Получение клонированных эмбрионов крупного рогатого скота с использованием ядер соматических клеток и энуклеированных ооцитов, дозревавших in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

Получение клонированных эмбрионов крупного рогатого скота с использованием ядер соматических клеток и энуклеированных ооцитов, дозревавших in vitro

К.В. Кириенко,

А.Г. Логинов,

А.С. Алгулян,

И.Г. Сметанина,

Л.В. Татаринова,

В.П. Рябых

Аннотации

С использованием в качестве источника кариопластов клеток кумулюса коров определяли условия и режим проведения основных этапов клонирования: дозревания ооцитов in vitro; реконструирования клеток; слияния кариопласта с цитопластом; активации реконструированных клеток; культивирования реконструированных эмбрионов до стадии бластоцисты. Реконструированные клетки активировали кальциевым ионофором с последующей обработкой 6-диметиламинопурином через 0,5-1,5 ч после электрослияния и культивировали in vitro (в среде DМЕМ на фидерном слое из клеток кумулюса под газовой фазой 5 % СО 2 в воздухе или в среде KSOM, обогащенной заменимыми и незаменимыми аминокислотами, под газовой фазой 5 % CO2, 5 % O2, 90 % N2). Разработанная технология позволяет получать 20,3 -23,6 % клонированных эмбрионов крупного рогатого скота на стадии бластоцисты.

Ключевые слова: крупный рогатый скот, клонирование, эмбрион, ооцит, дозревание энуклеированных ооцитов in vitro, кариопласт, цитопласт, бластоциста, биотехнологическое реконструирование, активация реконструированных клеток, культивирование реконструированных эмбрионов, технологии клонирования животных.

Production of cloned calves embryos BY SOMATIC CELLS NUCLEAR TRANSFER To ENUCLEATED OOCYTES MATURATED in vitro

K.V. Kiriyenko, A.G. Loginov, A.S. Algulian, I.G. Smetanina, L.V. Tatarinova, V.P. Ryabykh корова клонирование бластоциста

A technology for production of cloned calves embryos by somatic cells nuclear transfer to enucleated oocytes maturated in vitro was developed. The cumulus cells of adult animals were used as a source of karyoplasts. Conditions and parameters for the basic stages of technology are determined. Cytoplast to karyoplast fusion was carried out using electric pulses (1.5-2.0 kV/cm for 10 micro seconds each) in Zimmerman's medium. Reconstructed cells were activated by treatment with Са++-ionophore and 6-DMAP in 0.5-1.5 hours after the fusion. In vitro cultivation of reconstructed cells was resulted in 20.3-23.6 % of embryos developed up to a blastocyst. In two cultivation system (KSOM medium enriched with replaceable and irreplaceable amino acids under a gas phase of 5 % CO2, 5 % O2 and 90 % N2, and the cumulus cells feeding layer in DМЕМ medium under a gas phase 5 % СО 2 in air) the efficiency of development of the reconstructed calves embryos was the same. Thus, the developed technology allows obtaining up to 23.0 % of cloned calves embryos at the stage of blastocyst.

В последние годы отмечается новая волна интереса к проблеме клонирования животных и рост числа исследований, направленных на разработку его технологии. Как известно, их началом послужили эксперименты, в которых в качестве кариопластов использовались бластомеры, выделенные из малодифференцированных эмбрионов. К середине 90-х годов почти у всех видов сельскохозяйственных животных были получены клоны, однако они представляли собой генетические копии эмбрионов-доноров, хозяйственная ценность которых, в отличие от взрослой особи, неизвестна. И только после сообщения в 1997 году об овечке Долли (1), когда было показано, что во взрослом организме имеются недифференцированные тотипотентные клетки, которые могут служить источником кариопластов при биотехнологическом реконструировании, стало возможно получать клоны, практически полностью соответствующие своим прародителям по желаемым признакам. В итоге с использованием ядер соматических клеток взрослых особей в качестве кариопластов получили потомство практически всех видов сельскохозяйственных и лабораторных животных, в том числе крупного рогатого скота (2-7), овец (8), свиней (9-14), коз (15), мышей (16-17), кроликов (18) и др.

