О содержании перекиси водорода в проростках гороха на ранних стадиях бобово-ризобиального симбиоза

Размещено на http://www.allbest.ru/

О содержании перекиси водорода в проростках гороха на ранних стадиях бобово-ризобиального симбиоза

Оценивали содержание перекиси водорода в проростках гороха с нормальной и нарушенной регуляцией инфекционного и нодуляционного процессов при инокуляции азотфиксирующими клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum bv. viceae и при воздействии экзогенной салициловой кислоты. Обсуждается возможность участия перекиси водорода и салициловой кислоты в регуляции инфицирования корней ризобиями на ранних стадиях формирования симбиотических отношений.

The authors estimated the hydrogen peroxide content in pea seedlings (Pisum sativum L.) with normal and disturbed regulation of infection and nodulation after inoculation by nitrogen-fixing bacteria (Rhizobium leguminosarum bv. viceae) and their treatment by exogenous salicylic acid. It was shown, that hydrogen peroxide content in organs of pea seedlings after inoculation is altered in connection with biotype of plant-host. Hydrogen peroxide participates in establishing an regulatory and protective functions in pea during symbiosis with rhizobia. Salicylic acid have effect on the hydrogen peroxide content in roots of pea seedlings during inoculation by nodulating bacteria.

На начальных этапах бобово-ризобиального симбиоза важную роль могут играть активные формы кислорода, такие как перекись водорода (Н 2О 2) и супероксиданион радикал (О), которые, возможно, принимают участие в регуляции инфекционного процесса и клубенькообразования.

Во многих работах показана роль молекул Н 2О 2 как сигнальных интермедиатов, "включающих" защитные механизмы растений при взаимодействии с патогенами. Молекулы Н 2О 2 также обладают прямым бактерицидным действием, участвуют в механизмах апоптоза, что создает барьер на пути инфекции (1-3). Следовательно, под влиянием Н 2О 2, выполняющей эти защитные функции, возникает локальный и системный иммунитет растений к патогенам. При этом показано, что Н 2О 2 образуется в основном в результате патогениндуцированной активации НАДФН-оксидазной сигнальной системы при участии салициловой кислоты (2, 4).

В случае бобово-ризобиального симбиоза, по-видимому, аналогичные механизмы обеспечивают регуляцию инфекционного процесса и клубенькообразования. Известно, что при инфицировании около тысячи клубеньковых бактерий (ризобий) проникает в клетки растения-хозяина, а до стадии клубенькообразования доходит на порядок меньше (5). Инфекционные нити на начальных стадиях роста могут абортировать, а в погибших клетках накапливаются вещества, характерные для апоптоза при патогенезе (6). Эта реакция аналогична сверхчувствительной реакции при инфицировании растений патогенами. Можно предположить, что растение-хозяин активно участвует в регуляции инфекционного процесса, а в органах, непосредственно не связанных с образованием клубеньков, срабатывает защитный механизм, исключающий возможность проникновения клубеньковых бактерий. Ранее нами обсуждалась роль супероксиданион-радикала в инфекционном процессе при бобово-ризобиальном симбиозе (7). При электронно-микроскопических исследованиях корней растений люцерны, инфицированных Sinorhizobium meliloti, обнаружено локальное образование О и Н 2О 2 в матриксе инфекционной нити вокруг бактерий (8). Эти данные подтверждают тот факт, что проникшие в корень ризобии находятся под контролем растения-хозяина, в котором принимают участие активные формы кислорода. В целом же вопрос о возможной роли активных форм кислорода в обеспечении регуляции процессов инфицирования и образования клубеньков при симбиозе в настоящее время остается малоизученным. перекись горох инфицирование

Целью нашей работы была оценка содержания Н 2О 2 в проростках гороха с нормальным и нарушенным клубенькообразованием при инокуляции Rhizobium leguminosarum bv. viceae.

