Морфология органов пищеварения и микрофлора кишечника цыплят при заражении Escherichia coli

Размещено на http://www.allbest.ru/

Морфология органов пищеварения и микрофлора кишечника цыплят при заражении Escherichia coli

Е.М. Ленченко, Н.Н. Ванина

Рассматривается влияние патогенных штаммов Escherichia coli на морфологические признаки органов пищеварения, а также состав и численность микрофлоры кишечника цыплят.

Summary

Functional morphology and microflora in chicken intestine after infection by Escherichia coli

E.M. Lenchenko, N.N. Vanina

The authors estimate the effect of pathogenic strains of Escherichia coli on morphology of digestion organs and also on composition and number of microflora in chicken intestine. It was shown, that experimental infection of chicken by E. coli result in qualitative and quantitative changes of intestine microflora which are typical for dysbacteriosis (an increase in the number of bacteria with low lactase activity or hemolytic properties and a decrease in the number of lactose positive bacteria among the strains of E. coli and Bifidobacterium ).

Высокая заболеваемость и падеж молодняка птицы связаны с расстройством деятельности органов пищеварения. Из числа бактериальных агентов в этиологии заболеваний желудочно-кишечного тракта существенную роль играют патогенные штаммы Escherichia coli (сем. Enterobacteriaceae) (1-3). Поэтому представляет интерес исследование влияния бактерий E. coli на морфологию органов пищеварения, а также количественный и качественный состав микрофлоры кишечника цыплят, что и явилось целью нашей работы.

Методика. Объектом исследования служили 30-суточные цыплята кросса Иза-Ведетта, подобранные по принципу аналогов (n = 25). В опыте цыплят заражали (интраназальная инокуляция) 18-часовой культурой E. coli 1111 (О149:К91:К88) в дозе 510⁹ бактериальных клеток; в контроле птице вводили стерильную водопроводную воду. По ходу эксперимента проводили клинико-гематологические исследования. До заражения и через 5, 10, 15 и 20 сут после заражения из каждой группы убивали по 5 гол., проводили патолого-анатомический анализ и отбирали образцы тонких и толстых кишок, печени, фабрициевой бурсы для гистологического и гистохимического исследований. Для оценки морфологических особенностей, строения соединительной, мышечной ткани, наличия волокон фибрина, микроорганизмов и содержания жира срезы окрашивали соответственно гематоксилин-эозином, по Ван Гизону, Маллори, Шуенинову, Крантцу и суданом 3; активность щелочной фосфатазы определяли по Гомори. При подготовке препаратов для электронной микроскопии перед фиксацией образцы промывали солевым раствором (рН 7,2-7,4). Фиксацию проводили теплым 1-3 % раствором глутарового альдегида в течение 72-96 ч; обезвоживание -- в спиртах возрастающей крепости. Для оценки численности микрофлоры кишечника осуществляли дозированный посев из диагностически значимых разведений 1 г feces. При выделении бифидобактерий использовали модифицированную среду Blaurock, бактерий E. coli -- среды Эндо, Левина, Плоскирева и кровяной агар. Для дифференциации эшерихий от сходных с ними энтеробактерий применяли комплекс ТИМАЦ: Т -- температурный тест (тест Эйкмана); И -- тест индолообразования; М -- реакция с метиловым красным, А -- реакция на ацетилметилкарбинол; Ц -- цитратный тест. Статистическую обработку полученных данных проводили общепринятыми методами (4).

Результаты. У цыплят, зараженных культурой E. coli, клинические признаки заболевания были отмечены через 3-5 сут в виде прогрессирующей депрессии, отсутствия аппетита, жажды, цианоза слизистых оболочек; в последующие сутки развивались признаки диареи. У зараженных цыплят температура тела поднималась до 43,1 ^оС, у ослабевших в последние сутки особей -- опускалась ниже нормы. По данным гематологических исследований, у зараженных цыплят увеличивалось количество эритроцитов, лейкоцитов (эозинофилов, псевдоэозинофилов, лимфоцитов и моноцитов) и концентрация гемоглобина в крови по сравнению с контролем (табл.).

