скармливание исходного пробиотического штамма Lactobacillus sp. 8PA3 в течение 1 мес не оказывало существенного влияния на рост крольчат, тогда как при использовании рекомбинантного штамма валовой прирост увеличивался на 30,9 % (табл. 6). При этом у животных II и III групп отмечено увеличение длины корпуса и обхвата груди за лопатками. Эти данные свидетельствуют о том, что рекомбинантный штамм Lactobacillus sp. 8PAЗ (pLF-SL2) с геном соматолиберина обеспечивал наработку и всасывание гормона из кишечника в кровяное русло и стимулировал выработку эндогенного соматотропина.

Аналогичные результаты получены и во втором опыте, продолжавшемся 3 мес. Несмотря на то, что препараты микроорганизмов скармливали в смеси с комбикормом, действие рекомбинантных штаммов было очевидным. За первый месяц прирост живой массы у кроликов I и II групп оказался одинаковым, тогда как в III и V группах он был соответственно на 14 и 27,5 % (Р < 0,05) выше, чем в контроле. После 2-месячного скармливания препаратов наибольший прирост живой массы отмечен у кроликов III и V групп, получавших рекомбинантные штаммы L. acidophilus КЗ и Lactobacillus sp. 8PA3 с геном соматолиберина -- на 17,7 % выше, чем в контроле. Во II и IV группах этот показатель соответственно оставался на уровне I группы или превосходил последний на 10 %. В целом по опыту прирост живой массы кроликов в III и V группах был выше, чем в контроле соответственно на 11 и 19,7 %. При скармливании исходного пробиотического штамма Lactobacillus sp. 8PA3 живая масса возрастала на 19 %.

Живая масса и промеры тела кроликов в зависимости от перорального введения препаратов на основе Lactobacillus sp. в течение 1 мес (первый опыт)

Измерение основных промеров тела кроликов в конце второго опыта показало, что по длине туловища, длине корпуса и обхвату груди за лопатками животные I-III групп существенно не различались, тогда как у их сверстников, получавших исходный и рекомбинантный штаммы Lactobacillus sp. 8PA3, обхват груди был больше, а по индексу сбитости они превосходили контроль соответственно на 6,9 и 9,5 %. Эти животные быстрее росли и на 16-17 % меньше затрачивали кормовых единиц и переваримого протеина на 1 кг прироста живой массы.

По убойному выходу тушек существенных различий между группами не отмечено -- 51-53 %. Однако при обвалке полутушек соотношение мышечной и жировой тканей изменялось. Так, после 2-месячного скармливания препаратов доля мышечной ткани у кроликов III и V групп составляла соответственно 72,5 и 75,5 % против 69,4 % в контроле, а содержание жира -- соответственно 6,2; 4,8 и 7,4 %. Аналогичная закономерность наблюдалась и при убое животных в конце опыта.

Все тушки были отнесены к первой категории: мышцы конечностей, задние окорочка и мышечная ткань на груди, спине и в поясничной области были хорошо развиты, остистые отростки не выступали, отмечены отложения жира в паховой области и на холке; мясо на разрезе -- упругое, светлое, слегка влажное; почки и внутренние органы -- окружены жиром белой окраски. Свежее мясо не имело посторонних запахов. При бактериоскопии отпечатков мяса на предметных стеклах никакой микрофлоры обнаружено не было. Однако при посевах на мясопептонный агар проб крови и печени кроликов II и III групп, которым скармливали исходную и рекомбинантную культуры L. acidophilus КЗ, были выделены единичные колонии микроорганизмов.

По химическому составу мяса у кроликов в опыте и контроле выявлены различия. Так, содержание сухого вещества в мясе животных III-V групп оказалось достоверно выше (Р < 0,02), чем в контроле. По содержанию белка и золы различия между группами были незначительными. В мясе животных, получавших исходные пробиотические штаммы L. acidophilus КЗ и Lactobacillus sp. 8РАЗ, содержание жира было больше, чем при скармливании рекомбинантных штаммов лактобацилл. В последнем случае уменьшалось количество жира в мясе задних окорочков, что (хотя и косвенно) свидетельствует о стимуляции синтеза эндогенного соматотропина.

