Получение трансгенных мышей, экспрессирующих в клетках коркового вещества волос шерсти белок медузы, флуоресцирующий в зеленой области спектра

Размещено на http://www.allbest.ru/

ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ В КЛЕТКАХ КОРКОВОГО ВЕЩЕСТВА ВОЛОС ШЕРСТИ БЕЛОК МЕДУЗЫ, ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИЙ В ЗЕЛЕНОЙ ОБЛАСТИ СПЕКТРА

М.В. ПОКРОВСКАЯ, Л.К. ЭРНСТ, С.Г. КАДУЛИН,

OBTAINING OF TRANSGENIC MICES THAT EXPRESSING THE FLUORESCENCE-BRIGHT IN GREEN SPECTRAL REGION MEDUSA PROTEIN IN THE CELLS OF FLEECE CORTICAL SUBSTANCE

M.V. Pokrovskaya, L.K. Ernst, S.G. Kadulin, V.G. Lunin, I.Ya. Shikhov, N.A. Zinov'eva

The authors have determined a functional activity of conservative K2.10 promoter control the gene of intermediate filaments of keratin of hair (II type) in sheep. For that the authors made the microinjections to pronucleus of mice zygote of genetic material with the gene of Aequorea victoria protein fluorescence-bright in green spectral region under the control of sheep's K2.10 promoter 730 bp in length. The expression of reporter protein in fleece and differentiate cells of cortical substance of hair stem in six transgenic mices was investigated. The inheritance of transgene in mice F1 and F2 was estimated. It was shown, that the nucleotide sequences of K2.10 promoter may use in experiments on directed gene expression in sheeps and other animals.

Определяли функциональную активность нуклеотидных последовательностей консервативного промотора K2.10, контролирующего ген белка промежуточных филаментов кератина шерсти (II тип) у овец. Осуществляли микроинъекции в пронуклеусы зигот мышей генетической конструкции, содержащей ген улучшенного флуоресцирующего в зеленой области спектра белка медузы Aequorea victoria, под контролем кератинового промотора овец K2.10 длиной 730 п.н. Исследовали экспрессию репортерного белка в волосяном покрове и дифференцирующихся клетках коркового вещества волосяного стержня шести трансгенных мышей. Оценивали характер наследования трансгена у мышей в F1 и F2.

Наряду с изучением фундаментальных вопросов трансгенеза пристальное внимание исследователи уделяют созданию трансгенных особей -- продуцентов биологически активных веществ, а также трансгенных сельскохозяйственных животных, устойчивых к заболеваниям или имеющих улучшенные продуктивные качества. Среди основных задач повышения продуктивности овцеводства большое значение имеет повышение качества и увеличение количества шерсти. При оценке шерсти учитывают следующие показатели: прочность, гибкость, растяжимость и упругость волокна. Твердый кератин, содержащийся в корковом веществе волос, обусловливает механические свойства шерсти (1).

В образовании рогового вещества волос -- кератина -- участвуют белки промежуточных филаментов последнего (intermediate filament, IF) и кератин-связывающие белки (keratin-associated proteins, KAP) (2). Промежуточные филаменты кератина состоят из белков двух типов (I и II), которые совместно экспрессируются в дифференцирующихся клетках коркового вещества нижней части стержня волоса, образуя филаменты диаметром 8-10 нм (3). Гены белков промежуточных филаментов кератина активируются в период формирования стержня волоса (4), в то время как гены, контролирующие синтез KAP-белков, начинают функционировать на более поздних стадиях дифференцировки клеток коркового вещества волос (5). Сравнительный анализ промоторной области генов кератина овец позволил выявить консервативность нуклеотидной последовательности промотора гена белка промежуточного филамента (II тип) кератина шерсти этих животных (4).

Известно, что нити паутины на разрыв в 5 раз прочнее стали и способны вытягиваться на 1/3 своей длины. Как показали исследования во многих лабораториях мира, паутина -- это сложнейший композиционный материал, в состав которого входят белки двух видов и вода (5-6 %). Молекулы белков переплетены, причем часть белка находится в аморфном состоянии, а часть (от 30 до 45 %) -- в виде кристаллов: первые обеспечивают эластичность, а вторые -- прочность (6). Клонирование генов, контролирующих синтез белков паутины, и промотора гена IF белка II типа кератина шерсти овец позволяет создавать трансгенных овец с улучшенными механическими свойствами шерсти (7-9).