Методика. Объектом исследования служили проростки гороха сорта Марат (селекция Тулунской государственной селекционной станции), а также мутантов, различающихся по способности к клубенькообразованию: К 14а (бесклубеньковый) и Nod3 (суперклубеньковый)*. Как показали ранее проведенные исследования, растения сорта Марат по способности к клубенькообразованию не отличаются от таковых сорта Рондо (родительская форма мутантов К 14а и Nod3) (9). Поэтому мы сочли возможным сравнить эти мутанты с сортом Марат, а не с исходным родительским сортом.

Семена проращивали в кюветах на влажной фильтровальной бумаге в термостате при температуре 22 оС в течение 2 сут. Затем проростки помещали в специальные камеры в вертикальном положении, чтобы исключить попадание инокулята на эпикотили. Корни 2-суточных проростков инокулировали суспензией клеток активного производственного штамма клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum bv. viceae 250а-CIAM 1026** в концентрации 2108 кл/мл (объем суспензии - 1 мл на один корень) (10). После инокуляции камеры с проростками выдерживали в термостате при тех же условиях в течение 2 сут. Контролем служили неинокулированные проростки.

Содержание перекиси водорода определяли в корнях и эпикотилях проростков в возрасте 2, 3 и 4 сут на основе ферментативного пероксидазного метода окисления о-дианизидина (11). Для этого навеску растительного материала (0,5-1,5 г) замораживали в жидком азоте и растирали в фарфоровых ступках в 5 % уксусной кислоте (для инактивации каталазы и пероксидазы) при добавлении 0,1 г активированного древесного угля (для связывания металлов). С целью предотвращения распада Н 2О 2 все процедуры проводили в темноте. Гомогенат центрифугировали в течение 5 мин при 3000 g. Супернатант титровали до pH 8,0 и снова центрифугировали при пониженной температуре в течение 20 мин при 20000 g. К 5 мл полученного экстракта приливали 5 мл реакционной смеси, в состав которой входили 50 мл раствора пероксидазы в 0,12 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,0) и 0,5 мл хромогена (0,5 % раствор о-дианизидиндигидрохлорида) (фирма "ICN", США). Оптическую плотность регистрировали на фотоэлектрическом колориметре КФК-2 при = 480 мкм. Для построения калибровочной кривой и расчета содержания Н 2О 2 проводили титрование стандартного раствора последней в серной кислоте марганцевокислым калием.

Для оценки влияния экзогенной салициловой кислоты проростки гороха после инокуляции раскладывали на фильтровальной бумаге, смоченной 0,2 мМ водным раствором этой кислоты.

Представлены средние арифметические значения по данным трех независимых экспериментов, биологическая повторность опытов 3-кратная. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента (12).

Результаты. По всем вариантам опыта содержание Н 2О 2 в эпикотилях проростков гороха было выше, чем в корнях (особенно у мутанта К 14а), что обусловлено, вероятно, тем, что в последних формируются хлоропласты, в которых происходит генерация активных форм кислорода (13) (табл. 1). Через 1 и 2 сут после инокуляции содержание Н 2О 2 в корнях проростков гороха сорта Марат снижалось соответственно на 43,1 и 48,0 % (Р 0,95), в эпикотилях - повышалось соответственно на 70,1 и 121,3 % (Р 0,95).

1. Содержание перекиси водорода в проростках гороха сорта Марат и мутантов К 14а и Nod3, различающихся по способности к клубенькообразованию, в зависимости от возраста и инокуляции клубеньковыми бактериями (мкг/г сырой массы)

В корнях проростков мутанта гороха К 14а через 1 сут после инокуляции клубеньковыми бактериями содержание Н 2О 2 увеличивалось на 70,6 %, а через 2 сут - уменьшалось на 27,0 % (Р 0,95). В эпикотилях через 1 и 2 сут количество Н 2О 2 снижалось соответственно на 36,0 и 60,4 % (Р 0,95).

Через 1 сут после инокуляции в корнях мутанта Nod3 содержание Н 2О 2 уменьшалось на 62,5 % (Р 0,95), через 2 сут - возрастало до такового в контроле. При этом инокуляция практически не оказывала влияния на содержание Н 2О 2 в эпикотилях.

