Размещено на http://www.allbest.ru/

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К СТРУКТУРНЫМ БЕЛКАМ ВИРУСА ТРАНСМИССИВНОГО ГАСТРОЭНТЕРИТА СВИНЕЙ

О.М. СТРИЖАКОВА, В.В. КУРИННОВ, А.А. СТРИЖАКОВ,

Е.А. КРАСНОБАЕВ, О.В. ДЕРЯБИН

Разрабатывали методику получения линии гибридных клеток, секретирующих моноклональные антитела, обладающие специфичностью к полипептидам вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней. Приведена характеристика моноклональных антител по активности в иммунологических реакциях и полипептидной специфичности.

OBTAINING AND CHARACTER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIED TO STRUCTURAL PROTEINS OF PIGS TRANSMISSIBLE GASTROENTERITIS VIRUS

O.M. Strizhakova, V.V. Kurinnov, A.A. Strizhakov, E.A. Krasnobaev, O.V. Deryabin

The authors developed the methodic for obtaining of hybrid cells secreting the monoclonal antibodies specific to polypeptides of pigs transmissible gastroenteritis virus. The character of obtained monoclonal antibodies on the activity in immunologic reactions and polypeptide specificity was presented. It was shown, that these antibodies are useful for creation of monoclonal immunoreagents and development on its basis the tools and methods of differential diagnostics of porcine transmissible gastroenteritis virus and pigs respiratory coronavirus.

Вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС) входит в состав рода Coronavirus семейства Coronaviridae. Кроме него в этот род входят антигенно родственные вирус эпизоотической диареи свиней и гемагглютинирующий коронавирус свиней. В конце 80-х годов прошлого столетия в свиноводческих хозяйствах некоторых стран Западной Европы было обнаружено необычное явление: в отсутствие специфической вакцинопрофилактики и без клинического проявления вируса ТГС резко возросло число свиней, серопозитивных к этому возбудителю (1). Двумя независимыми группами исследователей из респираторного тракта клинически здоровых свиней был выделен ранее неизвестный коронавирус с такими характерными свойствами, как пневмотропность, авирулентность для естественного хозяина и тесное антигенное родство с вирусом ТГС. Выделенный возбудитель получил название респираторный коронавирус свиней (РКВС) (2, 3). В связи с этим возникла необходимость разработки средств и методов лабораторной диагностики для выявления и дифференцирования этого коронавируса. Ввиду близкого антигенного родства вируса ТГС и РКВС диагностические методы обнаружения антигенов этих возбудителей на основе поликлональных иммунореагентов не позволяют их идентифицировать. Наиболее перспективным направлением в исследовании этих возбудителей и разработке новых методов дифференциальной лабораторной диагностики является использование моноклональных антител (МА) (4-6).

В связи с этим целью нашей работы было получение линии гибридомных клеток, стабильно секретирующих моноклональные антитела, специфичные к структурным белкам вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, а также оценка пригодности полученных МА для создания иммунореагентов.

Описание методики. Штаммы вируса ТГС и РКВС были адаптированы к росту в монослое культур следующих клеток: штамм Д-52 (вирус ТГС) -- перевиваемые тестикулы поросенка (ПТП) и почки плода свиньи (СПЭВ), почки свиньи (РК-15), почки сибирского горного козерога (ПСГК); вакцинный штамм Lindholm (вирус ТГС) -- ПТП, СПЭВ, РК-15, ПСГК; штамм ЛУК (РКВС) -- ПТП, СПЭВ; инфекционный титр этих штаммов составлял соответственно 6, 5 и 6-6,5 lg ТЦД50/мл.

Для получения МА, специфичных к вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС, расположенным на пепломерном гликопротеине вириона, было необходимо индуцировать максимальный иммунный ответ на поверхностные антигены этого возбудителя у мышей линии BALB/c -- доноров иммунных спленоцитов. Для этого мышей линии BALB/c иммунизировали препаратом очищенного вируса ТГС. Введение антигена осуществляли подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно и внутриселезеночно 4 раза с промежутком 14 сут (табл. 1). Первое введение осуществляли с полным, второе -- с неполным адъювантом Фрейнда, последующие -- без адъюванта. Бустер-дозу антигена вводили внутриселезеночно или внутривенно.