Большое значение этих исследований обусловлено разнообразием возможностей использования указанной технологии в биологии, сельском хозяйстве и медицине. Так, рассматривается применение клонирования с целью сохранения исчезающих видов животных, для чего создаются криобанки образцов тканей и яйцеклеток, широко обсуждаются разные аспекты проблемы клонирования человека.

Однако результаты работ по клонированию животных нестабильны, а определенные успехи все еще носят в большей степени эмпирический характер из-за отсутствия достаточных знаний о фундаментальных механизмах репрограммирования кариопластов цитопластами и факторах, влияющих на этот процесс. Отдельные принципиальные теоретические положения, ставшие основой стратегии получения овечки Долли, в частности вопрос о стадии клеточного цикла ядер кариопластов и степени активации цитоплазмы клеток-реципиентов (цитопластов), в последнее время не подтверждаются в исследованиях других авторов (3, 4).

По современным представлениям, для полноценного эмбриогенеза с последующим развитием до взрослого организма в реконструированных клетках должна сохраняться необходимая плоидность хромосом, а активация всей системы генов ядра соматической клетки в ходе репрограммирования осуществляться в строгой очередности. Только при успешном взаимодействии ряда сложнейших биологических механизмов, а также регулирующих их факторов, из которых многие остаются плохо изученными, достигается рождение живого потомства. В этой связи требуется углубленное изучение процессов, происходящих при экспериментальных манипуляциях на каждом технологическом этапе, - от эффекта полноты энуклеации яйцеклеток при получении цитопластов до влияния системы культивирования на развитие реконструированного эмбриона.

Из сельскохозяйственных животных наиболее привлекательным объектом для клонирования является крупный рогатый скот. Но корова - малоплодное животное и не может дать достаточно яйцеклеток, причем извлекать их хирургическим методом очень трудоемко и дорого. Поэтому использование при клонировании крупного рогатого скота яйцеклеток, созревших in vitro, представляется перспективным. Но, как известно, для эмбрионов, полученных in vitro, характерно некоторое понижение жизнеспособности вследствие неадекватности условий созревания, оплодотворения и культивирования. Кроме того, в отличие от многоплодных животных, у которых сразу после активации и кратковременного культивирования реконструированных клеток проводят их хирургическую трансплантацию реципиенту, у крупного рогатого скота такой способ неприемлем опять-таки из-за большой трудоемкости. Поэтому реконструированные эмбрионы крупного рогатого скота целесообразно культивировать in vitro до стадии бластоцисты и затем вводить в матку коров-реципиентов нехирургическим методом.

Цель нашей работы заключалась в получении клонированных эмбрионов крупного рогатого скота на основе использования ядер соматических клеток и дозревавших in vitro ооцитов соответственно в качестве кариопластов и цитопластов.

Методика. Исследования проводили на ооцитах крупного рогатого скота, дозревавших in vitro, и клетках кумулюса взрослых животных, использованных в качестве цитопластов и кариопластов при реконструировании эмбрионов. Технология получения реконструированных эмбрионов путем трансплантации кариопластов в энуклеированные ооциты включала выделение яйцеклеток (ооциты дозревали до стадии метафазы II in vitro) и их энуклеацию с целью получения цитопластов; выделение клеток - источников кариопластов из культуры ткани и их трансплантацию в перивителлиновое пространство цитопластов; слияние кариопласта с цитопластом и образование реконструированных клеток; активацию реконструированных клеток; культивирование реконструированных эмбрионов; трансплантацию клонированных эмбрионов животным-реципиентам (принципиальная схема представлена на рисунке).

