Метод определения бета-литической активности крови крупного рогатого скота

Размещено на http://www.allbest.ru/

Метод определения бета-литической активности крови крупного рогатого скота

В.Я. Саруханов, Н.Н. Исамов, Н.В. Грудина, П.Г. Царин

Аннотация

Представлена модификация общепринятого метода для определения бета-литической активности крови у крупного рогатого скота посредством увеличения времени инкубации смеси плазмы крови с суспензией сенной палочки на растворе сахарозы. Оценивали преимущества модифицированной методики по сравнению с общепринятым методом.

DETERMINATION OF BETA-LYTIC ACTIVITY OF BLOOD IN CATTLE

V.Ya. Sarukhanov, N.N. Isamov, N.V. Grudina, P.G. Tsarin

S u m m a r y

The authors presented the modification of established procedure for determination of beta-lytic activity of blood in cattle by means of the increase of incubation time of mixture of blood plasma with suspension of grass bacillus in sucrose solution. The advantages of modified technique in comparison with established one were discussed. It was shown, that the increase of incubation time of mixture of blood plasma with suspension of grass bacillus in sucrose solution to 180 min. permit to increase a sensitivity of this method up to 50 %, that is caused by lysis of agglutinate.

Антиинфекционную защиту млекопитающих в значительной степени обеспечивает система факторов естественной резистентности, в функционировании которой определенную роль играют бактериолизины, действующие как на грампозитивную (лизоцим, бета-лизины), так и на грамнегативную (система комплемента) микрофлору. Если система комплемента изучена достаточно широко, то число работ, посвященных бета-лизинам, крайне ограничено (1-8). Считают, что у здоровых животных бета-лизины блокируются супрессорами и только в очаге воспаления при кислой реакции среды включаются в комплекс защиты (2). В связи с этим авторами метода, разработанного для определения бета-литической активности крови у человека, было предложено использовать в реакции 0,75 М раствор сахарозы с рН 6,2-6,4 (2, 3). При этом бета-литическая активность у лошадей доходила до 80 %, тогда как у жвачных едва достигала в норме 25 % (3, 6, 8-10). Это не позволяет в ряде случаев оценивать естественную резистентность животных.

Известно, что бета-литическая активность отражает физиологическое состояние животных и зависит от ряда факторов: сезона года, условий кормления и содержания (7, 8). Максимальная бета-литическая активность наблюдается в осенне-зимний, минимальная -- в весенне-летний периоды.

В связи с этим в задачу нашей работы входила модификация общепринятого метода для определения бета-литической активности крови у крупного рогатого скота в различные сезоны года.

Описание методики. Объектом исследования служили коровы черно-пестрой породы (n = 50), которые были разделены на пять групп (по 10 гол. в каждой) по принципу аналогов. В первом варианте опыта бета-литическую aктивность крови определяли посредством стабилизации кислотности среды фосфатным буфером с рН 6,2-6,4 (I группа). У животных II, III, IV и V групп (второй вариант опыта) проводили сравнительную оценку общепринятого (2, 3) и модифицированного нами метода по сезонам года -- соответственно летний, осенний, зимний и весенний периоды. Модификация метода (второй вариант опыта) заключалась в стабилизации кислотности среды фосфатным буфером с рН 6,2-6,4 и увеличении времени реакции до 150 и 180 мин (против 120 мин).

Кровь отбирали из яремной вены утром натощак, плазму получали центрифугированием крови при 3000 об/мин в течение 15 мин. Размеры конгломератов сенной палочки и бета-литическую aктивность крови оценивали в суспензии тест-культуры и смеси последней с плазмой крови методом висячей капли до и после инкубации в течение 120 и 180 мин (соответственно общепринятый и модифицированный методы).

Бета-литическая активность крови коров черно-пестрой породы в зависимости от времени инкубации смеси плазмы крови и суспензии тест-культуры (сенная палочка). кровь скот инкубация сахароза

В предварительных исследованиях было установлено, что рН смеси плазмы крови и культуры сенной палочки на растворе сахарозы составлял 7,2-7,4, то есть кислая реакция раствора сахарозы нейтрализовалась плазмой крови. Стабилизация смеси плазмы крови и суспензии сенной палочки фосфатным буфером с рН 6,2-6,4 приводила к тому, что бета-литическая aктивность крови при анализе проб варьировала от 20 до 100 % (I группа). Следовательно, модификация метода посредством стабилизации кислотности среды фосфатным буфером оказалась непригодной для определения бета-литической активности крови у крупного рогатого скота.

