Размещено на http://www.allbest.ru/

Скрининг вируса кустистой карликовости малины методом RT-PCR in vitro и в полевом материале

Е.В. Немцова, В.В. Заякин, И.В. Казаков, С.Н. евдокименко, И.Я. Нам

На основе RT-PCR (обратная транскрипция--полимеразная цепная реакция) разрабатывали доступную методику определения вируса кустистой карликовости малины (ВККМ) и с ее помощью изучали наличие ВККМ у сортов малины Геракл, Надежная, Брянская юбилейная, Калашник, Золотые купола и генотипов № 13-39-11, № 2-205-1А, № 3-72-2, № 1-220-1, № 16-136-6, № 8-79-2. Методика позволяет определять вирус в полевом материале (в тканях растений в разные периоды годового цикла развития) и in vitro (на этапах культивирования в пробирках и последующей акклиматизации). Вирус обнаружен во всех растениях с симптомами инфекции, в растениях без внешних признаков вирусного поражения, а также в сеянцах и клонах растений, размножаемых в культуре in vitro.

Ключевые слова: малина, вирус кустистой карликовости малины (ВККМ), RT-PCR.

Summary

Screening of raspberry bushy stunt virus by the RT-PCR method in vitro and in the field material

E.V. Nemtsova, V.V. Zayakin, I.V. Kazakov, I.Ya. Nam, S.N. Evdokimenko

On the basis of RT-PCR (reverse transcription--polymerase chain reaction) the authors developed available method for determination of raspberry bushy stunt virus (RBSV) and tested by this method RBSV in raspberry of the Heracles, Nadezhnaya, Bryanskaya Yubileinaya, Kalashnik and Zolotye Kupola raspberry varieties and № 13-39-11, № 2-205-1А, № 3-72-2, № 1-220-1, № 16-136-6, № 8-79-2 genotypes. This method permits to reveal the virus in field material (in plant tissues at the various periods of year development cycle) and in vitro (on cultivation stages in test-tube and subsequent acclimatization). The virus was detected in all plants with infection symptoms, in plants without external manifestation of infection and also in seedlings and plant clones reproducing in the culture in vitro.

В мире описано около 30 вирусных болезней малины, снижающих ее урожайность, продуктивность и ухудшающих качество посадочного материала (1). Вирус кустистой карликовости малины (ВККМ) в настоящее время -- наиболее распространенный и трудноконтролируемый патоген малины и ежевики (2). Он выявлен практически по всему ареалу рода Rubus: в Восточной и Западной Европе (3, 4), Скандинавии (5), Северной и Южной Америке (2, 6), Австралии (7), Новой Зеландии (8), Южной Африке (9). Поражая различные сорта малины, ВККМ приводит к возникновению хлорозов, некрозов, появлению деформированных и «рассыпчатых» плодов, снижению продуктивности растений. При инфекции число костянок в ягодах снижается до 10-12, в то время как в норме доходит до 60 шт. (10). Даже при бессимптомном протекании инфекции снижение урожайности может достигать 50 % (11). В естественных условиях вирус передается с пыльцой и при семенном размножении. До 77 % сеянцев, полученных из семян инфицированной красной малины, поражены ВККМ (11). Это затрудняет контроль за его распространением в селекционных питомниках и на производственных плантациях. Для производства оздоровленного посадочного материала и селекции малины на устойчивость к ВККМ необходима достаточно чувствительная методика скрининга вируса в растениях.

За рубежом скрининг ВККМ на плантациях малины (2) и ежевики (10) проводится регулярно, обычно с использованием иммуноферментного метода (12, 13). В последнее десятилетие в связи с появлением нового изолята вируса ВККМ -- RB (resistance breaking), поражающего все ранее устойчивые к обычному S-изоляту сорта, и обострением проблемы контроля за распространением патогена разработана методика обнаружения ВККМ на основе метода IC-RT-PCR (Immunocapture Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction). Она сочетает обратную транскрипцию--полимеразную цепную реакцию (RT-PCR) и иммуносорбцию (IC) вируса с использованием антител (14). Методика позволяет обнаруживать вирус в растениях независимо от проявления симптомов.

Проведенное в 1992-1996 годах обследование селекционных посадок малины на Кокинском опорном пункте (Брянская обл.) Всероссийского селекционно-технологического института садоводства и питомниководства (ВСТИСП) выявило присутствие возбудителей некоторых опасных вирусных заболеваний -- мозаики резухи, скрытой кольцевой пятнистости земляники, черной кольчатости томата, кольцевой пятнистости малины (доля пораженных растений от 11 до 44,9 %) (15). Однако результаты выполненного обследования не содержат сведений о наличии и распространении ВККМ. В России не разработаны отечественные методы анализа ВККМ, а зарубежные коммерческие тест-наборы для его индикации недоступны. В то же время в зарубежной литературе упоминается об обнаружении ВККМ в образцах из России (11), но информация о распространении вируса и характеристика местных изолятов не представлена.

