Применение метода полимеразной цепной реакции для диагностики инфицированности крупного рогатого скота вирусом лейкоза

Размещено на http://www.allbest.ru/

Применение метода полимеразной цепной реакции для диагностики инфицированности крупного рогатого скота вирусом лейкоза

И.Г. Удина, И.Н. Фалынскова, А.С. Трухин

Application of pcr method for diagnostics of bovine leukemia virus in cattle

I.G. Udina, I.N. Falynskova, A.S. Trukhin

Bovine leukemia virus (BLV) infection was studied in two cattle herds of Black Pied breed. Efficiency of two methods of diagnostics RID (reaction of immune diffusion) and PCR were compared. High efficiency of PCR method compared to RID was detected, because PCR method allowed us additionally reveal 18 % of infected cows.

В двух стадах крупного рогатого скота черно-пестрой породы оценивали степень инфицированности животных вирусом лейкоза (ВЛКРС). Сравнивали эффективность двух методов диагностики -- РИД (реакция иммунодиффузии) и ПЦР (полимеразная цепная реакция).

Хроническое заболевание опухолевой природы, вызываемое вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) (1), наносит большой ущерб скотоводству в связи со снижением продуктивности больных животных, выбраковкой зараженных и больных особей, ограничением срока хозяйственного использования, а также затра-тами на проведение оздоровительных мероприятий. Борьба с лейкозом крупного рогатого скота основывается на диагностике вируса и постепенной элиминации зараженных животных. Однако при высокой инфицированности скота, превы-шающей 70 %, наиболее рациональным было бы использование специфических вакцин. Однако многочисленные попытки по созданию эффективных вакцин для профилактики лейкоза крупного рогатого скота и предотвращения развития опухолевых процессов пока не привели к желаемым результатам.

ВЛКРС -- онкогенный ретровирус, вызывающий В-клеточный лимфоцитоз, лейкемию и лимфосаркому у овец и крупного рогатого скота. ВЛКРС имеет 50 % сходство с вирусом Т-клеточной лейкемии человека типа I и II (2). В-клетки являются первичными мишенями для ВЛКРС (3). Инфицированность животных не всегда приводит к развитию заболевания; для этого необходимо определенное состояние иммунной системы и генетическая восприимчивость особей к заболеванию. Вирус индуцирует хроническую инфекцию у крупного рогатого скота, приводящую к трем возможным патологическим формам заболевания: асимптоматическое течение, пер-систентный лимфоцитоз и лимфосаркома, которая встречается довольно редко.

Естественным хозяином ВЛКРС в природе является крупный рогатый скот. В эксперименте этим вирусом можно инфицировать овец, коз, свиней, обезьян и кро-ликов. При заражении ВЛКРС животные могут быть вирусоносителями иногда на протяжении всего периода использования, но лишь в 5-10 % случаев развивается лейкоз. При изучении вирусной этиологии лейкоза накоплены данные, свидетельст-вующие о генетически обусловленной устойчивости животных отдельных пород и линий к ВЛКРС. Однажды инфицированное животное остается вирусоносителем в течение всей жизни; возбудитель передается с кровью, молоком, носовой и влага-лищной слизью. Возможны два пути заражения -- вертикальный (от матери плоду) и горизонтальный (от зараженного животного здоровому). К сожалению, следует отметить возможность передачи инфекции при проведении ветеринарных мероприятий в случае не соблюдения мер по использованию одноразовых или стерилизованных медицинских инструментов.

Показано, что устойчивость к лейкозу контролируется геном главного ком-плекса гистосовместимости BoLA-DRB3 (4, 5). Выявлена взаимосвязь между аллеля-ми этого гена и продуктивностью животных: высокопродуктивные особи в большей степени подвержены заболеванию лейкозом, чем низкопродуктивные.