Таблица 1 Гематологические показатели цыплят-бройлеров кросса Иза-Ведетта при экспериментальном заражении культурой Escherichia coli (n = 25)

При патолого-анатомическом исследовании цыплят-бройлеров изменения оценивали по 4-балльной шкале: 0 баллов -- нарушений нет; 1 балл -- острый катаральный энтерит; 2 балла -- острый катаральный энтерит, серозно-фибринозный аэросаккулит, гиперплазия селезенки; 3 балла -- острый катаральный энтерит, серозно-фибринозный перигепатит, атрофия фабрициевой бурсы, серозно-фибринозный аэросаккулит; 4 балла -- геморрагический энтерит, серозно-фибринозный перигепатит, атрофия фабрициевой бурсы, серозно-фибринозный аэросаккулит, серозно-фибринозный перитонит. В течение и конце опыта у погибших или убитых цыплят выявлены патолого-анатомические изменения с оценкой 1, 2, 3 и 4 балла -- соответственно 4, 56, 28 и 12 %.

При гистологическом анализе органов пищеварения цыплят наблюдались частичная десквамация покровного эпителия ворсинок слизистой оболочки тонкой кишки, а также увеличение количества бокаловидных клеток, переполненных светло-розовым секретом. К концу эксперимента каемчатые эпителиоциты ворсинок слизистой оболочки тонкой кишки (особенно в апикальной части) находились в состоянии слизистой дистрофии, некроза и отторжения; на поверхности слизистой оболочки встречались волокна фибрина. При окраске по Крантцу в собственной пластинке слизистой оболочки тонкой кишки обнаружены бактерии; в подслизистом слое слизистой оболочки наблюдались отек и кровенаполнение кровеносных сосудов; в слизистой, мышечной и серозной оболочках -- инфильтрация лимфоцитами, гистиоцитами и псевдоэозинофилами соединительной ткани. В опыте активность щелочной фосфатазы эпителиоцитов ворсинок слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки цыплят снижалась в 1,5 раза по сравнению с контролем.

При электронно-микроскопическом исследовании тонкой кишки зараженных цыплят обнаружены объемные ворсинки конусовидной формы, ширина которых в основании была в 1,5-2,5 раза больше, чем в апикальной части. При более сильном увеличении микроскопа на складках ворсинок выявлялись четкие границы эпителиоцитов, имеющих полигональную форму, в большинстве случаев на апикальной поверхности эпителиоцитов наблюдался гликокаликс. Апикальные поверхности бокаловидных энтероцитов имели вид небольших щелей правильной округлой формы. Целостность эпителиального слоя ворсинок была нарушена, в этих участках располагались палочковидные бактерии и гетероморфные бактерии L-формы.

Для эпителиального слоя слизистой оболочки толстой и слепой кишок были характерны следующие нарушения: слизистая дистрофия, некробиоз и частичная десквамация эпителия; вследствие слизистой дистрофии и увеличения числа бокаловидных клеток просвет крипт был сужен. В подслизистом слое слизистой оболочки слепых отростков наблюдалось разволокнение коллагеновых волокон, а также инфильтрация клеточных элементов в рыхлую соединительную ткань. Лимфатические фолликулы слизистой оболочки толстой кишки имели нечеткие границы и оказались увеличенными; количество лимфоцитов в центре фолликулов было ниже нормы.

В целом следует отметить, что при патолого-анатомических нарушениях в 4 балла у цыплят наблюдалась гиперемия всех слоев слизистой оболочки тонкой и толстой кишок. Во всех отделах пищеварительного тракта выявлена множественная бактериальная эмболия сосудов серозной оболочки.

