Идентификация сортов, линий и мутантов гороха посевного с помощью RAPD-маркеров

посевного с помощью RAPD-маркеров

О.П. Дрибноходова, З.Г. Кокаева, С.А. Гостимский

IDENTIFICATION OF PEA CULTIVARS, LINES AND MUTANTS BY USE OF RAPD-MARKERS

O.P. Dribnokhodova, Z.G. Kokaeva, S.A. Gostimskii

Analysis of DNA polymorphism of 19 pea lines by using RAPD-markers was carried out. The level of genetic diversity of different pea lines was investigated. The data set for 19 lines including 134 binary characters was used to generate UPGMA and NJ-dendrograms suggesting genetic relationships among pea cultivars, lines and mutants. RAPD-markers that can be used for identification of pea cultivars were found. The opportunity of using RAPD-markers for the identification of different pea cultivars and for genetic mapping was discussed.

Проводили анализ ДНК-полиморфизма 19 форм гороха посевного (Pisum sativum L.) по 134 RAPD-маркерам. Определяли генетическое сходство, отражающее степень различий RAPD-спектров исследованных образцов. Рассчитывали генетические расстояния между линиями, сортами и мутантами гороха посевного. Оценивали эффективность RAPD-метода для паспортизации и идентификации линий и сортов растений.

В последние годы проблема идентификации видов и сортов растений становится все более актуальной в связи с ускорением селекционного процесса и появлением большого числа новых форм. Для создания нового сорта необходимы предварительная регистрация существующих генотипов, контроль за уровнем полиморфизма полученных при скрещивании партий семян и чистотой селектируемой линии. Экспресс-анализы сортопринадлежности образцов семян могут быть использованы для решения спорных вопросов в семеноводстве и для защиты прав оригинатора сорта (1, 2). Очевидно, что современная практика семеноводства нуждается в разработке быстрых и точных методов идентификации каждого сорта. Морфологические признаки не пригодны для быстрой проверки семян на сортовую принадлежность, так как требуют больших затрат времени и труда, особенно в случае необходимости разделения сортов, имеющих сходные фенотипы (3). Кроме того, при таком подходе трудно отличить генетические изменения от модификаций, вызванных влиянием окружающей среды (4).

В настоящее время для генотипирования все чаще используют ДНК-маркеры, причем наиболее часто -- RAPD- и SSR-маркеры (2, 5). Эти методы обладают высокой производительностью, получаемые с их помощью результаты не зависят от условий выращивания и стадии развития растений, продолжительности и условий хранения семян. С помощью RAPD-метода можно анализировать изучаемые формы одновременно по многим локусам, случайно распределенным по всему геному, что позволяет различать даже очень близкородственные сорта (6). Хотя многие авторы отмечают недостаточную надежность RAPD-метода, оптимизация условий и отбор стабильно амплифицирующихся ДНК-маркеров позволяют добиться воспроизведения данных, полученных в разных лабораториях, и поставить вопрос о разработке дешевых, быстрых и эффективных технологий паспортизации разных линий, сортов и гибридов гороха на основе RAPD-метода. За последние годы были проведены работы по изучению генетического полиморфизма различных культур: ячменя, кукурузы, подсолнечника, картофеля, хлопчатника, пшеницы и др. (1, 3, 4, 6-9).

В задачу нашей работы входила идентификация и паспортизация сортов, линий и мутантов гороха посевного с помощью RAPD-маркеров.

Методика. Мы использовали 19 линий, сортов и мутантов гороха посевного (Pisum sativum L.) из коллекции кафедры генетики биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Тотальную ДНК выделяли из молодых листьев с использованием модифицированного CTAB-изопропанольного метода (10). Для анализа было отобрано десять 10-членных RAPD-праймеров, эффективно выявляющих полиморфизм ДНК у растений гороха: Q20, AD04, B340, Pr10, B318, R03, B474, QR2, K10, V («Синтол», Москва). Амплификацию проводили в термоциклере «Терцик» («ДНК-технология», Москва) в следующем режиме: предварительная денатурация 2,5 мин при 94 оС; денатурация 30 с при 94 оС; отжиг 30 с при 40 оС; синтез 1,3 мин при 70,5 оС (всего 5 циклов); денатурация 20 с при 93 оС; отжиг 30 с при 37 оС; синтез 1 мин при 72 оС (всего 35 циклов); конечная элонгация 5 мин при 72 оС. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 2 е.а. Taq-полимеразы («Силекс М», Москва), 2,5 мкл стандартного 10-кратного буфера для ПЦР («Силекс М», Москва), 25 пкмоль праймера, 2,5 мМ MgCl2, 0,5 или 0,25 мМ дезоксинуклеозид-трифосфата. На смесь наслаивали две капли минерального масла.

Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1,7 % агарозном геле с использованием буфера ТВЕ и окрашивали бромистым этидием. Для определения длины фрагментов использовали маркеры молекулярной массы 100 bp + 1,5 Kb DNA Ladder и 1 Kb DNA Ladder («Сибэнзим», Новосибирск). После электрофореза гели анализировали в УФ-свете и фотографировали с использованием цифровой фотокамеры.

Для проверки воспроизводимости полученных результатов эксперименты проводили в нескольких повторностях с использованием двух концентраций MgCl2 (0,5 и 0,25 мМ) и разных партий полимеразы. В дальнейшей работе использовали только те фрагменты, о наличии или отсутствии которых в спектрах всех сортов можно было судить с достаточной степенью уверенности. Каждому полученному маркеру было дано название, состоящее из двух частей: первая часть соответствует праймеру, при амплификации с которым был обнаружен фрагмент, вторая -- отражает приблизительный размер фрагмента (п.н.).

Для количественной оценки полиморфизма и определения генетического расстояния между исследованными формами данные RAPD-анализа были представлены в виде матрицы, в которой наличие или отсутствие в RAPD-спектрах фрагментов одинаковой длины соответствовало значениям 1 или 0. На основе этой матрицы были составлены две матрицы различий, генетические расстояния (ГР) в которых рассчитывали по формуле

ГР =

сорт горох посевной маркер

Генетическое расстояние между сравниваемыми линиями определяли по формуле Nei с соавт. с помощью компьютерной программы Treecon (11, 12).

На основании полученной невзвешенным парно-групповым методом (Unweighted Pair-Group Method -- UPGMA) матрицы мы составили генеалогическую дендрограмму, отражающую степень различий между RAPD-спектрами исследуемых форм гороха (12). Дендрограмму строили по компьютерной программе Treecon с применением 100 реплик бутстрепа (12, 13). Матрица различий, полученная по формуле Nei с соавт., лучше отвечает известным данным о происхождении сортов и линий, что соответствует данным литературы (9).

Рис. 1. RAPD-спектры линий, мутантов и сортов гороха посевного, полученные при амплификации ДНК с праймером B474: 1 -- Флагман; 2 -- Филби; 3 -- Труженик; 4 -- Виола; 5 -- Виола (В); 6 -- Хл-1; 7 -- Хл-2; 8 -- Хл-15; 9 -- Хл-18; 10 -- Хл-42; 11 -- L-1238; 12 -- L-1132; 13 -- L-851; 14 -- L-111; 15 -- L-108; М -- маркер молекулярной массы 100 bp + 1,5 Kb DNA Ladder. Стрелками отмечены полиморфные фрагменты: а, б и в -- соответственно B474#730, B474#530 и B474#300

Результаты. Межлинейный и межсортовой полиморфизм оценивали у семи сортов, шести линий и шести мутантов гороха посевного с использованием десяти высокоэффективных RAPD-праймеров (рис. 1). При амплификации ДНК разных образцов гороха посевного отдельные праймеры выявляли от 9 до 19 фрагментов размером 230-2900 п.н., 7-14 из которых были полиморфными; всего получено 134 RAPD-маркера, 102 из которых были полиморфными среди изученных форм гороха (табл. 1).

Рис. 2. Генеалогическая дендрограмма, отражающая степень различий между RAPD-спектрами линий, сортов и мутантов гороха посевного (UPGMA-метод) (12): 0,1 и 0,2 -- генетическое расстояние, по Nei с соавт. (11).

Для количественной оценки полиморфизма и определения степени дивергенции между изученными формами данные, полученные при оценке RAPD-полиморфизма, были представлены в виде матрицы по 134 бинарным признакам, которую использовали для расчета генетических расстояний и построения дендрограммы (рис. 2). Степень различий между мутантами, полученными от одного сорта, составляла 1,5-14,9 %; от исходных форм -- Виола и Хл-42 -- они отличались соответственно на 0 и 20,9 %. Средний уровень полиморфизма между изученными формами составлял 25,6 %, что согласуется с ранее полученными данными (14).

Оценка полиморфизма ДНК у различных линий, сортов и мутантов гороха посевного (Pisum sativum L.) с помощью RAPD-маркеров

Матрица генотипов для тестирования линий, сортов и мутантов гороха посевного (Pisum sativum L.) с помощью RAPD-маркеров (фрагмент общей матрицы)

Специфические маркеры для тестирования различных образцов гороха посевного