Подготовку зрелых ооцитов in vitro осуществляли по методике, предложенной в лаборатории клеточной инженерии Всероссийского НИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных (ВНИИФБиП). Яичники коров, полученные после промышленного забоя на мясокомбинате, помещали в фосфатно-солевую среду Дюльбекко ("ПанЭко", Россия) при температуре 30 С. После транспортировки в течение 2-3 ч из антральных фолликулов диаметром 2-6 мм выделяли ооциты методом рассечения (отбирали ооциты с многослойным компактным кумулюсом). Для дозревания ооцитов использовалась среда МЕМ-альфа ("Sigma", США) с добавлением 1 мкг/мл фолликулостимулирующего гормона (ФСГ, "ФСГ-супер", ООО "Агробиомед", ВНИИФБиП, Россия); 0,3 ИЕ/мл хорионического гонадотропина человека ("Intervet", Германия); 0,2 мM пирувата натрия ("Sigma", США). Ооциты культивировали в 4-луночных чашках фирмы "Nunc" (Дания) по 50 комплексов ооцит--кумулюс (КОК) на лунку в 500 мкл среды при температуре 38,5 С под газовой фазой 5 % СО 2 в воздухе. Через 19-20 ч удаляли клетки кумулюса и отбирали для дальнейшей работы ооциты с выделившимся первым полярным тельцем. Часть ооцитов служила контролем на полноценность созревания; их культивировали в течение еще 4 ч, оплодотворяли и затем продолжали культивирование до стадии бластоцисты.

Энуклеацию ооцитов и реконструирование клеток осуществляли микрохирургическим методом (19) на установке, включающей комплект микроманипуляторов ("Narishiga", Япония) и инвертированный микроскоп "Diaphot-TMD" ("Nikon", Япония), оснащенный оптикой дифференциально-интерференционного контраста (DIC по Номарскому). Перед микроманипуляцией ооциты инкубировали в среде Тироде-HEPES (Т-Н) собственного приготовления, содержащей цитоскелетный ингибитор цитохалазин Б (5-7,5 мкг/мл). С помощью энуклеационной микропипетки делали прокол в прозрачной оболочке ооцитов со стороны полярного тельца и удаляли полярное тельце с прилегающей к нему областью цитоплазмы, содержащей метафазную пластинку.

В качестве кариопластов использовали свежеполученные клетки кумулюса округлой формы размером 10-12 мкм, большая часть которых в это время находилась в фазе G0-G1 клеточного цикла (20). Для удаления кумулюсных клеток и их диссоциации использовали 0,1 % раствор гиалуронидазы из семенников быка ("Sigma", США). Единичные кумулюсные клетки инъецировали в перивителлиновое пространство энуклеированных ооцитов, используя прокол в блестящей оболочке, сделанный при энуклеации.

В результате манипуляций формировался клеточный комплекс, состоящий из двух частей - цитопласта (энуклеированного ооцита) и кариопласта (клетки кумулюса), разделенных цитоплазматическими мембранами. Для получения реконструированной клетки слияние цитопласта с кариопластом осуществляли с использованием контроллера электрослияния (Институт биологического приборостроения - ИБП РАН, г. Пущино) в камере с параллельными электродами в среде Циммермана (21), содержащей 0,3 М маннитола, 0,1 мМ МgSO4, 0,05 мM СаCl2, в которую был добавлен бычий сывороточный альбумина (ВSA) до концентрации 0,5 мг/мл. Cначала с помощью переменного тока (500 кГц, 10 с) ориентировали реконструированные клетки между электродами так, чтобы кариопласты и цитопласты располагались перпендикулярно электродам, после чего подавали прямоугольные импульсы постоянного тока (1,5-2,0 кВ/см, 10 мкс; три последовательных импульса с интервалом 30 мин). Через 0,5-1,5 ч после установленного слияния в течение 3 мин активировали реконструированные клетки кальциевым ионофором А 23187 (2 мкМ) с последующим культивированием в среде МЕМ+BSA, содержащей 10 мМ 6-диметиламинопурина (6-DMAP), в течение 3 ч. Приведенные режимы электрослияния и активации были отработаны нами ранее при реконструировании мышиных эмбрионов (22).