У цыплят в опыте на поверхности печени располагались волокнистые эозинофильные массы фибрина, между волокнами последнего -- псевдоэозинофильные лейкоциты и колонии бактерий. Капсула печени и междольковая соединительная ткань были инфильтрированы псевдоэозинофильными и лимфоидными клетками; в балочной структуре долек печени произошла дискомплексация. На отдельных участках выявлены гранулемы с клеточным детритом по центру (преимущественно из псевдоэозинофилов), к которым непосредственно примыкали многоядерные гигантские клетки. Отмечены участки, состоящие из распавшихся гепатоцитов и псевдоэозинофилов. Вследствие переполнения кровью центральной вены и капилляров размер некоторых гепатоцитов уменьшался и они находились в состоянии атрофии; некоторые гепатоциты были увеличены и характеризовались белковой и жировой дистрофией. В мелкозернистой цитоплазме содержались капли белкового и жирового происхождения; ядра имели нечеткий контур и располагались ацентрично (рис. 1, а).

а б

Рис. 1 Клетки печени (а) и лимфатического фолликула фабрициевой бурсы (б) цыплят-бройлеров кросса Иза-Ведетта, зараженных культурой Escherichia coli 1111 (О149:К91:К88) в дозе 510⁹ бактериальных клеток: а и б -- соответственно 5-е и 10-е сут эксперимента (окраска гематоксилином и эозином).

Активность щелочной фосфатазы в печени снижалась от центра к периферии долек по ходу желчных капилляров (в 1,5 раза), что свидетельствует о нарушении обмена веществ. Отмечено набухание многорядного призматического эпителия складок фабрициевой бурсы; в некоторых клетках встречались мелкие вакуоли; строма бурсы находилась в состоянии отека. Корковое вещество фолликулов было истончено, выявлялись просветленные участки; в мозговом веществе лимфатических фоллликулов зарегистрированы очаги деструкции и лизиса лимфоцитов с явлениями кариопикноза и кариорексиса. Клетки в таких очагах находились на различных стадиях разрушения и имели вид неравномерно окрашенной бесструктурной массы, в центре которой при окраске по Крантцу обнаружены колонии микроорганизмов. К концу эксперимента в лимфатических фолликулах было отчетливо видно разграничение на корковое и мозговое вещество, причем разреженное расположение клеток сохранялось в обоих зонах. Кровенаполнение сосудов было хорошим, стенки некоторых из них имели утолщения. В строме органа отмечено скопление плазматических клеток, корковое вещество имело темную окраску. При большом увеличении микроскопа в корковом веществе лимфатических фолликулов фабрициевой бурсы обнаруживались близкорасположенные лимфоциты, у которых объем ядра был больше, чем цитоплазмы, а мозговое вещество -- более светлой окраски. Клетки, располагающиеся в этой зоне, имели бобовидные ядра и широкий ободок цитоплазмы (рис. 1, б).

Таким образом, патоморфологические изменения органов пищеварения цыплят, зараженных штаммом E. coli, обусловлены подострой септикотоксемией. При наличии бактериальной эмболии и нарушения кровообращения в органах характерными изменениями являются геморрагический энтерит, серозно-фибринозный перигепатит, атрофия фабрициевой бурсы, серозно-фибринозный аэросаккулит, серозно-фибринозный перитонит.

При бактериологическом анализе для выделения анаэробных бифидобактерий производили посевы исследуемого материала в разведениях от 10-⁴ до 10-¹¹, так как при невысоких разведениях могут вырастать микроорганизмы других видов (чаще E. coli). К роду Bifidobacterium относили микроорганизмы, колонии которых имели вид «комет», «гвоздиков» или «крошек». При микроскопическом анализе нами были выявлены грамположительные палочки, разветвленные на утолщенных концах в виде римской цифры V. Бифидобактерии не разжижали каллоид желатины, не выделяли CO₂ и H₂S, не восстанавливали нитраты. Титр бифидобактерий в содержимом тонкой кишки цыплят через 5 и 10 сут после заражения составлял соответственно 10-⁶ и 10-⁵ , в контроле -- 10-⁷.

При идентификации E. coli учитывали, что в мазках из первичного материала бактерии располагаются одиночно и попарно, окрашиваются по Граму отрицательно, спор и капсул не образуют, на МПА формируют выпуклые колонии S-формы (блестящие, прозрачные, круглой формы с ровными краями). В нашем эксперименте бактерии E. coli росли на МПБ диффузно с образованием аморфного осадка серо-белой окраски, легко разбивающегося при встряхивании; на средах Эндо, Левина и Плоскирева -- образовывали колонии соответственно темно-вишневой (с металлическим оттенком), темно-фиолетовой (приподнятые в центре) и розовато-сиреневой окраски.