Значительное снижение содержания Н 2О 2 в корнях мутанта Nod3 через 1 сут после инокуляции по сравнению с сортом Марат, очевидно, связано с нерегулируемым беспрепятственным проникновением ризобий в результате ослабления защитных функций. У мутанта К 14а, напротив, защитные механизмы исключали проникновение ризобий в корни. Как снижение, так и повышение содержания Н 2О 2 в корнях проростков мутантов гороха после инокуляции было кратковременным и уже через 2 сут изменялось в противоположном направлении.

Наибольшее повышение содержания Н 2О 2 в эпикотилях проростков гороха сорта Марат в ответ на инокуляцию, вероятно, можно объяснить тем, что защитные механизмы предотвращают проникновение ризобий, причем интермедиатом, возможно, служит салициловая кислота. Отсутствие различий по содержанию Н 2О 2 в эпикотилях мутанта гороха Nod3 до и после инокуляции, по-видимому, связано с нарушением регуляции процессов инфицирования и клубенькообразования, а также ослаблением защитных механизмов.

Показано, что инфекционный процесс у бобовых растений контролируется посредством локального образования активных форм кислорода в инфекционной нити после накопления определенного количества бактерий (8). Ранее нами было отмечено, что после инокуляции проростков гороха сорта Марат клубеньковыми бактериями штамма 250а-CIAM 1026 наблюдается усиление генерации радикалов О в эпикотилях, свидетельствующее о существовании защитного механизма, связанного с системной индуцированной устойчивостью (7).

Известно, что салициловая кислота является конкурентным ингибитором каталазы, что может способствовать накоплению Н 2О 2, а также служит сигнальным интермедиатом, легко проникающим по проводящей системе в другие органы (14). При обработке проростков гороха сорта Марат салициловой кислотой содержание Н 2О 2 в корнях увеличивалось в зависимости от рН инкубационной среды (табл. 2). При этом следует отметить, что при использовании салициловой кислоты одновременно с инокуляцией (особенно при рН 4,0) содержание Н 2О 2 в корнях было значительно ниже, чем в вариантах без инокуляции, то есть клубеньковые бактерии каким-то образом частично снимали вызванное действием кислоты повышение содержания Н 2О 2 в корнях. Вполне возможно, что это обусловлено бактериальным Nod-фактором. Показано, что под воздействием Nod-фактора совместимого с растениями люцерны штамма Rhizobium meliloti интенсивность биосинтеза салициловой кислоты в корнях снижается, то есть блокируется сигнальный механизм, связанный с защитной функцией растения-хозяина (15). Не исключено, что отмеченное нами снижение содержания Н 2О 2 в корнях проростков гороха после инокуляции (сорт Марат и мутант Nod3), а также под воздействием салициловой кислоты и инокуляции (сорт Марат) вызвано теми же причинами.

2. Содержание перекиси водорода в корнях проростков гороха сорта Марат под воздействием экзогенной салициловой кислоты в зависимости от рН среды инкубации при инокуляции клубеньковыми бактериями

В литературе имеются сведения о том, что при инокуляции бобовых растений несовместимым штаммом азотфиксирующих бактерий, а также штаммом, не синтезирующим Nod-фактор, в корнях накапливается салициловая кислота и "включается" сигнальный механизм, обеспечивающий защитную функцию растений-хозяев (14, 15). Возможно, что повышение содержания Н 2О 2 в корнях мутанта К 14а (не образует клубеньков) после инокуляции обусловлено подобным механизмом. Однако для доказательства этих предположений необходимо проанализировать содержание эндогенной салициловой кислоты. Кроме того, изменение содержания активных форм кислорода на начальных этапах бобово-ризобиального симбиоза может быть обусловлено, например, изменением НАДФН-оксидазной активности плазмалеммы и интенсивности образования активных форм кислорода после воздействия Nod-фактора на клетки растения-хозяина. Подобный механизм широко распространен в фитопатогенных системах, однако остается не изученным в симбиотических (2, 4).