Для оптимизации системы культивирования реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота провели три серии экспериментов. В первой эмбрионы культивировали в среде DМЕМ соответственно под газовой фазой 5 % СО 2 в воздухе (I группа) и на фидерном слое, состоящем из клеток кумулюса коровы, под газовой фазой 5 % СО 2 в воздухе (II группа). Во второй серии в качестве модели для испытания новой культуральной системы использовали ооциты, активированные к партеногенетическому развитию. Культивирование партеногенетических эмбрионов проводили в среде KSOM под газовой фазой (по 5 % СО 2 и O2 и 90 % N2) (I группа) и в среде KSOM/АА (с добавлением заменимых и незаменимых аминокислот, а также витаминов по прописям соответственно для среды МЕМ и среды RPMI-1640) под газовой фазой (по 5 % СО 2 и O2 и 90 % N2) (II группа). В третьей серии экспериментов реконструированные эмбрионы культивировали по схеме, использованной для партеногенетических эмбрионов (вторая серия): в среде KSOM под газовой фазой (по 5 % СО 2 и O2 и 90 % N2) (I группа) и в среде KSOM/АА под газовой фазой (по 5 % СО 2 и O2 и 90 % N2) (II группа).

В течение 48 ч после активации среды для культивирования реконструированных клеток были обогащены 4 % BSA, затем 10 % эмбриональной сыворотки теленка (FCS). Реконструированные и партеногенетически активированные эмбрионы культивировали 10 сут при 38,5 °С в микрокаплях (10-12 на 1 каплю объемом 50-60 мкл) под слоем минерального масла ("Sigma", США) на воздухе в увлажненной атмосфере. Развитие эмбрионов оценивали через каждые 24 ч.

Результаты. Выход ооцитов крупного рогатого скота на стадии метафазы II, которая используется для получения цитопластов, при применении предложенной нами системы дозревания in vitro составил в среднем 60,4 % (или 1022 ооцита из 1693). Эффективность энуклеации ооцитов через 20-21 ч после начала процедуры дозревания in vitro достигала 90,0 % (278 из 309). Это обусловлено удобным для проведения манипуляции расположением метафазной пластинки относительно полярного тельца в указанный период: в предварительных экспериментах с использованием флуоресцентной микроскопии мы обнаружили, что через 20-23 ч в 96 % случаев метафазная пластинка находится прямо под полярным тельцем или близко от него (неопубликованные данные), что позволяет полностью энуклеировать ооциты посредством аспирации метафазной пластинки и части ооплазмы в области первого полярного тельца.

В наших экспериментах эффективность электрослияния цитопластов с кариопластами составила 46,3 % (130 слияний из 278) (первоначально режим электрослияния отрабатывали на мышиных эмбрионах). Такие же результаты получены в исследованиях других авторов с соматическими клетками взрослых животных в качестве источников кариопластов (2-7). При реконструировании эмбрионов крупного рогатого скота относительно невысокая эффективность электрослияния обусловлена малой площадью контакта между цитопластом и очень мелким кариопластом (характерные размеры - 150 мкм против 10-12 мкм). Существенное значение имеют также различия между типами клеток по биохимическим свойствам липидов мембран у разных клеточных линий. В связи с этим для каждого нового типа комплексов цитопласт--кариопласт следует уточнять режима электрослияния.

После электрослияния ядро клетки-донора попадает в цитоплазму энуклеированного ооцита и подвергается действию находящихся в ней факторов, инициирующих процессы ремоделирования и репрограммирования, от которых зависит дальнейшее развитие реконструированной клетки. У всех млекопитающих фактор MPF (maturation promoting factor - фактор, способствующий созреванию) блокирует созревание ооцитов на стадии метафазы второго мейотического деления (М II)). Активность MPF сохраняется за счет действия цитостатического фактора (CSF), который предотвращает деградацию циклина Б, входящего в состав MPF, и, как следствие, инактивацию MPF. При высокой активности MPF наблюдается разрушение ядерной оболочки, конденсация хромосом, формирование митотического веретена деления и подавление синтеза ДНК в ооцитах, находящихся на стадии М II.

Известно, что ядро соматической клетки (кариопласт), помещенное в энуклеированный ооцит (цитопласт), подвергается активному действию MPF, в результате чего у него распадается ядерная оболочка, происходит преждевременная конденсация хромосом и переход в состояние, аналогичное стадии метафазы II мейоза. Для того чтобы вывести ядро из этого состояния и запустить митотическое деление реконструированной клетки, ее необходимо активировать. В естественных условиях активация происходит во время оплодотворения яйцеклетки, когда сперматозоид, проходя через цитоплазматическую мембрану, инициирует серию внутриклеточных колебаний концентрации ионов Са++. Вследствие этого снижается регуляторная активность цитостатического фактора и активируется деградация циклина Б, что, в свою очередь, приводит к инактивации MPF и возобновлению митотического цикла.