Штаммы E. coli обладали следующими свойствами: ферментировали глюкозу, маннит, арабинозу, сорбит и ксилозу; выделяли индол; утилизировали ацетат; давали положительную реакцию с метиловым красным; синтезировали лизиндекарбоксилазу; не ферментировали инозит и адонит; не образовывали H₂S; не утилизировали цитрат и малонат; не синтезировали фенилаланиндезаминазу, уреазу и желатиназу; давали отрицательную реакцию Фогеса-Проскауэра. Выделенные штаммы E. coli оказались чувствительными к эритромицину, полимиксину, мономицину, стрептомицину, неомицину, канамицину, ампициллину, карбенициллину, устойчивыми к тетрациклину, олеандомицину, оксациллину.

Количество бактерий группы кишечной палочки в 1 г содержимого тонкой кишки определяли по числу колоний, выросших на соответствующей питательной среде с пересчетом на количество посеянного материала и степень его разведения. Так, через 5, 10, 15 и 20 сут после заражения содержание бактерий Escherichia в кишечнике цыплят составляло соответственно 8,950,17; 8,770,23; 8,450,56 и 8,270,63 lg/г, тогда как в контроле -- 8,050,45 lg/г.

При оценке свойств E. coli отмечены различия между культурами микроорганизмов, выделенных из feces в опыте и контроле. Так, доля лактозопозитивных негемолитических бактерий составляла в опыте и контроле соответственно 9,7-11,5 и 79,8-92,7 %. При этом в опыте возрастала доля бактерий E. coli, имеющих низкую лактазную активность и обладающих гемолитическими свойствами, -- соответственно 14,7-32,3 и 7,2-31,5 %; в контроле эти показатели составляли соответственно 1,7-4,6 и 0-1,1 % от общего числа выделенных бактерий этого вида.

Итак, при экспериментальном заражении цыплят бактериями E. coli происходят количественные и качественные изменения микрофлоры кишечника, характерные для дисбактериоза. В частности, наблюдается увеличение численности бактерий, имеющих низкую лактазную активность или обладающих гемолитическими свойствами. В то же время уменьшается количество лактозопозитивных бактерий E. coli и микроорганизмов рода Bifidobacterium, одной из ведущих функций которых является обеспечение колонизационной резистентности (предотвращение заселения кишечника условно-патогенными и патогенными микроорганизмами). В комплексе лечебных средств большое значение приобретает метод бактериотерапии -- применение препаратов из живых микроорганизмов, являющихся представителями нормальной кишечной микрофлоры и получивших название пробиотики. Следует отметить, что к настоящему времени разработаны концепция применения пробиотиков и схемы их применения в зависимости от физиологического периода и возраста особей (4-6).

патогенный микрофлора кишечник пищеварение

Литература

Стрельников А.П. Патоморфология и иммуноморфологические реакции у кур при инфекционном бронхите, оспе, колибактериозе и пастереллезе. Автореф. докт. дис. М., 1983.

Пирожков М.К. Биологические препараты для специфической профилактики и терапии эшерихиоза животных. Автореф. докт. дис. М., 2002.

Бовкун Г.Ф. Роль микрофлоры при заболеваниях органов пищеварения у цыплят. Ветеринария, 2004, 4: 14-16.

Плохинский Н.А. Алгоритмы биометрии. М., 1980.

Зинченко Е.В., Панин А.Н. Иммунобиотики в ветеринарной практике. Пущино, 2000.

Сидоров М.А., Субботин В.В., Данилевская Н.В. Нормальная микрофлора животных и ее коррекция пробиотиками. Ветеринария, 2000, 11: 17-22.

Малик Н.И. Новые пробиотические препараты ветеринарного назначения. Автореф. докт. дис. М., 2002.

Размещено на Allbest.ru