ПЦР-анализ меторхоза и микст-инвазий

Размещено на http://www.allbest.ru/

ПЦР-анализ меторхоза и микст-инвазий

Зятьков С.А.¹, Гончаренко Г.Г.², Крук А.В.³, Лысенко А.Н.⁴ (Республика Беларусь)

¹Зятьков Сергей Александрович - старший преподаватель;

²Гончаренко Григорий Григорьевич - доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой;

³Крук Андрей Викторович - кандидат биологических наук, доцент;

⁴Лысенко Анастасия Николаевна - старший преподаватель, кафедра зоологии, физиологии и генетики, биологический факультет,

Гомельский государственный университет им. Франциска Скорины, г. Гомель, Республика Беларусь

Abstract

меторхоз микст инвазия маркер генетический

PCR ANALYSIS OF METORCHOSIS AND MIXED INVASIONS Zyat'kov S.A.¹, Goncharenko G.G.², Kruk A.V.³, Lysenko A.N.⁴ (RepublicofBelarus)

^IZyat'kov Sergey Aleksandrovich - Senior Lecrurer;

²Goncharenko GrigoriGrigor'evich - Doctor of Biological Sciences, Full Professor,

Head of Department;

³Kruk AndreyViktorovich - Candidate of biological sciences, Associate Professor;

⁴Lysenko Anastasia Nikolaevna - Senior Lecrurer,

DEPARTMENT OF ZOOLOGY, PHYSIOLOGY AND GENETICS, FACULTY OF BIOLOGY, FRANCISK SKORINA GOMEL STATE UNIVERSITY,

GOMEL, REPUBLIC OF BELARUS

this article provides information on the life cycle of members of the genus Metorchis. Interspecific relationships between Metorchis spp. are considered based on phylogenetic analysis using the maximum likelihood method. Phylogenetic analysis by the maximum likelihood method, as well as using nuclear (ITS2) and mitochondrial (COI, NDI) DNA loci showed that Metorchis specimens, previously described as M. albidus, M. bilis and M. crassiusculus, represent one species - M. bilis. Characterized molecular genetic markers used to identify pathogens metorchosis and mixed invasions.

Keywords: metorchosis, mixed invasions, molecular genetic markers.

Аннотация

в данной статье приведена информация по жизненному циклу представителей рода Metorchis. Рассмотрены межвидовые взаимоотношения между Metorchis spp. на основе филогенетического анализа с помощью метода максимального правдоподобия. Филогенетический анализ методом максимального правдоподобия, как и с помощью локусов ядерной (ITS2), так и митохондриальной(COI, NDI) ДНК, показал, что особи Metorchis, описываемые ранее как M. albidus, M. bilisи M. crassiusculus, представляют собой один вид - M. bilis. Охарактеризованы молекулярно-генетические маркеры, используемые для идентификации возбудителей меторхоза и микст-инвазий.

Ключевые слова: меторхоз, микст-инвазии, молекулярно-генетические маркеры.

Меторхоз(Metorchosis) - также как и описторхоз является опасным паразитарным заболеванием человека и плотоядных животных, вызванное следующими представителями из класса Trematodaсемейства Opisthorchiidae- Metorchisbilis(Braun, 1890, син.М. albidus Braun, 1893), Metorchisxanthomus (Creplin,1846, син. Metorchisintermedius Heinemann, 1937) и Metorchisorientalis (Tanabe, 1921) [1].

Возбудители меторхоза широко распространены по всему миру. Например, М. опе^аИв встречается в регионах восточной Азии [2]. Паразитами М. ЫИв и М xanthosomus заражены люди не только, в республиках бывшего СССР, а также странах Восточной и Западной Европы [3-6].

В первом промежуточном хозяине - моллюсках сем. ВШупШае представители из рода Metorchis, также как и Opisthorchisfelineus Ь. паразитируют в пищеварительной железе (гепатопанкреасе). Во втором промежуточном хозяине - карповых рыбах сем. Сурпи^е (плотва, красноперка, уклея, лещ, линь, густера) личинки паразитов локализуются в мускулатуре, жабрах и других тканях. И наконец, в окончательном хозяине - хищных рыбоядных птицах и млекопитающих, в том числе и человеке половозрелые мариты паразитируют в жёлчном пузыре и жёлчных ходах печени (Рис.) [7, 8].

Для большинства описторхид характерна полигостальность, то есть широкий спектр возможных окончательных хозяев, который может варьировать в пределах представителей, как различных семейств, так и различных классов [9].