Изучение ассоциативных связей между генами главного комплекса гисто-совместимости у крупного рогатого скота BoLA (bovine leukocyte antigens) и устой-чивостью к лейкозу позволило идентифицировать аллели гена BoLА-DRB3. Напри-мер, у черно-пестрого скота три (BoLA-DRB3.2*11, BoLA-DRB3.2*23, BoLA-DRB3.2*28) и четыре (BoLA-DRB3.2*8, BoLA-DRB3.2*16, BoLA-DRB3.2*22 и BoLA-DRB3.2*24) аллеля гена BoLА-DRB3 контролируют соответственно невосприимчи-вость и восприимчивость к лейкозу, причем первые доминируют над вторыми. Пока-зано, что спектр аллелей гена BoLA-DRB3 универсален и определяется короткими аминокислотными мотивами в позициях антигенов 74-78 и 70-71 (4-7). Удалось вы-явить дополнительные аллели гена BoLA-DRB3 (5). Установлено, что у вирусоносителей, больных и здоровых коров различных пород уровень гетерозиготности по гену BoLA-DRB3 выступает в качестве неспецифического фактора устойчивости к лейкозу (5, 7).

Одним из подходов к оздоровлению стад может служить селекция на повы-шение устойчивости к лейкозу. Для этого необходима своевременная и точная диаг-ностика заболевания. Основной диагностический метод, по результатам которого проводят оздоровительные и профилактические мероприятия в неблагополучных по лейкозу хозяйствах, -- реакция иммунодиффузии (РИД) в агарозном геле с исполь-зованием гликопротеидного антигена ВЛКРС.

Метод РИД основан на обнаружении в сыворотке крови исследуемых живот-ных специфических преципитирующих антител к антигенам ВЛКРС, появляющихся в крови через 1,5-2 мес после заражения и сохраняющихся пожизненно. Метод обладает высокой специфичностью, простотой постановки, низкой себестоимостью, но довольно низкой чувствительностью. Одним из недостатков является также невозможность выявить всех зараженных животных и исследовать молодняк до 6-месячного возраста.

При использовании иммуноферментного анализа (ИФА) применяют антиви-довой конъюгат с ферментами-маркерами. По сравнению с РИД метод ИФА является более чувствительным и специфичным, что позволяет автоматизировать процесс и сократить время анализа. Разработан метод ИФА с применением моноклональных антител.

Животных, в сыворотке крови которых методами РИД и ИФА обнаружены специфические антитела к ВЛКРС, подвергают гематологическому исследованию и выявляют среди вирусоносителей больных особей.

К числу современных методов диагностики многих инфекций, в том числе и лейкоза, относятся молекулярная гибридизация (7) и полимеразная цепная реакция (ПЦР), основанные на обнаружении ДНК возбудителя в организме животных. Эти методы обладают максимальной чувствительностью и высокой специфичностью и позволяют выявить вирус уже через 1 нед после заражения. В настоящее время про-граммы оздоровления хозяйств от лейкоза построены на применении в качестве ди-агностики метода РИД: серопозитивных животных считают зараженными и выводят из стада. При таком подходе оздоровление стада затягивается на годы, так как невозможно обнаружить всех инфицированных животных (особенно на ранних стадиях) и изолировать их от здоровых. Метод ПЦР позволяет выявлять инфицированных животных в раннем возрасте -- 15 сут.

В связи с этим в задачу нашей работы входила оценка эффективности двух методов диагностики лейкоза у крупного рогатого скота -- РИД и ПЦР.

Описание методики. Объектом исследования служили животные черно-пестрой породы голландской селекции (I выборка, n = 51) из ЗАО «Авангард» (Рязанская обл.) и улучшенной черно-пестрой породы (II выборка, n = 35) с зоостанции Московской сельскохозяйственной академии (МСХА) им. К.А. Тимирязева.*

