О возможности применения 1,3;1,6-B-D-глюканов бурых водорослей для раннего выявления вироидной инфекции картофеля

Размещено на http://www.allbest.ru/

О возможности применения 1,3;1,6--d-глюканов бурых водорослей для раннего выявления вироидной инфекции картофеля

В.Я. Федорова, С.А. Романова, Т.Н. Звягинцева, Б.Г. Анненков, А.В. Реунов, Л.А. Елякова

Аннотация

Представлены итоги работы по испытанию действия препаратов 1,3;1,6--D-глюканов, получаемых ферментативным преобразованием ламинарана из бурой водоросли Laminaria cichorioides, на развитие инфекции, обусловленной вироидом веретеновидности клубней картофеля (ВВКК). Дана оценка эффективности различных препаратов 1,3;1,6--D-глюканов для раннего выявления симптомов ВВКК. Приведены данные апробации разработанного метода выбраковки больных растений на посадках семенных селекционных сортов картофеля в Хабаровском крае. Обсуждается перспективность использования -D-глюканов для раннего выявления скрытой вироидной инфекции у картофеля.

ABOUT POSSIBILITY OF THE USE OF 1,3; 1,6--D-GLUCANS FROM BROWN ALGAE FOR EARLY EXPOSURE OF VIROID INFECTION IN POTATO

V.Ya. Fedorova, S.A. Romanova, T.N. Zvyagintseva,

B.G. Annenkov, A.V. Reunov, L.A. Elyakova

S u m m a r y

The balance of the work is presented on the testing of the effect of 1,3;1,6--D-glucans obtained by enzymatic transformation of laminaran from Laminaria cichorioides on infection progress due to viroid of spindle-shaped potato tuber (VSPT). The authors estimates the efficiency of different preparations of 1,3;1,6--D-glucans for early exposure of VSPT symptoms. The method of culling of ill plants was developed and approved on sowing of seed selectional potato varieties in Khabarovsk region. It was shown, that these preparations favor the viroid propagation and lead to early exposure of disease symptoms. The relationship between biological action of -D-glucans and their chemical structure was shown. The field testing supports the promising of -D-glucans usage for early exposure of latent viroid infection in potato.

Введение

Источниками 1,3;1,6--D-глюканов (так называемые ламинараны) служат бурые водоросли, в которых содержание этих низкомолекулярных полисахаридов составляет 0,5-30 % (от сухой массы) (1). Среди бурых водорослей Дальнего Востока имеются виды, характеризующиеся высоким содержанием ламинарана, например Laminaria cichorioides (10-12 %) (2). Аналогичные полисахариды входят в состав клеточных оболочек многих высших растений, лишайников и микроорганизмов. Известно, что физико-химические свойства -D-глюканов, а также их биологическая активность тесно связаны с характеристиками химических свойств: степенью полимеризации, количеством и характером включения -1,6-связанных глюкозных остатков в цепь 1,3--D-глюкана (3). К наиболее важным свойствам 1,3;1,6--D-глюканов относится их иммуномодулирующая способность, проявляющаяся по отношению как к животным, так и растениям (4, 5). Предполагается, что при обработке -D-глюканами в растениях активируется система защиты (4). Вероятно, в процессах модулирования иммунного ответа у растений могут принимать участие различные структурные участки молекул -D-глюканов. В одних случаях -D-глюканы проявляют свойства индукторов и усиливают защитные реакции растений, ослабляя развитие инфекций, в других -- действуют как супрессоры, способствуя развитию заболеваний (6).

В связи с этим в задачу нашей работы входило исследование фитоиммуномодулирующих свойств 1,3;1,6--D-глюканов, полученных на основе ламинаранов бурых водорослей, запасы которых в дальневосточных морях имеют промышленное значение, с целью разработки методики раннего выявления скрытой вироидной инфекции у картофеля и выбраковки зараженных образцов.

