Белково-пептидные составляющие биокерамического матрикса скорлупы инкубационных яиц кур под влиянием различных факторов среды

Размещено на http://www.allbest.ru/

Белково-пептидные составляющие биокерамического матрикса скорлупы инкубационных яиц кур под влиянием различных факторов среды

О.Г. Бордунова, В.И. Еременко, В.Д. Чиванов

Аннотация

Оценивали характер и степень влияния негативных факторов различного генезиса (ксенобиотики, токсиканты, патогенная микрофлора, неадекватные условия содержания и кормления) на структурированность биокерамического матрикса скорлупы куриных яиц. Определяли количественные и качественные показатели белково-пептидной органической составляющей биокерамического матрикса скорлупы инкубационных яиц кур различных пород и кроссов в норме и при патологии, а также характер взаимосвязи между структурой матрикса скорлупы и содержанием в последнем белково-пептидных компонентов.

Summary

Protein-peptide components of shell bioceramic matrix of hen incubatory eggs under the influence of different factors of environment

O.G. Bordunova, V.I. Eremenko, V.D. Chivanov

The authors estimated the character and the degree of effect of negative factors of different genesis (xenobiotic, toxicants, pathogenic microflora, no adequate conditions of keeping and feeding) on structuredness of shell bioceramic matrix of hen eggs. The authors determined also quantitative and qualitative parameters of protein-peptide organic component of shell bioceramic matrix of incubatory eggs in hens of different breeds and crosses in the norm and during the pathology, and also nature of interrelation between shell matrix structure and content of protein-peptide components. It was shown, that disturbance of structuredness of shell bioceramic matrix caused by the change of content of structure-forming protein-peptide components -- ovokleidin-17 and the set of middle- and low molecular peptides with mass from 455 to 881 a.u.m.

Проблема качества инкубационных яиц является весьма актуальной для племенного птицеводства начала XXI столетия. Интенсивная селекция на высокую яичную и мясную продуктивность, влияние негативных абиотических (ксенобиотики, токсиканты) и биотических (патогенная микрофлора) факторов окружающей среды, а также стрессовые нагрузки приводят к большим потерям продукции репродукторных хозяйств, в первую очередь вследствие ухудшения защитных свойств скорлупы и подскорлупных оболочек инкубационного яйца, что обусловливает нарушение метаболизма эмбрионов, повышенную летальность и снижение резистентности молодняка (1, 2). За последние годы благодаря успехам селекционеров яичная продуктивность кур возросла до 270-340 шт. в год, что явилось причиной нарушений процесса овогенеза и как следствие привело к значительному ухудшению качества скорлупы яиц (3).

Потери репродукторных хозяйств, обусловленные низким качеством скорлупы, составляют 13-15 % от суммарного количества племенных яиц. Учитывая возможную вторичную контаминацию инкубационных яиц патогенной микрофлорой из-за ухудшения качества скорлупы и нарушения защитных барьеров, потенциальные потери могут существенно возрастать, что особенно актуально для птицеводческих хозяйств стран СНГ, характеризующихся повышенным количеством патогенной микрофлоры в окружающей среде (4). Исходя из современных представлений о строении и качественном составе скорлупы яиц птицы, как о многослойной биокерамической структуре, прочность и эластичность которой определяются формой, составом и пространственным расположением неорганических и органических компонентов, исследование белков и пептидов, образующих органический каркас, является достаточно перспективным направлением, так как именно эти составляющие в основном и обусловливают такой важный для практического птицеводства интегральный показатель, как качество скорлупы (5, 6).

Поскольку доля белков и пептидов, входящих в состав биокерамического матрикса скорлупы яиц достигает не более 1-2 % от общей массы последнего, необходимы новые методические подходы, в частности использование методов масс-спектрометрии (7).

В связи с этим целью нашей работы было определение количественного и качественного состава белково-пептидных компонентов биокерамического матрикса скорлупы инкубационных яиц кур разных пород и кроссов и оценка взаимосвязи между этими показателями.

Методика. В работе использовали инкубационные яйца, полученные от кур кроссов Доминант бурый Д-102 (15 нед яйцекладки), Хайсекс браун, Ломанн браун и пород Беларусь-9, Леггорн белый, Русские белые (15-20 нед яйцекладки), условия содержания и кормления которых в контроле соответствовали рекомендациям ВНИИТИП (1998) и зоогигиеническим нормативам ОНТП (Россия); в опыте нормы кормления были такими же, как и в контроле, но изменялись факторы внешней среды (дефицит кальция, содержание микотоксинов и остатки тяжелых металлов (Cd) в кормах, температура воздуха, стрессовые нагрузки, болезнь Марека, инфекционный ларинготрахеит, болезнь Ньюкасла). Для исследований брали только свежеснесенные яйца (не позднее 1 сут).