Серию колебаний концентрации внутриклеточного Са++ с активацией партеногенетического развития ооцита способны также вызывать искусственные активаторы (импульсы электрического тока, этанол, кальциевый ионофор и др.). Однако в большинстве случаев активность MPF после воздействия искусственных активаторов быстро восстанавливается, что приводит к переходу активированных ооцитов под новый метафазный арест, обозначаемый как метафаза III (23, 24). При быстром восстановлении активности MPF, например посредством воздействия на ооцит или реконструированную клетку веществами, которые ингибируют синтез (циклогексимид - CHX) или фосфорилирование белка (6-диметилами-нопурин - 6-DMAP), этого можно избежать (23, 25).

Мы активировали реконструированные клетки кальциевым ионофором А 23187 и использовали для предотвращения перехода в стадию метафазы III 6-DMAP, что позволило получить довольно высокий процент активации.

До настоящего времени к числу факторов, механизм влияния которых на развитие реконструированных эмбрионов неизвестен, относится культивирование in vitro. Так, исследования последних лет свидетельствуют, что очень большое значение для корректной последовательной активации генов кариопласта и дальнейшего развития реконструированных клеток имеет среда культивирования. Изучение экспрессии генов при развитии мышиных эмбрионов от зиготы до стадии бластоцисты показало, что при культивировании в простейшей среде Виттена у 114 генов она была снижена, тогда как в среде KSOM, обогащенной заменимыми и незаменимыми аминокислотами, только 29 генов экспрессировались в недостаточной степени (26).

В наших экспериментах при культивировании реконструированных эмбрионов в среде МЕМ под газовой фазой (5 % СО 2 в воздухе) развитие большинства эмбрионов останавливалось на стадии 8-16 бластомеров и только небольшая их часть (5,3 %) достигала стадии морулы (табл. 1). Однако при той же газовой фазе, но с фидерным слоем, состоящим из клеток кумулюса, 71,9 % (46 из 64) реконструированных эмбрионов развивалось до стадии 2-4 бластомеров, стадии 8-16 бластомеров достигали 60,9 % (39 из 64) эмбрионов и стадий морулы/бластоцисты - 40,6 % (26 из 64), причем через 146 ч культивирования 20,3 % эмбрионов (то есть 13 из 64) находились на стадии морулы, а 20,3 %, или 13 из 64, - на стадии бластоцисты.

Благоприятное влияние кумулюсного фидерного слоя при культивировании обусловлено выделением многими клеточными линиями цитокинов - фактора роста фибробластов (FGF) и фактор ингибирования лейкемии (LIF). В то же время следует отметить, что условия культивирования, создаваемые в этой системе, слишком вариабельны из-за невозможности получить одинаковый фидерный слой в разных экспериментах. Кроме того, для роста клеток фидерного слоя в культуральной среде необходимо поддерживать концентрацию глюкозы 5 г/л, тогда как для развития эмбрионов она должна составлять 1 г/л, причем повышенное содержание глюкозы отрицательно сказывается на развитии эмбриона от зиготы до стадии 8-16 клеток.

Оптимальной средой для культивирования зигот млекопитающих в период нескольких первых делений дробления in vitro является яйцеводная жидкость. Ее минеральный состав для многих видов животных установлен, однако органические компоненты и особенно минорные биологически активные вещества, которые, очевидно, играют очень важную роль в развитии эмбриона, пока что изучены мало.

Нами для культивирования реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота была использована синтетическая среда, соответствующая по минеральному составу яйцеводной жидкости мышей (КSОМ), в которой мышиные реконструированные клетки хорошо развивались до стадии бластоцисты. В отличие от мышиных эмбрионов клетки крупного рогатого скота культивировали под газовой фазой (по 5 % СО 2 и O2, 90 % N2).