Описание методики. Мы использовали ламинаран из бурой водоросли L. cichorioides, а также полученные из него методом ферментативной трансформации препараты 1,3;1,6--D-глюканов (табл. 1) (7). На начальном этапе исследований оценивали действие ламинарана и продуктов его трансформации на модуляцию иммунного ответа клубней картофеля в отношении Phytophthora infestans. Исследованные -D-глюканы, обладая супрессорным действием, усиливали проникновение гиф грибного патогена в ткани клубней картофеля (8). В то же время один из препаратов (антивир), имеющий бульшую молекулярную массу и более разветвленную цепь, чем ламинаран, подавлял развитие фитофтороза как в листьях, так и в клубнях картофеля, а также развитие инфекций, вызываемых в растениях-хозяевах вирусом табачной мозаики и Х-вирусом картофеля (9-11).

Иммуномодулирующая способность -D-глюканов побудила нас исследовать их влияние на развитие заболевания картофеля, вызываемого вироидом веретеновид-ности клубней картофеля (ВВКК), который наносит значительный экономический ущерб этой культуре.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 03-04-49534) и программы Физико-химической биологии (ФХБ) РАН.

1. Структурные характеристики 1,3;1,6--D-глюканов

Исследования, проведенные в разных странах, показали, что иммунных к ВВКК сортов картофеля нет, как нет и надежных способов защиты от этого заболевания (12).

Все существующие сорта в той или иной степени поражаются этим патогеном. Система оздоровления семенного картофеля с использованием культуры апикальной меристемы освобождает его от вирусов, но не от вироида (13). По имеющимся данным, около 80 % сортов картофеля, оздоровленных через культуру апикальной меристемы, заражены ВВКК (14). Клубни такого картофеля, используемые в качестве семенного материала, являются основным и наиболее опасным источником инфекции. Вироид представляет большую опасность при создании новых сортов, так как передается с пыльцой и сохраняется в истинных семенах (15). Стало очевидным, что технология получения безвирусного картофеля должна быть дополнена методикой, позволяющей выявлять ВВКК в используемых образцах.

В плане технологического решения проблемы оздоровления картофеля от вирусных и вироидного заболеваний особое внимание уделяют использованию ботанических семян (16). Поэтому мы отобрали истинные ботанические семена этой культуры, несущие в себе патоген (17). На сеянцах картофеля сортов Ора и Сантэ, выращенных из ботанических семян, обработанных растворами 1,3;1,6--D-глюканов, симптомы вироидного заболевания появлялись на 4-5 нед раньше, чем в контроле, то есть эти препараты стимулировали развитие инфекции. Анализ зависимости биологического действия изучаемых препаратов от их химической структуры показал, что сроки появления и выраженность симптомов ВВКК прежде всего обусловлены степенью полимеризации 1,3;1,6--D-глюканов, то есть их молекулярной массой. Наибольшее число больных растений отмечено при использовании 1,3;1,6--D-глюканов, степень полимеризации которых составляла 20-25 ед. Применение таких препаратов способствует выявлению вироида на ранних стадиях развития растений, что ускоряет первичную выбраковку зараженных образцов (16).

В дальнейших исследованиях мы проанализировали эффективность обработки -D-глюканами семян ряда гибридных линий, проростков и клубней картофеля с целью выявления ВВКК в выращенных клонах. После обработки растворами 1,3;1,6--D-глюканов (I и II) истинных ботанических семян девяти гибридных линий картофеля почти все сеянцы, выращенные из этих семян (от 15 до 40 клонов), оказались на 80-91 % инфицированными вироидом. Заболевание проявлялось у сеянцев через 4-6 нед после высева семян, причем у 24-69 % больных растений наблюдались сильно выраженные симптомы (17). В контрольном варианте внешние симптомы вироидного заболевания отмечены у 10-12 % растений только через 10-12 нед после высева семян. Результаты этого опыта соответствуют данным, полученным ранее на сеянцах, выращенных из истинных семян картофеля сортов Ора и Сантэ. глюкан ферментативный инфекция водоросль