Оценка молодняка, нарождающегося от матерей, получавших в период беременности рекомбинантный штамм Lactobacillussp. 8 Р А З (pLF- SL2) -- вторая серия эксперимента. Физиологический эффект от перорального применения бактерий, экспрессирующих ген соматолиберина, зависит от ряда факторов: уровня транскрипции клонированного гена (сила промотора); эффективности трансляции соматолибериновой мРНК (SD-участок); устойчивости пептида к бактериальным внутриклеточным пептидазам (протеиназам); способа выхода пептидных молекул из клеток бактерий (посредством секреции или в результате лизиса клеток); устойчивости пептида в кишечном химусе; эффективности транспорта соматолиберина из кишечника в кровь; сохранности пептидных молекул в кровяном русле и их способности преодолевать гематоэнцефалический барьер.

Информация по этим факторам в настоящее время отсутствует. Вместе с тем известно, что в норме соматолиберин не попадает в общее кровяное русло, так как он находится в крови только на очень коротком отрезке от гипоталамуса к гипофизу, который изолирован от общего сосудистого русла. Таким образом, попадая в общий кровоток, гормон оказывается там «чужеродным» белком и одной из причин его элиминации является связывание с антителами, которые образуются при парэнтеральном введении гипоталамических факторов. Следовательно, иммунный ответ должен уменьшать физиологический эффект использования экзогенного соматолиберина. В то же время известно, что явление толерантности обусловлено тем, что антигены, с которыми соприкасается плод млекопитающих в период внутриутробного развития, позднее не воспринимаются как «чужие», и к ним антитела не вырабатываются.

В результате ежесуточного скармливания самкам в период беременности рекомбинантного штамма существенно увеличивалась живая масса нарождающегося молодняка. Так, живая масса крольчат калифорнийской породы и породы советская шиншила при рождении в контроле составляла соответственно 655 и 684 г, а в опыте -- 985 и 904 г (Р < 0,01), то есть превосходила таковую в контроле соответственно на 51 и 32 % (в среднем на 41 %). Эти данные дают основание предположить, что образуемый рекомбинантным штаммом соматолиберин после всасывания в кровь проникает через плацентарный и гематоэнцефалический барьеры и оказывает специфическое действие на формирующуюся у эмбрионов систему гормональной регуляции. Необходимо также отметить, что крольчата, родившиеся от матерей, получавших рекомбинантный штамм, лучше росли и в возрасте 40 сут превосходили по живой массе своих сверстников из контрольной группы на 26 % (980 против 777 г).

Введение в течение 3 мес в рационы молодняка 45-суточного возраста, полученного от контрольных самок, исходного пробиотического и рекомбинантного штаммов Lactobacillus sp. 8PA3 повышало прирост живой массы соответственно на 2,0 и 4,4 %; у крольчат, родившихся от матерей, которым давали рекомбинантный штамм, увеличение прироста составляло соответственно 4,3 и 14,5 %. Длина корпуса и обхват груди за лопатками у животных I, II и III групп в конце опыта составляли в среднем соответственно 36,0 и 27,6 см против 34,2 и 25,5 см у кроликов IV, V и VI групп. По индексу сбитости крольчата, родившиеся от матерей, которым скармливали рекомбинантный штамм, и сами получавшие его с комбикормом в течение 3 мес, достоверно (Р < 0,05) превосходили контроль. У этих животных в аденогипофизе усиливался кровоток, повышалось число митозов и увеличивался выход секреторных гранул в капилляры. В поджелудочной железе выявлено увеличение числа и размера островков Лангерганса, что, видимо, обусловливало увеличение диаметра мышечных волокон в 1,5 раза по сравнению с контролем. В тимусе, лимфатических узлах и селезенке отмечено увеличение герминативной зоны узелков, появление большого числа бластных форм лимфоцитов и кластерообразующих клеток, что свидетельствует о функциональной зрелости иммунной системы подопытных животных. Следовательно, введение в рацион беременным крольчихам экспрессирующего ген соматолиберина штамма Lactobacillus sp. 8PA3 (pLF-SL2) способствует развитию толерантности к этому гормону у нарождающегося молодняка.

Итак, полученные нами данные свидетельствуют о том, что ответная реакция животных при пероральном применении рекомбинантных штаммов идентична таковой при введении экзогенного соматотропина. На основе этого можно полагать, что при ежесуточном скармливании рекомбинантных штаммов в пищеварительном тракте кроликов образуется соматолиберин. Всасывание гормона в кровь приводит к стимуляции синтеза и секреции гипоталамических нонапептидов, которые в свою очередь увеличивают выработку соматотропина в аденогипофизе. В ответ на повышение концентрации в крови соматотропного гормона наблюдается интенсивная пролиферация клеток в органах и тканях, усиление синтеза белка в печени и мышцах, уменьшение диаметра адипоцитов в подкожной жировой ткани, увеличение митотической активности хондроцитов костной ткани. В результате стимуляции клеточной активности в различных органах и тканях до 30 % (в среднем 11-19 %) повышается прирост живой массы, увеличивается объем мышечной ткани, снижается содержание жира в мясе.