Во второй серии этих экспериментов в качестве контрольной модели для испытания новой культуральной системы были использованы ооциты крупного рогатого скота, активированные к партеногенетическому развитию. Такой прием часто применяют при первичном определении качества культуральной системы для выращивания эмбрионов, поскольку эта методика менее трудоемка и в большинстве случаев дает достаточно объективные результаты. При культивировании в среде KSOM под газовой фазой (по 5 % СО 2 и O2, 90 % N2) в деление дробления вступило 53,3 % яйцеклеток, до стадии морулы развилось 20,0 % партеногенетических эмбрионов и только 6,7 % достигли стадии бластоцисты (табл. 2). Однако при добавлении в среду KSOM заменимых и незаменимых аминокислот доля партеногенетических эмбрионов, развившихся до стадии бластоцисты, увеличилась до 22,3 % (см. табл. 2), что свидетельствует об улучшении условий культивирования.

Анализ результатов третьей серии экспериментов, когда по схеме, использованной для партеногенетических эмбрионов, культивировали реконструированные, показал, что практически одинаковая доля последних достигала стадии бластоцисты как в I, так и во II группе (соответственно 22,2 и 23,7 %) (табл. 3). Следовательно, добавление к среде KSOM заменимых и незаменимых аминокислот не оказало видимого влияния на развитие реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота до стадии ранней бластоцисты в отличие от партеногенетических эмбрионов, которые в среде без аминокислот развивались хуже (см. табл. 2). Возможно, различия могли бы быть выявлены при оценке качества этих бластоцист и их способности к дальнейшему росту и выходу из оболочки. Подобное предположение до некоторой степени подтверждают результаты культивирования мышиных зигот в среде KSOM с добавлением и без добавления аминокислот (27): развитие зигот до стадии бластоцисты почти не зависело от обогащения аминокислотами, однако их введение в культуральную среду способствовало значительно более высокому выходу бластоцист из блестящей оболочки и увеличению общего количества клеток (как внутренней клеточной массы, так и трофобласта) (27).

Как оказалось, в культуральной системе на основе среды KSOM и KSOM/АА под газовой фазой развитие реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота происходило с такой же эффективностью, как и на фидерном слое клеток кумулюса. Однако преимуществом системы без использования фидерного слоя является ее более высокая технологичность и стабильность.

Таким образом, разработана технология получения клонированных эмбрионов крупного рогатого скота трансплантацией ядер соматических клеток в энуклеированные ооциты, дозревавшие in vitro, и определены условия осуществления ее основных этапов (дозревание ооцитов in vitro; реконструирование клеток; слияние кариопласта с цитопластом; активация реконструированных клеток; культивирование реконструированных эмбрионов до стадии бластоцисты). При использовании описанной технологии 20,3-23,6 % реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота успешно развивались in vitro до стадии бластоцисты.

Литература

1. W i l m u t I., S c h n i e k e A.E., M c W h i r J. e.a. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature, 1997, 385: 810-813.

2. K a t o Y., T a n i T., S o t o m a r u Y. e.a. Eight calves cloned from somatic cells of a single adult. Science, 1998, 282: 2095-2098.

3. C i b e l l i J.B., S t i c e S.L., G o l u e k e P.J. e.a. Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts. Science, 1998, 280: 1256-1258.

4. V i g n o n X., C h e s n e P., L e B o u r h i s D. e.a. Developmental potential of bovine embryos reconstructed from enucleated matured oocytes fused with cultured somatic cells. C. R. Acad. Sci. III., 1998, 321(9): 735-745.

5. W e l l s D.N., M i s i c a P.M., T e r v i t H.R. e.a. Adult somatic cell nuclear transfer is used to preserve the best surviving cow of the Enderby Island cattle breed. J. Reprod. Fertil. Dev., 1998, 10: 369-378.

6. G o t o Y., K a n e y a m a K., K o b a y a s h i S. e.a. Birth of cloned calves derived from cultured oviductal epithelial cells of a dairy cow. Anim. Sci. J., 1999, 70: 243-245.

7. K u b o t a C., Y a m a k u c h i H., T o d o r o k i J. Six cloned calves produced from adult fibroblast cells after long-term culture. Proc. Nat. Acad. Sci., 2000, 97(3): 990-995.