Обработка растворами 1,3;1,6--D-глюканов ростков, снятых с проросших клубней картофеля сортов Приекульский ранний и При-12 с признаками вироидного вырождения, также ускоряла проявление вироидной инфекции у полученных растений. В этом случае под влиянием используемых препаратов доля растений с проявившимися симптомами ВВКК возрастала по сравнению с контролем в 1,5-2 раза. Наибольшее количество больных растений с ярко выраженными симптомами ВВКК наблюдалось при использовании ростков клубней сорта Приекульский ранний, обработанных 1,3;1,6--D-глюканами (18).

В экспериментах на клубневом материале использовали неоздоровленные образцы сорта Невский, клубни которых опрыскивали растворами 1,3;1,6--D-глюканов в концентрациях 0,1 и 0,5 мг/мл (в контроле водой) и высаживали в начале апреля в теплице. Растения выращивали в условиях повышенной температуры, влажности и освещенности, что способствовало более четкому проявлению вироидного заболевания в виде характерных симптомов «готики» на ботве (сильная коленчатость стеблей, вытянутость, мозаичность и складчатость листьев). В опыте такие симптомы проявлялись через 4-5 нед посл появления всходов, тогда как в контроле -- на 2-3 нед позже (табл. 2).

2. Степень проявления симптомов вироида веретеновидности клубней картофеля на неоздоровленном посадочном материале картофеля сорта Невский после обработки 1,3;1,6--D-глюканами

В течение 3 лет (1993-1995) в полевых условиях Приморского стационара Всероссийского НИИ растениеводства выращивали ранее оздоровленный картофель сорта Невский. Обработку клубневого материала проводили растворами глюкана II в концентрации 0,1 и 0,2 мг/мл. По данным полевых испытаний, в контроле и опыте симптомы «готики» проявлялись соответственно на третий и второй год вегетации. В опыте на третий год число больных растений было в 2-3 раза выше, чем в контроле. Наличие ВВКК в растениях картофеля и проявление симптомов заболевания контролировали параллельно индикаторным методом (томаты сорта Rutgers и Scopolia sinensis) и электрофорезом в ПААГ (18). На основании проведенных экспериментов был предложен метод раннего выявления вироидной инфекции в растениях картофеля с целью выбраковки больных клонов. В отделе биотехнологии Дальневосточного НИИ сельского хозяйства этот метод использовали на семенных посадках картофеля.

Полевые опыты по предпосадочной обработке селекционных сортообразцов картофеля растворами 1,3;1,6--D-глюканов проводили на семенных участках с 1996 по 2001 годы. В первый год полевых испытаний клубни картофеля сорта Дедовик опрыскивали растворами 1,3;1,6--D-глюканов (II, III и IV) в двух концентрациях -- 0,1 и 0,5 мг/мл. Наличие вироида дополнительно контролировали параллельно электрофорезом в ПААГ. Эти испытания подтвердили возможность раннего выявления скрытой вироидной инфекции в вегетирующих клонах с помощью используемых препаратов (19). Однако обработка 1,3;1,6--D-глюканами в концентрации 0,5 мг/мл не давала существенного преимущества, а лишь приводила к неоправданному перерасходу препаратов.