В органах иммунной системы кроликов, получавших препараты микроорганизмов, наблюдается усиление иммунопоэтической функции, во всех структурах лимфоидных органов -- тенденция к увеличению числа молодых форм лимфоцитов и митотических клеток. При этом стимулирующее действие рекомбинантных штаммов выражено сильнее, чем исходных пробиотических.

Введение в рацион крольчих в период беременности рекомбинантного штамма Lactobacillus sp. 8PA3 (pLF-SL2) сопровождается увеличением живой массы нарождающегося молодняка. В последующем эти животные лучше растут и развиваются и в ответ на пероральное введение штамма, продуцирующего соматолиберин, дают более высокие приросты живой массы, чем крольчата, полученные от матерей, которым препарат не скармливали. Эти данные позволяют предполагать, что образуемый рекомбинантным штаммом соматолиберин после всасывания в кровь проникает через плацентарный и гематоэнцефалический барьеры и оказывает специфическое действие на формирующиеся у эмбрионов гормональную и иммунную системы, обусловливая толерантность к этому гормону.

Таким образом, высокая зоотехническая эффективность применения рекомбинантных штаммов Lactobacillus acidophilus КЗ (pLF-SL2) и Lactobacillus sp. 8PA3 (pLF-SL2), экспрессирующих образование соматолиберина в пищеварительном тракте животных, в перспективе может быть реальной альтернативой использованию соматотропного гормона с целью повышения продуктивности животных и улучшения качества мяса.

ЛИТЕРАТУРА

Эрнст Л.К., Тореханов А.А. Молочная продуктивность и динамика метаболических процессов в организме коров при воздействии биосинтетическим соматотропином. С.-х. биол., 1995, 2: 73-76.

Тараканов Б.В. Механизмы действия пробиотиков на микрофлору пищеварительного тракта и организм животных. Ветеринария, 2000, 1: 47-54.

Физиология сельскохозяйственных животных /Под. ред. А.Н. Голикова и Г.В. Паршутина. М., 1980.

Mc Lean E., Ash R. The time course of appearance and net accumulation of horseradish peroxidase (HRP) presented orally to juvenile carp Сyprinus carpio (L). Соmр. Biochem. Physiol., 1986, 84A: 687-690.

Mc Lean E., Ash R. The time course of appearance and net accumulation of horseradish peroxidase (HRP) presented orally to rainbow trout Salmo gairdneri (Richardson). Соmр. Biochem. Physiol., 1987, 88A: 507-510.

Warshaw A.L., Walker W.A., Isselbacher K.J. Protein uptake by the intestine: evidence for absorption of intact macromolecules. Gastroenterology, 1974, 66: 987-992.

Heyman M., Crain - Denoyelle A.M., Corthier G. e.a. Postnatal development of protein absorption in conventional and germ-free mice. Am. J. Physiol., 1986, 251: 326-331.

Алешин В.В., Семенова Е.В., Тараканов Б.В. и др. Клонирование гена соматолиберина в молочнокислых бактериях и его экспрессия с промотора репликативных генов вектора. В сб.: Современные проблемы биотехнологии и биологии продуктивных животных. Боровск, 1999, 38: 116-129.

Карпуть И.М. Гематологический атлас сельскохозяйственных животных. Минск, 1986.

Кондрахин И.П., Курилов Н.В., Малахов А.Г. и др. Клиническая лабораторная диагностика в ветеринарии. Справочное издание. М., 1985.

Смирнова О.В., Кузьмина Т.В. Определение бактерицидной активности сыворотки крови методом фотонефелометрии. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол., 1966, 4: 8-11.

Разумов В.А. Массовый анализ кормов. М., 1982.

Schally A.V. e.a. Hypotalamic neurohormones regulating anterior pituitary function. Recent. Progr. Horm. Res., 1968, 24: 497-581.

Bernhad W. Differentiation of the cell nucleus. Leopoldino Symp. Cell Differentiation in Microorganisms, Plants and Animals, 1977: 579-597.

Размещено на Allbest.ru