В связи с этим нашей целью была разработка методики RT-PCR, пригодной для идентификации ВККМ у разных сортов малины в образцах in vitro и полевом материале.

Методика. Образцами для исследования служили растения на разных этапах микроклонального размножения, а также деформированные плоды и листья ремонтантной малины (сорта Геракл, Надежная, Брянская юбилейная, Калашник, Золотые купола и генотипы № 13-39-11, № 2-205-1А, № 3-72-2, № 1-220-1, № 16-136-6, № 8-79-2 селекции академика И.В. Казакова), выращенные на Кокинском опорном пункте ВСТИСП.

Нуклеиновые кислоты выделяли гуанидин-изотиоцианатным (16) или горячим фенольным (17) методом. Для подбора праймеров с помощью программ Vector NT, Oligo анализировали последовательности РНК-2 для разных изолятов ВККМ и родственных групп вирусов, имеющиеся в международных банках генов. Использовались праймеры, синтезированные фирмой «Syntol» (Россия), в RT-PCR -- ферменты и реактивы фирмы «Силекс» (Россия), на стадии обратной транскрипции -- ревертаза M-MLV с обратным праймером или гексануклеотидными случайными праймерами по прописи, предлагаемой фирмой, с незначительными изменениями. Отжиг со специфическими обратными праймерами выполняли при температуре 50 °С в течение 10 мин, со случайными гексапраймерами -- при 25 °С в течение 10 мин, обратную транскрипцию -- при 37 °С 1,5 ч. На стадии PCR реакцию проводили в амплификаторе фирмы «Биоком» (Россия) с Taq-полимеразой в следующем режиме: предварительная денатурация -- 94 °С, 3 мин; денатурация -- 94 °С, 1 мин, отжиг -- 50 °С, 1 мин, элонгация -- 72 °С, 1 мин (30 циклов); заключительная элонгация -- 72 °С, 3 мин. Продукты PCR наносили на 1,5 % агарозный гель, содержащий бромистый этидий, и визуализировали на UV-трансиллюминаторе. В качестве маркера молекулярной массы использовали pUC-19/MspI.

Результаты. По данным анализа нуклеотидных последовательностей вирусной РНК-2 для обеспечения видоспецифичности индикации были выбраны три пары праймеров так, чтобы происходила амплификация последовательности гена белка оболочки любого известного изолята ВККМ, но не родственных групп вирусов (Ilarviridae). При использовании одной из пар праймеров амплификация не происходила, вероятно, из-за особенностей вторичной структуры вирусной РНК или последовательности нуклеотидов местного изолята вируса. Последовательность, ограниченная праймерами +2 и -2, имела расчетную длину 706 п.н. и содержала последовательность с расчетной длиной 383 п.н., амплифицируемую с помощью праймеров +3 и -3. Такое расположение праймеров позволяло выполнить контрольные эксперименты, подтверждающие специфичность анализа ВККМ.

При обратной транскрипции с праймером -2 синтезировались длинные цепи кДНК, на которых в дальнейшем всегда наблюдалась амплификация не только фрагмента размером 706 п.н. (праймеры +2 и -2), но и синтез более короткого участка 383 п.н. с праймерами +3 и -3 (рис. 1, треки 5 и 9). При обратной комбинации (праймер -3 служил для синтеза кДНК, а праймеры, фланкирующие более длинный участок, -- для полимеразной цепной реакции) амплификации вирусспецифических фрагментов не происходило (см. рис. 1, трек 14). Если же на стадии PCR использовали тот же праймер -3 в сочетании с праймером +3, амплифицировался более короткий фрагмент (см. рис. 1, треки 4, 8), причем эффективнее.

Рис. 1. Электрофореграмма продуктов амплификации (RT-PCR) при индикации вируса кустистой карликовости малины у генотипа № 2-205-1А в разные периоды сезонного цикла развития растений: 1 и 15 -- маркер молекулярных масс pUC-19/MspI; 2 и 3 -- распускающиеся почки (праймеры +2 и -2); 4 и 5 -- распускающиеся почки (праймеры +3 и -3); 6 и 7 -- листья и ягоды (полевой материал, праймеры +2 и -2); 8 и 9 -- листья и ягоды (полевой материал, праймеры +3 и -3); 10 и 11 -- зимние покоящиеся почки (праймеры +2 и -2); 12 и 13 -- зимние покоящиеся почки (праймеры +3 и -3); 14 -- отрицательный контроль (обратная транскрипция с праймером -3, PCR с праймерами +2 и -2). Треки 4, 8, 12 и 14 -- для обратной транскрипции использовали праймер -3, в остальных случаях -- праймер -2.