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что при формировании симбиотических отношений между азотфиксирующими бактериями и растениями гороха перекись водорода и салициловая кислота осуществляют контроль за инфицированием корней клубеньковыми бактериями как за счет прямого антибактериального воздействия, так и посредством регуляции функциональной активности защитных систем у растений-хозяев. Последнее наблюдается при совместимом бобово-ризобиальном симбиозе и служит для ограничения инфицирования чувствительных частей корня (корневых волосков) и распространения инфекции, а также предотвращения проникновения ризобий в органы, не связанные с образованием клубеньков (16). При несовместимом бобово-ризобиальном симбиозе и под воздействием экстремальных факторов возрастает функциональная активность защитных систем растения-хозяина. Важную роль при этом играет структурно-функциональное соответствие между ризобиальным Nod-фактором и растительным рецептором, которое обусловливает узнавание партнеров и подавляет запуск защитных механизмов у растений (14, 15).

Литература

M i t t l e r R., F e n g X., C o h e n M. Post-transcriptional suppression of cytosolic ascorbate peroxidase expression during pathogen-induced programmed cell death in tobacco. Plant Cell, 1998, 10, 3: 461-473.

Т а р ч е в с к и й И.А. Сигнальные системы клеток растений. М., 2002.

С к у л а ч е в В.П. Возможная роль активных форм кислорода в защите от вирусных инфекций. Биохимия, 1998, 63, 12: 1691-1694.

М о л о д ч е н к о в а О.С. Предполагаемые функции салициловой кислоты в растениях. Физиол. и биохим. культ. раст., 2001, 33, 6: 463-473.

Б а у э р В.Г. Инициация заражения бобовых клубеньковыми бактериями. В. кн. Инфекционные болезни растений. Физиологические и биохимические основы. М., 1987: 69-87.

V a s s e J., B i l l y F., T r u c h e t G. Abortion of infection during the Rhizobium meliloti-alfalfa simbiotic interaction is accompanied by a hypersensitive reaction. Plant J., 1993, 4, 3: 555-566.

В а с и л ь е в а Г.Г., М и р о н о в а Н.В., Г л я н ь к о А.К. и др. Генерация супероксидных радикалов в проростках гороха при действии низкой положительной температуры и инокуляции азотфиксирующими бактериями. Физиол. и биохим. культ. раст., 2001, 33, 2: 176-181.

S a n t o s R., H e r o u a r t D., S i g a u d S. e.a. Oxidative burst in alfalfa-Sinorhizobium meliloti symbiotic interaction. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2001, 14, 1: 86-89.

А к и м о в а Г.П., С о к о л о в а М.Г., Л у з о в а Г.Б. и др. Роль пероксидазы во взаимодействиях растений гороха с Rhizobium. Агрохимия, 2002, 12: 37-41.

S a f r o n o v a V.I., N o v i k o v a N.I. Comparison of two methods for root nodule bacteria preservation. Lyophilization and liquid nitrogen freezing. J. Microbiol. Methods, 1996, 24: 231-237.

У г а р о в а Н.Н., Л е б е д е в а О.В., С а в и ц к и й А.П. Пероксидазный катализ и его применение. М., 1981.

П л о х и н с к и й Н.А. Биометрия. М., 1970.

Ф у т Х. Фотосенсибилизированное окисление и синглетный кислород. Биологические следствия. В кн.: Свободные радикалы в биологии. М., 1979, 2: 96-150.

B l i l o u I., O c a m p o J., G a r c i a - G a r r i d o J. Resistance of pea root to endomycorrizal fungus or Rhizobium correlates with enhanced levels of endogenous salicylic acid. J. Exp. Bot., 1999, 50, 340: 1663-1668.

M a r t i n e z - A b a r c a F., H e r r e r a - C e r v e r a J.A., B u e n o P. e.a. Involvement of salicylic acid in the establishment of the Rhizobium meliloti-alfalfa symbiosis. Molecular Plant-Microbe Interactions. 1998, 11, 3: 153-155.

А к и м о в а Г.П., С о к о л о в а М.Г., Л у з о в а Г.Б. и др. Пероксидаза во взаимодействиях растений гороха с Rhizobium. Докл. РАН, 2002, 385, 2: 276-278.

Размещено на Allbest.ru