ДНК выделяли из цельной крови с использованием набора реагентов DIAtom DNA Prep (фирма «IsoGene», Москва), согласно прописи производителя. Для обнаружения ВЛКРС использовали набор реагентов «GenPak™ proBLV» для амплификации фрагмента гена gag в ДНК провируса на основе ПЦР (изготовитель Г.О. Шайхаев, фирма «IsoGene», Москва). Полимеразную цепную реакцию ставили в термоциклере Amply 4L (фирма «Biokom», Москва) в следующем режиме: первый цикл -- денатурация ДНК 120 с при 95 оС, отжиг праймеров 60 с при 62 оС, элонгация 120 с при 74 оС; второй цикл -- денатурация ДНК 60 с при 95 оС, отжиг праймеров 50 с при 60 оС, элонгация 60 с при 74 оС; 43 цикла -- денатурация 60 с при 95 оС, отжиг праймеров 40 с при 58 оС, элонгация 60 с при 74 оС; заключительный цикл -- элонгация 120 с при 74 оС. Продукты рестрикции разделяли электрофорезом в 1,5 % агарозном геле с добавлением бромистого этидия (0,5 мкг/мл) и тестировали под УФ-лучами в трансиллюминаторе.

В I и II выборках методом ПЦР было выявлено соответственно 60,3 и 5,7 % инфицированных коров, а методом РИД -- 44,2 и 0 %.

На зоостанции МСХА ежегодно проводят мероприятия по диагностике лейкоза методом РИД с последующей немедленной выбраковкой инфицированных животных, а также зоогигиенические мероприятия, исключающие передачу вируса от зараженных животных здоровым. Несмотря на это, методом ПЦР во II выборке выявлено 5,7 % инфицированных животных.

Для оценки эффективности диагностики ВЛКРС методами РИД и ПЦР мы провели более детальный анализ коров I выборки. При этом методом ПЦР было идентифицировано на 18 % больше инфицированных особей по сравнению с таковыми при использовании РИД. Это закономерно, так как метод РИД позволяет выявить носителей инфекции, у которых ВЛКРС присутствует в виде провируса при отсутствии антител. Однако методом РИД обнаружено три инфицированных коровы (1,9 %), у которых при повторном типировании ВЛКРС методом ПЦР не выявлен вирус. Тем не менее возможно и другое объяснение, например, низкий титр провирусной ДНК, недостаточный для выявления ВЛКРС методом ПЦР. Эти данные свидетельствуют о важности РИД-диагностики ВЛКРС для отдельных животных.

Итак, использование метода ПЦР-диагностики ВЛКРС позволит значительно повысить эффективность и темпы проведения мероприятий по оздоровлению стад крупного рогатого скота от лейкоза.

Литература

скот лейкоз инфекция

1.Burny A., Cleuter Y., Kettmann R. e.a. Bovine leukemia: facts and hypotheses derived from the study of an infection cancer. Vet. Microbiol., 1988, 17: 197-218.

2.Sagata N., Yasunaga T., Tsuzuku - Kawamura J. e.a. Complete nucleo- tide sequence of the genome of bovine leukemia virus: its evolutionary relationship to other retroviruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82: 677-681.

3.Esteban E.N., Thorn R.M., Ferrer J.F. Characterization of the blood lymphocyte population in cattle infected with the bovine leukemia virus. Cancer Res., 1985, 45: 3225-3230.

4.X u A., V a n E i j k M.J.T., P a r k C. e.a. Polymorphism in BoLA-DRB3 exon 2 correlates with resistance to persistent lymphocytosis by bovine leukemia virus. J. Immunol., 1993, 151: 6977-6985.

5.Удина И.Г., Карамышева Е.Е., Туркова С.О. и др. Генетические механизмы устойчивости и чувствительности к лейкозу айрширской и черно-пестрой пород крупного рогатого скота, установленные на основе распределения аллелей гена BoLA-DRB3. Генетика, 1995, 31: 1294-1299.

6.Удина И.Г., Карамышева Е.Е., Сулимова Г.Е. и др. Сравнительный анализ айрширской и черно-пестрой пород крупного рогатого скота по маркерам гистосовместимости. Генетика, 1998, 34: 1668-1674.

7.Мальцева Н.А., Каледин А.С., Олийник Е.И. и др. Использование ди-агностических ДНК-зондов для обнаружения пpовиpуса вируса бычьего лейкоза у инфицированных коров. Вопр. вирусол., 2002, 6: 38-42.

Размещено на Allbest.ru