Дополнительными контролями на специфичность можно также считать эксперименты с PCR без стадии обратной транскрипции, то есть на матрице ДНК малины, которая всегда присутствует в образцах выделенной РНК. Такие контроли ставились многократно, но ни разу не дали положительного результата (рис. 2, трек 12). При выделении РНК из растений, не поражающихся ВККМ, например люпина или ячменя, специфические ампликоны не выявлялись даже в варианте с обратной транскрипцией по стандартной методике.

Все приведенные выше данные свидетельствуют о вирусспецифичности амплифицированных фрагментов, а их наличие в реакционной смеси -- о присутствии ВККМ в растительных пробах.

Важной характеристикой аналитической методики является возможность определения вируса в разных тканях и в зависимости от физиологического состояния растения, фазы онтогенеза, сезонных изменений. При этом результаты будут зависеть прежде всего от концентрации вируса, легкости выделения РНК из тканей и наличия примесей, мешающих проведению анализа. Наши данные показывают (см. рис. 1), что вирус определяется в листьях и ягодах малины в течение периода вегетации, не поддается определению в покоящихся почках в зимнее время (треки 10-13) и снова детектируется вскоре после начала пробуждения почек (треки 2-5). Наиболее интенсивно амплификация вирусспецифических фрагментов происходила при использовании РНК, выделенной из листьев цветущих растений ремонтантной малины в период с августа по октябрь (треки 6-9).

По данным зарубежных исследователей, оздоровление малины от ВККМ с помощью культивирования меристем in vitro неэффективно -- вирус сохраняется даже при выделении меристем размером 0,2-0,5 мм (18). Неинфицированными оказываются только некоторые клоны. Выделение меристем размером 0,1-0,2 мм, из которых в дальнейшем развиваются свободные от ВККМ растения, проблематично из-за плохой приживаемости эксплантов (19). В связи с этим особенно важно располагать способами контроля инфицированности растений в культуре in vitro.

По данным электрофореза продуктов амплификации, полученных для ряда образцов малины (культивируемых в пробирках in vitro, а также перенесенных затем в песчаный или почвенный субстрат для акклиматизации), ВККМ не обнаруживался только в растениях формы № 16-136-6 (см. рис. 2, треки 5 и 9). Остальные образцы были заражены вирусом (сорта Геракл, Брянская юбилейная, формы № 2-205-1А, № 3-72-2, № 8-79-2, № 1-220-1). Вирус определялся как в пробирочных растениях, так и в растениях, адаптированных к песчаному субстрату, но во втором варианте определение давало более надежные результаты, поскольку амплифицированные фрагменты накапливались в большем количестве, а в образце № 1-220-1 вирус выявлялся только после переноса растений в песок (см. рис 2, трек 6).

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации (RT-PCR) при индикации вируса кустистой карликовости малины в образцах ремонтантной малины, размножаемых микроклонально: 1 и 13 -- маркер молекулярных масс pUC-19/MspI; 2, 3, 4 и 5 -- соответственно формы № 1-220-1, № 3-72-2, № 8-79-2 и № 16-136-6 (in vitro); 6, 7, 8 и 9 -- соответственно формы № 1-220-1, № 3-72-2, № 8-79-2 и № 16-136-6 (акклиматизация в песке); 10 -- сорт Геракл (№ 50-253-1) (in vitro); 11 -- форма № 2-205-1А (in vitro); 12 -- отрицательный контроль (PCR на ДНК растений малины формы № 2-205-1А без обратной транскрипции). Во всех случаях использовали праймеры +3 и -3.

Анализ полевых растений ремонтантной малины сортов Геракл, Надежная, Брянская юбилейная, Золотые купола, Калашник и генотипов № 2-205-1А, № 13-39-11 показал, что независимо от степени выраженности симптомов поражения вирусом все изученные формы в той или иной степени инфицированы ВККМ. Вирус всегда обнаруживался у плодоносящих растений с признаками инфекции («рассыпчатость» плода, хлорозы). При RT-PCR-анализе растений формы № 8-79-2 также идентифицировали вирусспецифические продукты амплификации, хотя в полевых условиях признаков поражения ВККМ и снижения продуктивности растений этого образца не наблюдали.