Поскольку наиболее эффективными как в полевых, так и в лабораторных опытах, оказались 1,3;1,6--D-глюканы III и IV, в последующих испытаниях мы применяли смесь этих препаратов в концентрации 0,25 мг/мл. В серии полевых испытаний в 1997-1999 годах были использованы сорта картофеля хабаровской селекции -- Дальвас, Дедовик, Евгирия. За 1 сут до посадки клубни опрыскивали смесью 1,3;1,6--D-глюканов с последующим «томлением» в течение ночи и медленным высыханием. После такой обработки количество растений с симптомами ВВКК на опытных делянках было больше, чем в контроле (19). Перспективные сорта картофеля Дальвас (ранний) и Дедовик (среднепоздний) оказались в меньшей степени поражены ВВКК, чем восприимчивый к инфекции среднепоздний сорт Евгирия. В течение 3 лет испытаний инфицированность клонов ВВКК первых двух сортов не превышала 16-20 %, тогда как сорта Евгирия составляла 35 %. Благодаря ранней выбраковке больных клонов на этапе сортоиспытания и размножения в результате использования 1,3;1,6--D-глюканов очищенный от ВВКК посадочный материал оказался более продуктивным (20). В первые годы испытаний урожайность образцов в опыте была ниже, чем в контроле, однако в 1999 году продуктивность клонов сортов Дальвас, Дедовик и Евгирия возросла соответственно на 13,3; 52,9 и 37,7 ц/га по сравнению с контролем. Общая площадь посевов картофеля, обработанных препаратами 1,3;1,6--D-глюканов, составляла 5,5 га.

В 1999-2001 годах мы провели испытания действия 1,3;1,6--D-глюканов на ранее не оздоровленных, но перспективных для Приамурья сортах картофеля (табл. 3). У всех исследованных сортов количество клонов с симптомами ВВКК и интенсивность заболевания значительно возрастали, что позволило своевременно освободить полевые питомники от большей части инфицированных образцов и предотвратить перезаражение здоровых растений ВВКК в процессе вегетации.

3. Степень поражения и количество растений с симптомами вироида веретеновидности клубней картофеля в клонах различных сортов под влиянием обработки клубней смесью препаратов 1,3;1,6--D-глюканов в концентрации 0,25 мг/мл

Данные полевых испытаний свидетельствуют о перспективности технологии оздоровления картофеля посредством обработки посадочных клубней препаратами 1,3;1,6--D-глюканов. Этот метод позволяет выявлять скрытую вироидную инфекцию как при отборе исходных клонов, так и при испытании меристемных и ростковых линий.

Таким образом, проведенные нами многолетние исследования показали, что препараты 1,3;1,6--D-глюканов, полученные на основе ламинарана из бурой водоросли Laminaria cichorioides, могут применяться для контрастирования скрытой вироидной инфекции в растениях картофеля и позволяют осуществлять дифференциацию здоровых и инфицированных клонов. Это особенно важно для селекционеров, так как создатели новых сортов в первую очередь пользуются визуальными оценками поражения клонов в полевых питомниках, что дает возможность быстро определять перспективные по устойчивости образцы (16). Использование предложенных препаратов ускорит первичную выбраковку больных растений и отбор здоровых образцов, которые дополнительно могут быть проанализированы с помощью чувствительных молекулярно-биологических методов (14). В результате селекционеры получат возможность эффективно освобождать посадочный материал картофеля от вироида веретеновидности клубней на различных этапах селекционного процесса.

Литература

1. P e r с i v a l E. Algal polysaccharides. In: The Carbohydrates (Chemistry and Biochemistry) /Eds. W. Pigman, D. Horton. N.Y., 1970, IIB: 541-544.

2. Z v y a g i n t s e v a T.N., S h e v c h e n k o N.M., P o p i v n i c h I.B. e.a. A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweeds. Carbohydr. Res., 1999, l: 32-39.

3. K u l i c k e W.M., L e t t a n A.J., T h i e l k i n g H. Correlation between immunological activity, molar mass, and molecular structural of different (1-3)-beta glucans. Carbohydr. Res., 1997, 297: 135-143.

4. Е л я к о в а Л.А. Регуляция 1,3;1,6--D-глюканами растительного и животного иммунитетов. Энзиматический синтез новых иммуномодуляторов. Вест. ДВО РАН, 1995, 2: 74-85.

5. В а с ю к о в а Н.И., О з е р е ц к о в с к а я О.Л., Л е о н т ь е в а Г.В. и др. Различия в структуре -глюканов двух рас возбудителя фитофтороза. Биоорганическая химия, 1987, 13: 825-832.