8. S c h n i e k e A., K i n g A., R i t c h i e W. e.a. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts. Science, 1997, 278: 2130-2133.

9. P o l e j a e v a I.A., C h e n S.H., V a u g h t T.D. e.a. Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature, 2000, 407: 86-90.

10. O n i s h i A., I w a m o t o M., A k i t a T. e.a. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science, 2000, 289: 1188-1190.

11. B e t t h a u s e r J., F o r s b e r g E., A u g e n s t e i n M. e.a. Production of cloned pigs from in vitro systems. Nat. Biotechnol., 2000, 18: 1055-1059.

12. B o n d i o l i K., R a m s o o n d a r J., W i l l i a m s B. e.a. Cloned pigs generated from cultured skin fibroblasts derived from a H-transferase transgenic boar. Mol. Reprod. Dev., 2001, 60: 189-195.

13. P a r k K.W., C h e o n g H.T., L a i L. e.a. Production of nuclear transfer-derived swine that express the enhanced green fluorescent protein. Anim. Biotech., 2001, 12: 173-181.

14. B o q u e s t A.C., G r u p e n C.G., H a r r i s o n S.H. e.a. Production of cloned pigs from cultured fetal fibroblast cells. Biol. Reprod., 2002, 66: 1283-1287.

15. B a g u i s i A., B e h b o o d i E., M e l i c a n D.T. e.a. Production of goats by somatic cell nuclear transfer. Nat. Biotechnol., 1999, 17: 456-461.

16. W a k a y a m a T., P e r r y A.C.F., Z u c o t t i M. e.a. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. J. Nature, 1998, 394: 369-374.

17. T a m a s h i r o K.L.K., W a k a y a m a T., B l a n c h a r d R.J. e.a. Postnatal growth and behavioral development of mice cloned from adult cumulus cells. Biol. Reprod., 2000, 63: 328-334.

18. C h e s n e P., A d e n o t P.G., V i g l i e t t a C. e.a. Cloned rabbits produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nat. Biotechnol., 2002, 20: 366-369.

19. M c G r a t h J., S o l t e r D. Inability of mouse blastomers nuclei transferred to enucleated zygotes to support development in vitro. Science, 1984, 226: 1317-1319.

20. S c h u e t z A.W., W h i t t i n g h a m D.G., S n o w d e n R. Alterations in the cell cycle of mouse cumulus granulosa cells during expansion and mucification in vivo and in vitro. Reprod. Fertil. Dev., 1996, 8: 935-943.

21. Z i m m e r m a n V., V i e n k e n J. Electric field-induced cell to cell fusion. J. Membrane Biol., 1982, 67: 165-182.

22. К и р и е н к о К.В., Л о г и н о в А.Г., А л г у л я н А.С. и др. Развитие партеногенетических и реконструированных мышиных эмбрионов при разных вариантах активации. В сб.: Управление функциональными системами организма. Мат. Междунар. научн.-практ. Интернет-конф. Ставрополь, 2006: 28-32.

23. S u s k o - P a r r i s h J.L., L e i b f r i e d - R u t l e d g e M.L., N o r t h e y D.L. e.a. Inhibition of protein kinases after an induced calcium transient causes transition of bovine oocytes to embryonic cycles without meiotic completion. Dev. Biol., 1994, 166: 729-739.

24. C o l l a s P., C h a n g T., L o n g C. e.a. Interaction of histon-H1-kinase by Ca++ in rabbit oocytes. Mol. Reprod. Dev., 1995, 40: 253-258.

25. L i u L., J u J.C., Y a n g X. Differential inactivation of maturation-promoting factor and mitogen-activated protein kinase following parthenogenetic activation of bovine oocytes. Biol. Reprod., 1998, 59: 537-545.

26. R i n a u d o P., S c h u l t z R. Effects of embryo culture on global pattern of gene expression in preimplantation mouse embryos. Reproduction, 2004, 128: 301-311.

27. B i g g e r s J.D., M c g i n n i s L.K., R a f f i n M. Amino acids and preimplantation development of the mouse in protein-free potassium simplex optimized medium. Biol. Reprod., 2000, 63: 281-293.

Размещено на Allbest.ru