антитела вирус гастроэнтерит свинья

Оценка эффективности различных схем иммунизации мышей линии BALB/c антигенами вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней

Для определения интенсивности иммунного ответа на антигены возбудителя исследовали сыворотки крови мышей непрямыми методами твердофазного (ТФ ИФА) и гистохимического (ГХ ИФА) иммуноферментного анализа, а также по реакции нейтрализации (РН).

Гибридизацию клеток проводили по методу Kohler с соавт. (7), клонирование гибридных клеток -- в полужидком агаре по методу Gooding (8). Для скрининга гибридом непрямым ТФ ИФА в качестве антигена для сенсибилизации твердой фазы использовали лизаты интактных и инфицированных вирусом ТГС и РКВС клеток ПТП. Антиген сорбировали на 96-луночных пластинах в дозе 2 мкг на одну лунку с использованием фосфатно-солевого буфера (ФБР). Разведение антител и пероксидазного конъюгата проводили в том же буфере с добавлением 1 % бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,05 % Твина-20. В качестве хромогена использовали 0,021 % раствор АBTS (2,2-азиноди-(3-этилбензтиазолин-6-сульфонат). Реакцию оценивали на многоканальном спектрофотометре STAR 30 Plate Reader («Ken Star», США).

Скрининг МА, обладающих вируснейтрализующей активностью к штамму Д-52 (вирус ТГС) проводили экспресс-методом РН. Равные объемы разведений гибридомной жидкости, содержащей МА, и культуральной жидкости, содержащей штамм Д-52 в дозе 100-1000 ТЦД50/мл, инкубировали в лунках пластин в течение 1,5 ч при 37 оС, после чего в лунки вносили по 5104 клеток ПТП и культивировали при 37 оС в СО2-инкубаторе в течение 2-4 сут. Наличие в культуральных жидкостях гибридом вируснейтрализующих МА определяли по отсутствию цитопатического эффекта.

Для скрининга вирусспецифических МА непрямым методом ГХ ИФА использовали культуру клеток ПТП, выращенных в 96-луночных пластинах. В четных вертикальных рядах лунок культуру клеток заражали штаммом Д-52 в дозе 0,1 ТЦД50 на одну клетку, а в нечетных вертикальных рядах инфицирования не проводили. Клеточный монослой фиксировали 80 % охлажденной до -20 оС смесью ацетона и дистиллированной воды. В лунки вносили гибридомную жидкость по 0,05 см3 в разведении 1:2 (на ФБР). Пластины инкубировали в течение 1 ч при 37 оС, затем добавляли антимышиный конъюгат в рабочем разведении на ФБР-БСА по 0,1 см3 в лунку. Связавшийся конъюгат выявляли посредством добавления хромогенного субстрата (50 см3 0,05 М ацетатного буфера, рН 5,0; 8 мг 3-амино-9-этилкарбазола, предварительно растворенного в 3 см3 N,N-диметилформамида; 0,08 см3 33 % раствора перекиси водорода). Результаты оценивали под инвертированным микроскопом.

Препаративные количества МА выделяли из асцитической жидкости мышей линии BALB/c, которым внутрибрюшинно вводили неполный адъювант Фрейнда (0,5 см3), а через 2-7 сут -- 1-2 млн гибридных клеток в 1 см3 среды ДМЕМ. Моноклональные иммуноглобулины очищали, 2-кратно высаливая сульфатом аммония при 45 % насыщении. Осадок глобулинов после второго высаливания растворяли в минимальном объеме 0,25 М раствора NaCl на 0,01 М ФБР (pH 8,0), содержащего 0,04 % азида натрия. Гельпроникающую хроматографию проводили на ультрагеле АсА-34 по рекомендациям фирмы-изготовителя. Фракции, содержащие IgG, объединяли, концентрировали высаливанием сульфатом аммония при 45 % насыщении; осадок отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин, растворяли в минимальном объеме 0,02 М ФБР (pH 7,2-7,4) и диализовали до полного удаления сульфат-ионов против требуемого буфера. Радиоиммунопреципитацию (РИП), электрофоретическое разделение полипептидов и иммуноблотинг проводили по методу Laemmli (9).

Наивысшие титры вируснейтрализующих антител выявлены в сыворотках крови мышей после 4-кратного введения антигена (см. табл. 1, схемы II и IV). При этом если после введения антигена в бустер-дозе внутривенно титр антител увеличивался в 2 раза, то при введении в селезенку -- в 10 раз.