6. О з е р е ц к о в с к а я О.Л. Индуцирование устойчивости растений биогенными элиситорами патогенов. Прикл. биохим. и микробиол., 1994, 30: 325-339.

7. З в я г и н ц е в а Т.Н., Е л я к о в а Л.А., И с а к о в В.В. Ферментативное превращение ламинаранов в 13;16--D-глюканы, обладающие иммуностимулирующим действием. Биоорганическая химия, 1995, 21: 218-225.

8. В а с ю к о в а Н.И., Л е о н т ь е в а Г.И., Ч а л е н к о Г.И. и др. Модуляция иммунного ответа клубней картофеля -глюканами. Физиол. раст., 1989, 36: 794-811.

9. Е л я к о в а Л.А., Л а п ш и н а Л.А., Р е у н о в А.В. и др. Защитное действие -1,3;1,6-D-глюкана «антивира», полученного ферментативной трансформацией ламинарана на растениях табака против вируса табачной мозаики. Докл. РАН, 1994, 336: 710-711.

10. Ф е д о р о в а В.Я., У м а н е ц А.В., З в я г и н ц е в а Т.Н. и др. Роль биологически активных -глюканов в иммунитете картофеля. В сб.: Защита растений на Дальнем Востоке. Хабаровск, 1995: 138-147.

11. Р е у н о в А.В., Л а п ш и н а Л.А., Н а г о р с к а я В.П. и др. Подавление 1,3;1,6--D-глюканом инфекции, вызываемой Х-вирусом картофеля в листьях гомфрены и дурмана. Физиол. раст., 2000, 47: 240-243.

12. D i e n e r T.O. Viroids and the nature of viroid disease. Arch. Virol., 1999, 15: 203-220.

13. М о ж а е в а К.А, В а с и л ь е в а Т.Я., К а с т а л ь е в а Т.Б. Распространенность и опасность ВВКК. В сб.: Актуальные проблемы современного картофелеводства. Мат. Межунар. конф. Самохваловичи, 1997: 101.

14. А т а б е к о в И.Г., М о р о з о в С.Ю., Д р ы г и н Ю.Ф. и др. Методические указания по диагностике вироида веретеновидности клубней картофеля. М., 1999.

15. К а с т а л ь е в а Т.Б., М о ж а е в а К.А., П и с е ц ка я Н.Ф. и др. Вироид веретеновидности клубней и оздоровление картофеля. Вест. РАСХН, 1992, 3: 22-24.

16. Направления, методы и основные результаты исследований зарубежных ученых в области селекции картофеля на вирусоустойчивость /Под ред. Б.И. Дорожкина. Омск, 1991.

17. Ф е д о р о в а В.Я., Р о м а н о в а С.А., Л е д н е в а В.А. и др. Действие -глюканов на вироидную инфекцию. Биотехнология, 1998, 6: 62-68.

18. Ф е д о р о в а В.Я., Р о м а н о в а С.А., З в я г и н ц е в а Т.Н. и др. Практическое применение -D-глюканов в селекции картофеля на вироид веретеновидности клубней картофеля. В сб.: Селекция и семеноводство сельскохозяйственных культур -- основа подъема сельского хозяйства Дальневосточного региона. Новосибирск, 2000: 43-52.

19. А н н е н к о в Б.Г., Г л а з Н.В., Ф е д о р о в а В.Я. Использование трансглюканов для контрастирования инфекции вироида веретеновидности клубней на семенном картофеле. Тр. ДГАУ. Благовещенск, 2000, 5: 77-80.

20. А н н е н к о в Б.Г., Г л а з Н.В., Т о л м а ч е в а И.А. Применение трансглюканов для визуального проявления вироидной инфекции и проведения эффективной фитопрочистки на семенном картофеле. Науч. тр. ДВНИИСХ. Хабаровск, 2000: 57-67.

Размещено на Allbest.ru