Рис. Схема развития описторхид: 1 - половозрелый паразит; 2 - яйцо; 3 - спороциста; 4 - редия; 5 - церкарий; 6 - рыба, пораженная метацеркариями [10]

Как уже отмечалось ранее, окончательным хозяином меторхов и описторхов помимо рыбоядных птиц и животных как естественного, так и антропогенного происхождения может быть и человек. Так на территории Европы естественным резервуаром O. felineusявляются представители семейств Псовые [11, 12] и Куньи [13, 14]. Что касается территории России и восточной Европы, то там в последнее время антропогенный фактор начинает сильнее преобладать и зараженность домашних животных, таких как кошки и собаки становится более выраженной [15]. Если рассмотреть меторхов, то они в качестве окончательных хозяев, в основном, предпочитают следующих рыбоядных птиц: Большой баклан (Phalacrocoraxcarbo); Обыкновенная колпица (Platalealeucorodia); Могильник (Aquila heliaca);Канюк (Buteobuteo); Курганник (Buteorufinus), Орлан-белохвост(Haliaeetusalbicilla); Хохлатая чернеть (Aythyafuligula); Кряква (Anasplatyrhynchos); Поганка большая (чомга) (Podicepscristatus). Кроме того, M. bilisможет встречаться у тех же хозяев, что и O. felineusвызывая при одновременном присутствии так называемые микст- инвазии [3]. Считается, что у более 60 % больных подтверждённым диагнозом «хронического описторхоза» фактически имеет место микст-инвазия, вызваннаяO. felineusи M. bilis,реже регистрируется моноинвазия O. felineus(30 % больных) и M. bilis(около 8%) [16].

Диагностировать меторхоз, так же как и описторхоз классическими паразитологическими методами анализа достаточно сложно. Использование серологического метода анализа на антитела гельминтов имеет ряд недостатков - в их числе длительность проведения анализа, и зачастую схожесть реакций у близких видов. Выращивание личинок до половозрелых марит в лабораторных животных довольно трудоемко и также требует времени [17]. Использование маркерных генов M. bilisи O. felineusпосредством современных методов специфической диагностики на основе ДНК-технологий не только меторхозов и описторхозов, но и микст-инвазий позволит различать виды паразитозов, усовершенствовать методы лечения и медико-эпидемиологический мониторинг природных очагов меторхоза и описторхоза.

Несмотря на это, определение видовой принадлежности Metorchis spp.до настоящего времени является трудной задачей из-за высокой схожести между существующими видами. Молекулярно-генетические данные, подтверждающие таксономическое положение и позволяющие провести идентификацию Metorchis spp. ограничены. В 2008 г. Кэнг(Kang) и соавт. в Испании отсеквенировали внутренний транскрибируемый спейсерITS1 одного экземпляра Metorchis(называемого bilis) [18]. Ай и соавт. в Китае отсеквенировали спейсеры ITS и митохондриальные локусы CO1 и ND1 из изолятов M. orientalis[19]. Шеховцов и др. предоставили частичные последовательности гена парамиозина M. xanthosomus[20]. Кроме перечисленных, имеется несколько последовательностей ДНК доступных в базе данных NCBI GenBank, включая недавно опубликованную полную последовательность митохондриального генома M. orientalis (NCBI GenBank, No. KT239342) [21]. В совокупности перечисленные выше исследования последовательностей ДНК у Metorchis spp.не позволяют сделать какие-либо окончательные выводы о статусе ранее предложенных европейскими учеными видов этого рода, а именно, M. albidus, M. bilis, M. crassiusculusи M. xanthosomus [3].

Пролить свет на эти вопросы и установить межвидовые взаимоотношения между Metorchis spp.удалось с помощью филогенетического анализа с применением метода максимального правдоподобия (Maximum likelihoodanalysis), который базируется на оценивании неизвестного параметра путём максимизации функции правдоподобия [3, 22].

Для филогенетического анализа были взяты данные как для локусов ядерной (18S рДНК и ITS2), так и митохондриальной(CO1 и ND1) ДНК. Полученные результаты выявили существование только двух отдельных, четко идентифицируемых видов принадлежащих к роду Metorchis, выделенных из различных птиц-хозяев, в том числе идентифицированных первоначально как M. crassiuscullus.Три из протестированных локусов ДНК (ITS2, CO1 и ND1) взятых у уток (Anas, Aythya)отличались от образцов, взятых у других птиц-хозяев (Phalacrocorax, Buteo, Aquila);четвертый взятый локус ДНК (18S рДНК) был идентичен для всех проанализированных описторхид, в том числе и с последовательностями 18S рДНК, общедоступными в базе данных NCBI GenBank[3].