На предварительном этапе получения трансгенных сельскохозяйственных животных анализируют тканеспецифическую экспрессию чужеродных белков у модельных животных, которыми служат в основном лабораторные мыши. Создание генетических конструкций, включающих последовательности генов маркерных (репортерных) белков, таких как -галактозидаза Escherichia coli или белок, флуоресцирующий в зеленой области спектра (green fluorescent protein, GFP), медузы Aequorea victoria, позволяет выявить функциональную способность того или иного промотора, обусловливающего экспрессию белков в различных тканях трансгенных животных.

Фотолюминесценция GFP и его мутантных форм легко выявляется в живых и фиксированных формалинальдегидом тканях трансгенных особей с помощью стандартных оптических приборов, имеющих источник длинноволнового ультрафиолетового света и предназначенных для выявления люминесценции флуоресцентных красителей, используемых в гистологии (10-12). ген белок шерсть

Цель наших исследований заключалась в оценке с помощью модельных животных функциональной активности нуклеотидных последовательностей (730 п.н.) консервативного промотора K2.10 (8), контролирующего у овец ген белка промежуточных филаментов (II тип) кератина шерсти. При этом были поставлены следующие задачи: получить трансгенных мышей, экспрессирующих улучшенный белок A. victoria, флуоресцирующий в зеленой области спектра (EGFP), в дифференцирующихся клетках коркового вещества волос шерсти; оценить характер наследования трансгена у экспериментальных животных в F1 и F2; исследовать кожу и волосы трансгенных мышей на наличие флуоресцирующего в зеленой области спектра репортерного белка EGFP; провести иммуногистохимический анализ тканеспецифической экспрессии EGFP на гистологических срезах кожи трансгенных животных.

Методика. Объектом исследования служили гибридные серые мыши, в пронуклеусы зигот которых методом микроинъекции вводили генетическую конструкцию KERSH--EGFP, содержащую ген улучшенного белка A. victoria, флуоресцирующего в зеленой области спектра (EGFP) под контролем промотора K2.10 (13). Первых полученных трансгенных особей скрещивали с белыми нелинейными мышами; трансгенных животных F1 спаривали друг с другом или с нетрансгенными (контроль) особями F1.

Анализ ДНК мышей на содержание нуклеотидных последовательностей генно-инженерной конструкции KERSH--EGFP осуществляли с помощью метода полимеразной цепной реакции (14, 15). Флуоресценцию EGFP в волосяном покрове и клетках волосяных фолликулов оценивали у трансгенных мышей белой окраски с помощью люминесцентного микроскопа OPTON с использованием набора фильтров BP 450-490, FT 510 и LP 520.

Для иммуногистохимического анализа тканеспецифической экспрессии флуоресцирующего в зеленой области спектра белка в волосяных фолликулах взрослых и 2-8-суточных трансгенных особей применяли биотиновый метод окрашивания парафиновых срезов кожи (непрямой авидин) (16). При этом использовали моноклональные антитела мышей к GFP («Sigma», США), а также следующие реактивы: стандартный набор «Novostain Super ABC Kit» (universal) (NOVOCASTRA Lab., Великобритания), содержащий биотинилированные антитела свиньи к иммуноглобулинам мышей, неиммунную сыворотку и авидин-биотин-пероксидазный комплекс; набор «AEC STAINING KIT» («Sigma», США), включающий хромоген-3-амино-9-этилкарбазол (АЭК).

Фотографирование, анализ препаратов кожи и волос в белой и синей областях спектра люминесцентного микроскопа осуществляли с помощью цифровой камеры Olympus camedia c-4000z (Япония) и компьютерной программы ImageScope Color (ООО «Системы для микроскопии и анализа», Россия). Статистическую обработку данных оценки характера наследования трансгена в F1 и F2 и сопоставление эмпирической и теоретической частоты наследования трансгенных последовательностей проводили с использованием критерия 2.

Результаты. Мы основывались на гипотезе о моногибридном наследовании трансгена при доминантном гетерозиготном (гемизиготном) состоянии последнего у потомков от скрещивания трансгенных и нетрансгенных (контроль) особей. Количество трансгенных особей, полученных нами в F1 от пяти первичных трансгенных мышей, не соответствовало теоретически ожидаемой частоте наследования трансгена (табл.). Среди потомков F2 от скрещивания трансгенных и нетрансгенных особей частота наследования трансгена приближалась к прогнозируемой -- 50 %.

Количество трансгенных мышей, содержащих генно-инженерную конструкцию KERSH-EGFP, в F1 и F2