С целью повышения информативности показателей бета-литической активности крови мы изменили продолжительность инкубации смеси тест-культуры и плазмы крови с общепринятых 120 до 150, а затем 180 мин, что привело к повышению бета-литической активности крови у животных II группы (летний период) соответственно с 21,02,7 до 23,43,1 и 32,43,6 %. Следовательно, чувствительность метода повысилась при инкубации смеси в течение 150 и 180 мин соответственно на 10 и 50 % (рис.). У животных III группы (осенний период) при использовании общепринятого и модифицированного методов бета-литическая активность крови составляла соответственно 20,51,2 и 29,82,3 %. В зимний период (IV группа) бета-литическая активность крови достигала 37,62,9 %; после увеличения времени инкубации до 180 мин значения этого показaтеля возросли до 53,83,5 % (табл.). У животных V группы (весенний период) бета-литическая активность колебалась от 17 до 22 % (в среднем 17,72,2 %). Этот показатель возрастал до 27,42,7 % при использовании модифицированного метода, то есть чувствительность последнего повысилась на 50 %.

Чувствительность метода определения бета-литической активности крови крупного рогатого скота в зависимости от времени инкубации смеси плазмы крови и тест-культуры (сенная палочка) (%)

Морфологическую оценку конгломератов сенной палочки под влиянием бета-лизинов проводили до и после инкубации в течение 120 и 180 мин. В образцах суспензии сенной палочки и ее смеси с сывороткой крови без инкубации конгломераты имели округлую форму диаметром от 10 до 40 мкм (в среднем 2015 мкм). После инкубации в течение 120 мин наблюдалась агглютинация микроорганизмов. Агглютинат ха-рактеризовался аморфностью частиц размером 60-70Ѕ20-40 мкм. Инкубация в течение 180 мин сопровождалась уменьшением раз-мера конгломератов до 15Ѕ10 мкм, то есть при увеличении времени инкубации происходил лизис агглютината. При этом понижалась оптическая плотность исследуемых образцов, что сопровождалось повышением чувствительности метода.

Таким образом, нами установлено, что при использовании общепринятого метода определения бета-литической активности крови крупного рогатого скота рН смеси плазмы крови и раствора сахарозы составляет 7,2-7,4, а не 6,2-6,4, как описано в литературе (3). Использование фосфатного буфера с рН 6,2-6,4 приводит к варьированию показателей, то есть в этой модификации метод непригоден для применения. Увеличение времени инкубации смеси плазмы крови с суспензией сенной палочки на растворе сахарозы до 180 мин позволяет повысить чувствительность метода на 50 %, что связано с лизисом агглютината. Повышенная бета-литическая активность крови, обнаруженная в начале зимнего периода, вероятно, связана как с сезонными колебаниями этого фактора, так и с условиями содержания и кормления животных, особенно в стойловый период. Следует отметить, что этих животных содержали на концентратном типе рациона; молочная продуктивность коров превышала 5000 л/год. Высокая молочная продуктивность животных, как правило, сопровождается нарушением обмена веществ, что, вероятно, может приводить к повышению бета-литической активности крови. Дальнейшее изучение выявленных особенностей динамики бета-литической активности крови будет способствовать более глубокому выяснению механизмов, обеспечивающих естественную резистентность животных.

Литература

1. С и д о р о в В.Т., П л я щ е н к о С.И. Естественная резистентность организма сельскохозяйственных животных. Л., 1977.

2. Б а ш м а к о в Г.А. Факторы естественной резистентности и методы их изучения. Военно-медицинский журн., 1982, 6: 38-40.

3. Б у х а р и н О.В., В а с и л ь е в Н.В. Система бета-лизина и ее роль в клинической и экспериментальной медицине. Томск, 1977.

4. Б у х а р и н О.В., В а с и л ь е в Н.В. Лизоцим и его роль в биологии и медицине. Томск, 1974.

5. Н и к у л и н Д.М. Влияние озона на резистентность новорожденных телят. Ветеринария, 2003, 3: 40-42.

6. К у р и л о А.И. Каротиноиды Рlatimonas viridis как стимулятор резистентности облученных животных. Автореф. канд. дис. Л., 1986.

7. Х р а м о в Ю.В. Суточная динамика гуморальных факторов у коз при электрообезболивании. Докл. РАСХН, 1999, 3: 43-44.

8. Б р и т в и н а Г.И. Распространение бета-лизинов у животных. В сб.: Факторы естественного иммунитета /Под. ред. О.В. Бухарина. Оренбург, 1979: 13-16.

9. С а р у х а н о в В.Я., И с а м о в Н.Н., И с а м о в а Л.В. Хронические инфекции и естественная резистентность сельскохозяйственных животных, облученных в результате аварии на Чернобыльской АЭС. С.-х. биол., 2001, 6: 85-88.

10. С а р у х а н о в В.Я., И с а м о в Н.Н. Бета-литические свойства крови при действии ионизирующих излучений. С.-х. биол., 2005, 2: 116-118.

Размещено на Allbest.ru