Использование метода полимеразной цепной реакции в ветеринарно-санитарной экспертизе лейкоза

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

Южно-Уральский аграрный университет

Использование метода полимеразной цепной реакции в ветеринарно-санитарной экспертизе лейкоза

Сафронова О.С.

Лыкасова И.А.

Иманбаев Т.К.

г. Троицк

Аннотация

нативный молоко лейкоз скот

В статье рассматриваются аспекты практического применения современных лабораторных методов при ветеринарно-санитарной экспертизе лейкоза крупного рогатого скота. Обоснована необходимости экспертизы нативного молока перед переработкой. Изложены результаты проведенных исследований по выявлению уровня распространенности лейкоза в Северном регионе Казахстана. Внутри групп инфицированность скота варьировала от 60 до 75% - при диагностике методом РИД (реакции иммунодиффузии в агаровом геле) и от 56 до 85% - при ПЦР (метод полимеразной цепной реакции, анализ по гену - gag-). Особое внимание уделено его вирусогенетической характеристике. Методом ПЦР-ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов, анализ по гену - env) выявлено два подтипа - бельгийский и австралийский. По степени распространения бельгийский тип составляет 98%. При анализе проб сырого молока методом ПЦР (анализ гена - gag-) был выявлен провирус лейкоза в 53% образцах.

Ключевые слова: метод ПЦР, метод ИФА, бычий лейкоз, BLV, молоко, вирус, праймер, ген, маркер.

Abstract

Use of method pcr in veterinary-sanitary analysis on a leukaemia (BLV)

Safronova O.S.¹, Lykasova I.A.², Imanbaev T.K.³

Safronova Olga Stanislavovna - Postgraduate;

Lykasova Irina Aleksandrovna - Doctor of veterinary Sciences,

Department of veterinary and sanitary examination, Federal state budgetary educational institution south ural agrarian university, Troitsk;

Imanbayev Tolegen Kasymkhanovich - Director,

Republican state enterprise on the right of economic management republican veterinary laboratory committee of veterinary control and supervision ministry of agriculture of the republic of Kazakhstan, v. Zarechnoye, kostanay district, republic of Kazakhstan

The article deals with the aspects ofpractical application of modern laboratory methods in veterinary and sanitary examination of bovine leukemia. The necessity of examination of native milk before processing is proved. The results of studies to identify the prevalence of leukemia in the Northern region of Kazakhstan are presented. Within the groups, the infection rate of cattle varied from 60 to 75% - in the diagnosis by RID (immunodiffusion reaction in agar gel) and from 56 to 85%, in PCR (polymerase chain reaction method, gene analysis-gag-). Special attention is paid to its viral genetic characteristics. By PCR-RFLP (polymorphism of the lengths of restriction fragments, analysis by gene - env-) identified two subtypes - the Belgian and the Australian. According to the degree of distribution of the Belgian type is 98%. In the analysis of samples of raw milk by PCR analysis (gene - gag-) were identified provirus leukemia in 53% of samples. Keywords: method PCR, enzyme-linked immunosorbent assay, leukemia, BLV, milk, sanitary examination, virus, primer, gene, marker.

Основная часть

Улучшение снабжения населения продуктами животноводства является одной из важных проблем агропромышленного комплекса страны. При этом без серьезного контроля безопасности и качества продовольственного сырья и пищевых продуктов, появляется угроза здоровью населения.

Важнейшим мероприятием в решении этого вопросов является научно обоснованная ветеринарно-санитарная оценка продуктов животноводства. Особого внимания заслуживает оценка продукции, полученной от животных, пораженных различными болезнями, в частности, таким распространённым заболеванием, как лейкоз крупного рогатого скота, имеющийся во многих странах мира [1].

Молоко коров, больных лейкозом, по физико-химическим показателям имеет более низкие качественные параметры по сравнению с молоком клинически здоровых животных. Отмечено снижение белка, жира, сухого вещества, молочного сахара, сухого обезжиренного молочного остатка и золы. Кисломолочные продукты и масло, изготовленные из молока лейкозных коров, имеют более низкие качественные параметры, как по органолептическим показателям, так и по химическому составу. Производство творога из молока BIV- и BIV - BLV-инфицированных коров экономически не обосновано, так как затраты времени на производство увеличиваются, а выход продукции несоразмерно снижается [2, 3].

Таким образом, продукция, полученная от скота, больного лейкозом, по технологическим параметрам фактически отличается от продукции здоровых животных в плане снижения классности, что, соответственно, ограничивает возможность его использования для получения высококачественных продуктов переработки. Кроме того, проводятся исследования, которые свидетельствуют о способности лейкоза крупного рогатого скота преодолевать межвидовые барьеры и опасности употребления нативного молока, обладающего инфекционными свойствами [4, 5, 6].

В настоящее время нет четкой системы выявления такого молока перед его переработкой. Методами ИФА можно достаточно эффективно провести индивидуальную диагностику на наличие антител в сыром молоке инфицированных животных (тест-системы BLV Milch-S (Institut Pourquier SAS), Leukosis Milk Screening (IDEXX Montpellier SAS), Ingezim BLV COMPAC 2.0 (INGENASA), Bovine leukemia virus antibody test kit (VMRD)) [7]. Но их применение на, так называемом «сборном» молоке, не всегда технически возможно, достоверно [8] и стандартизировано [9, 10].

Цель и методика исследований

Исследования выполнялись на базе Костанайского областного филиала РГП на ПХВ «Республиканская ветеринарная лаборатория» Комитета ветеринарного контроля и надзора МСХ РК и лаборатории молекулярной генетики ТОО «Казак тулпары» МСХ РК [11, 12, 13]. Объектом исследований являлись биообразцы (кровь и сыворотка - 208, молоко сырое -30)

Выявление у животных лейкоза методом РИД проводилось с использованием стандартной реакции иммунодиффузии (РИД) в агаровом геле с применением диагностикума «Набор препаратов для серологический диагностики лейкоза крупного рогатого скота в реакции иммунодиффузии», производства НПЦ «ДиаВак-АБН» Республика Казахстан.

Для исследований методом ПЦР брались пробы крови животных в вакуумных пробирках с ЭДТА (К2Е, производитель Бельгия), образцы сыворотки РИД-серопозитивных/РИД - серонегивных животных и сырое сборное молоко. Постановку ПЦР проводили с использованием тест-систем «GenPak DNA PCR test BLV» для диагностики лейкоза крупного рогатого скота фирмы «ISOGENE» по гену gag. Экстракцию генетического материала, типирование env-гена вируса для определения подвидовой принадлежности с использованием метода гнездовой ПЦР (праймеры env5032 env5099 env5521 env5608) c последующим гидролизом 5U BgLL PvuII BamHI (производство «СибЭнзим») проводили по модифицированной методике, рекомендованной Beier et al 2001 наборами «GenPak PCR Core» [14]. Праймеры производства ООО «Синтол» (Москва)

Результаты исследований

В рамках исследований было проведено 208 анализов биобразцов на лейкоз крупного рогатого скота (ВЛКРС) методом РИД из трех регионов Северного Казахстана. Выявлено 143 головы скота, сыворотка которых проявила положительную реакцию на лейкоз. При этом в разрезе хозяйств инфицированность варьировала от 60 до 75 процентов (таблица 1). Методом ПЦР нами был обнаружен провирус лейкоза у 64% животных. Область гена, ограниченная специфичными праймерами, составила 346 п.н.

Таблица 1. Наличие провирусной ДНК (область гена gag BLV) среди исследованного по РИД скота трех регионов области / трех хозяйств