Структуру скорлупы анализировали на сканирующем электронном микроскопе (РЭММА-102, фирма «SELMI», Сумы, Украина). Цифровые изображения биокерамического матрикса обрабатывали с помощью пакетов программ Photoshop 6,0 (8) и Visilog 6,110 «Noesis» (9). Белково-пептидные компоненты скорлупы выделяли по методу Hincke с соавт. в нашей модификации (10). Полученные твердофазные образцы исследовали плазменно-десорбционным масс-спектрометрическим методом (ПДМС) с ионизацией осколками ²⁵²Cf (MСБХ, «SELMI»), а жидкофазные -- посредством электрораспылительной (Electrospray) масс-спектрометрии (ESI-MS) («Mariner», США). Контролем при оценке количественных показателей белково-пептидных компонентов биокерамического матрикса служили яйца кур кросса Доминант бурый Д-102 (100 отн. ед.). Для статистической обработки данных использовали пакет программ Statistica for Windows 5.1. и Origin 6.0 (5-8-кратная повторность).

Результаты. В предыдущих работах нами было показано, что количество микродефектов скорлупы яиц зависит от следующих базовых факторов: содержание кальция и микотоксина Т в кормах; температура и влажность воздуха в помещении для содержания птицы; стрессовые нагрузки; инфекционные заболевания (болезнь Марека, инфекционный ларинготрахеит, болезнь Ньюкасла, сальмонеллез); остаточные количества ионов тяжелых металлов (и в первую очередь кадмия) в кормах (рис. 1) (11).

Для дальнейших масс-спектрометрических исследований скорлупу яиц распределяли на группы в соответствии с интегральным показателем качества биокерамического матрикса: хорошо структурированный (контроль); среднеструктури-рованный (нарушение оптимальных показателей температуры, влажности и действие стрессов при содержании птицы); недостаточно структурированный (дефицит кальция в рационе, заболевание кур болезнями Марека и Ньюкасла); неструктурированный (хаотический) (наличие микотоксина Т в кормах, инфекционный ларинготрахеит).

Рис. 1. Количество микродефектов биокерамического матрикса скорлупы яиц кур кросса Доминант бурый Д-102 под влиянием различных факторов внешней среды: I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX и X -- соответственно контроль (нормы содержания и кормления, установленные для птицы этого кросса), дефицит кальция, микотоксины, температура воздуха, влажность воздуха, стрессовые нагрузки, тяжелые металлы (Cd), болезнь Марека, инфекционный ларинготрахеит, болезнь Ньюкасла.

По данным масс-спектрометрического анализа белково-пептидных фракций, полученных с поверхности скорлупы, в норме состав и распределение компонентов отвечали приведенным на рисунке 2.

Рис. 2. Масс-спектры (ESI-MS) белково-пептидных составляющих биокерамического матрикса скорлупы яиц кур кросса Доминант бурый Д-102: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 и 13 -- молекулярная масса (а.е.м.) компонентов соответственно 441,4; 455,3; 481,0; 539,1; 547,4; 646,6; 803,7; 881,7; 1272,8 (пептид X); 1736,4 (овоклеидин-17); 2117,5 (овокаликсин-21); 2792,7 (пептид Y) и 3199,7 (овокаликсин-32).

Использование методов ПДМС и ESI-MS позволило выявить в кислотных экстрактах и твердофазных образцах из биокерамического матрикса яиц фракции среднемолекулярных пептидных, гликопептидных и липопротеидных составляющих массой 400-1000 а.е.м. (см. рис. 2). Зарегистрированы также пики квазимолекулярных ионов компонентов белков биокерамического матрикса скорлупы (1000-3200 а.е.м.), тесно связанных с формообразованием неорганической кальцитной компоненты, в состав которой входят овоклеидин-17, овокаликсин-21 и овокаликсин-32, а также неидентифицированные олигопептиды X (1272,8 а.е.м.) и Y (2792,7 а.е.м.). Кроме того, овоклеидин-17 образует межмолекулярные комплексы-кластеры с натрием и калием -- [М+Na]⁺ и [M+Na+K]⁺ (соответственно 1712 и 1740 а.е.м.).

Стандартной процедурой метода ПДМС является определение количества вещества в смеси, исходя из интенсивности пика иона, который соответствует молекулярной массе компонента. Используя этот подход, мы установили, что при нарушении структурированности биокерамического слоя скорлупы в последнем снижалось содержание овоклеидина-17 и овокаликсина-32 (Р < 0,05) (табл. 1). Содержание овокаликсина-21 и пептидов неопределенного состава (X и Y) было стабильным, независимо от степени структурированности биокерамического защитного слоя скорлупы.

Таблица 1. Интенсивность пиков ионов высокомолекулярных белково-пептидных составляющих биокерамического матрикса скорлупы яиц кур разных кроссов и пород (% от контроля)