В результате двух процедур гибридизации нами было получено 24 клона гибридом, секретирующих МА к вирусу ТГС, у пяти из которых после 2-кратного клонирования секреция МА прекратилась. Данные по активности и стабильности секреции МА остальных 19 клонов гибридом представлены в таблице 2.

Оценка активности вирусспецифических моноклональных антител в культуральных жидкостях гибридом различными методами скрининга

Вторичная проверка 19 клонов, обладающих вирусспецифической секрецией, показала, что 18 из них секретировали МА, которые вступали в реакции с антигенами всех испытанных штаммов вируса ТГС и штамма ЛУК РКВС при непрямом ТФ ИФА, то есть эти моноклональные антитела обладают специфичностью к консервативным антигенным детерминантам вируса ТГС. Один клон продуцировал МА, которые реагировали с антигенами всех штаммов вируса ТГС и не вступали в реакцию с антигенами РКВС.

Каждый вид МА мы проверяли на конкурентоспособность с остальными видами за связывание с определенными эпитопами вируса ТГС (штамм Д-52). По этому признаку МА распределились на восемь групп. При этом было установлено, что МА в двух группах связывались с антигенными детерминантами, расположенными на нуклеопротеине N вируса ТГС (штамм Д-52). В четырех группах МА вступали в реакцию с антигенными детерминантами, расположенными на пепломерном гликопротеине белка Е2 вируса ТГС (штамм Д-52); МА двух клонов (Т3Е5.1 и Т3С11.1) не реагировали с антигенами вируса ТГС в иммуноблотинге. Вероятно, последние обладали специфичностью к конформационно-зависимым антигенным детерминантам, которые разрушаются в процессе подготовки антигенов для электрофоретического фракционирования (антигены подвергали кипячению и воздействию додецилсульфата натрия).

Изотип МА определяли методом ТФ ИФА с использованием набора «Calbiochem hybridoma sub-isotyping kit mouse». Семь видов МА имели изотип IgG2a, один -- IgM. Активность выделенных иммуноглобулинов определяли в реакциях диффузной преципитации (РДП) и РН, непрямых вариантах ТФ ИФА и ГХ ИФА (табл. 3).

Оценка активности моноклональных антител, специфических к антигенам вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, в иммунологических реакциях и изотип моноклональных антител (МА)

Итак, нами получено 19 линий гибридных клеток, стабильно секретирующих моноклональные антитела, обладающие специфичностью к структурным белкам вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней. Эти антитела пригодны для создания моноклональных иммунореагентов и разработки на их основе средств и методов дифференциальной диагностики вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторного коронавируса свиней.

ЛИТЕРАТУРА

Regula G., Lichtensteiger C.A., Mateus-Pinilla N.E. е.а. Comparison of serologic testing and slaughter evaluation for assessing the effects of subclinical infection on growth in pigs. J. Am. Vet. Med. Assoc., 2000, 15, 217(6): 888-895.

Carman S., JosephsonG., Mc Ewen B. е.а. Field validation of a commercial blocking ELISA to differentiate antibody to transmissible gastroenteritis virus (TGEV) and porcine respiratory coronavirus and to identify TGEV-infected swine herds. J. Vet. Diagn. Invest., 2002, 14(2): 97-105.

Furuushi S., Syimisu Y. Multiplication of low and hige cell culture passagen strains TGEV in orgaans new born piglets. Vet. Microbiol., 1979, 3: 169-176.

Воллер А.А., Бидуэлл А. Иммуноферментные реакции в диагностической медицине. Теория и практика. Бюл. ВОЗ, 1977, 53: 38-45.

Дзантиев Б.Б., Канатников А.Н., Парбузин В.С. Классификация и характеристика методов иммуноферментного анализа. В сб.: Методы иммуноферментного анализа в биологии и медицине. М., 1983: 37-51.

Kim L., Hayes J., Lewis P. е.а. Molecular characterization and pathogenesis of transmissible gastroenteritis coronavirus and porcine respiratory coronavirus field isolates co-circulating in a swine herd. Arch. Virol., 2000, 145, 6: 1133-1147.

Kohler G., MilsteinC. Continuous culture of fused cells secreting antibody of рredefined specificity. Nature, 1975, 256, 5517: 495-497.

Gooding J.V. Antibody production by hybridomas. J. Immun. Meth., 1980, 39, 4: 285-308.

Laemml i U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, 227: 61-67.

Размещено на Allbest.ru