При проверке сеянцев малины, не достигших цветения, на наличие вируса оказалось, что вирусспецифичекие ампликоны синтезировались в одном случае из 10, что подтверждает предположение о возможности передачи ВККМ с семенами (11).

Таким образом, нами предложена методика идентификации вируса кустистой карликовости малины в полевом растительном материале и в культуре in vitro, что имеет значение для изучения распространенности вируса в посадках малины, позволяет осуществлять отбор неинфицированных растений, организовать производство здорового посадочного материала и планировать проведение целенаправленной селекции ремонтантной малины на устойчивость к вирусу.

вирус малина полимеразный

Литература

1. Jones A.T., McGavin W.J., Watkins C.A. Recent studies in Scotland on the aetiology of virus and virus-like diseases of small fruit crops. Acta Horticulturae, 1992, 308: 31-36.

2. Martin R.R. Raspberry viruses in Oregon, Washington and British Columbia. Acta Horticulturae, 1999, 505: 259-262.

3. Barbara D. J., Mortona A., Ramcharana S. e.a. Occurrence and distribution of Raspberry Bushy Dwarf Virus in commercial Rubus plantations in England and Wales. Plant Pathology, 2001, 50(6): 747-749.

4. Љpak J., Kubelkova D. Epidemiology of Raspberry Bushy Dwarf Virus in the Czech Republic. J. Phytopathol., 2000, l48(6): 371-377.

5. Kokko H., Lemmetty A., Haimi P. e.a. S. New host for Raspberry Bushy Dwarf Virus: Arctic bramble (Rubus arcticus). Europ. J. Plant Pathol., 1996, 102(7): 713-717.

6. Auger J., Converse R.H. Raspberry Bushy Dwarf and Tomato Ringspot Viruses in Chilean red raspberries. Acta Horticulturae, 1982, 129: 9-10.

7. Guy G.L., Sampson P.Y., McGechan J. e.a. Occurrence of viruses in Rubus cultivars and species in Australia. Acta Horticulturae, 1982, 129: 31-40.

8. Wood G.A. Further investigations of Raspberry Bushy Dwarf Virus in New Zealand. New Zealand J. Crop Horticult. Sci., 1995, 23: 273-281.

9. Kooyman P., Engelbrecht D.J., Kasdorf G.F. Isolation of Raspberry Bushy Dwarf Virus from youngberry in South Africa. Acta Horticulturae, 1982, 129: 59-62.

10. Strik B., Martin R.R. Impact of Raspberry Bushy Dwarf Virus on «Marion» blackberry. Plant Disease, 2003, 87(3): 294-296.

11. Jones A.T., Mayo M.A., Murant A.F. Raspberry Bushy Dwarf idaeovirus. In: The plant viruses: Polyhedral virions and bipartite genomes. V. 5 /B.D. Harrison, A.F. Murant (eds.). N.Y., 1996: 283-301.

12. Theiler-Hedtrich R., Baumann G. Elimination of Apple Mosaic Virus and Raspberry Bushy Dwarf Virus from infected red raspberry (Rubus idaeus L.) by tissue culture. J. Phytopathol., 1989, 127(3): 193-199.

13. Baumann G., Theiler-Hedtrich R., C a s p e r R. Detection of sap-transmissible viruses by ELISA in tissue-propagated plants of red raspberry during in vitro culture. J. Phytopathol., 1988, 122: 372-375.

14. Kokko H.I., Kivineva M., Karenlampi S.O. Single-step immunocapture RT-PCR in the detection of Raspberry Bushy Dwarf Virus. Biotechniques, 1996, 20(5): 842-846.

15. Приходько Ю.Н. О видовом составе и распространенности вирусов малины в европейской части России. Плодоводство и ягодоводство России, 1997, IV: 97-101.

16. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by аcid guanidine thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem., 1987, 162: 156-159.

17. Дрейпер Дж., Скотт Р. Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений. В кн.: Генная инженерия растений: лабораторное руководство /Под ред. Дж. Дрейпера. М., 1991: 236-276.

18. Kudell A.R., Buchenauer H. Elimination of Raspberry Bushy Dwarf Virus from axillary bud cultures of red raspberry cv. Lloyd George by antiviral compounds. J. Phytopathol., 1989, 124: 332- 336.

19. Lankes C. Elimination of Raspberry Bushy Dwarf Virus. Acta Horticulturae, 1995, 385: 70-75.

Размещено на Allbest.ru