Последовательности ДНК других описторхид, например, Euamphimeruspancreaticus, существенно отличаются от других описторхид, включая все до сих пор отсеквенированные для Metorchis, Opisthorchisи Clonorchisspp.. Хорошо видно, что последовательности M. orientalisзначительно отличаются от M. bilisи M. xanthosomus,и из различной длины ветвей для генов ND1 и CO1, можно сказать, что они не могут использоваться для классификации M. orientalisвпределахOpisthorchiidae. Для обеспечения убедительной реклассификации представителей этого семейства необходим анализ большего количества локусов ДНК [3].

Филогенетический анализ методом максимального правдоподобия, как и с помощью локусов ядерной (ITS2), так и митохондриальной(CO1, ND1) ДНК показал, что экземпляры Metorchis,описываемые ранее как M. albidus, M. bilisи M. crassiusculus,представляют собой один вид. Исходя из приоритета публикации, M. albidus(Braun, 1893) Loos, 1899 и M. crassiusculus (Rudolphi, 1809) Looss, 1899 признаны младшими субъективными синонимами M. bilis (Braun, 1790) Odening, 1962. Помимо этого имеется еще морфологическое сходство подтверждающее результаты, полученные на основе ДНК-анализа [3, 23].

Комбинированный генетический и морфологический анализ выявил существование только двух отдельных, четко идентифицируемых видов среди представителей рода Metorchis, выделенных из различных птиц и млекопитающих, собранных по всей Европе. Существует значительная генетическая изменчивость как у M. bilis, так и у M. albidus, но каких-либо специфических для конкретного вида или региона хозяина закономерностей наблюдаемой внутривидовой изменчивости обнаружено не было [3, 24].

Как уже отмечалось ранее, описторхоз является значимым природно-очаговых заболеваний не только на территории России, но и стран СНГ. Под диагнозом описторхоз могут скрываться несколько заболеваний - описторхоз, меторхоз и клонорхоз - биогельминтозы, которые вызываются различными представителями семейства Opisthorchiidae- Opisthorchisfelineus/O.viverrini, M. bilisи Clonorchissinensis,соответственно. Стандартным методом клинической диагностики описторхоза является копроовоскопия. Однако яйца у описторхид практически не различимы между собой, поэтому этот метод не позволяет корректно определить вид возбудителя [25]. Разработанные относительно недавно серологические методы диагностики оказались также не способными достоверно различать эти виды описторхид из-за большого количества гомологичных белков [26]. В связи с этим актуальным становится подход к диагностике описторхид с применением методов идентификации ДНК, позволяющий дифференцировать паразитозы, вызываемые

O.felineusи M.bilis. В качестве диагностического маркера используется фрагмент генного кластера рибосомальных РНК, включающий ITS2 (Internal Transcribed Spacer 2). Система диагностики разработана в виде мультиплексного ПЦР-анализа и позволяет по результатам единственной ПЦР не только четко детектировать меторхоз или описторхоз, но и дифференцировать паразитов, вызывающих данное заболевание [27, 28].

При апробации данного метода показано, что в исследованной группе пациентов выявляется около 10% микст-инвазий. Другие исследователи, использующие иммунологические методы диагностики, показывали значительно более высокую встречаемость микст-инвазий [25, 26]. Возможно, это связано с тем, что при меторхозе, в отличие от описторхоза, существует другая цикличность (с более длительными перерывами) в яйцепродукции паразита, или длительность инвазии существенно короче серологической реакции пациентов. Решение этих вопросов может быть существенно ускорено при использовании разработанной видоспецифической диагностики описторхидозов - описторхоза и меторхоза. Кроме того, предложенный метод представляется пригодным для использования в практике с целью выявления микст-инвазий O. felineusи M. bilis.

Таким образом, в данной статье представлены данные по жизненному циклу представителей рода Metorchis. Рассмотрены межвидовые взаимоотношения между Metorchis spp.на основе филогенетического анализа с помощью метода максимального правдоподобия. Филогенетический анализ методом максимального правдоподобия, как и с помощью локусов ядерной (ITS2), так и митохондриальной(CO1, ND1) ДНК показал, что экземпляры Metorchis,описываемые ранее как M. albidus, M. bilisи M. crassiusculus,представляют собой один вид - M. bilis. Охарактеризованы молекулярно-генетические маркеры, используемые для идентификации возбудителей меторхоза и микст-инвазий.

Кроме описанных выше список используемых для видовой идентификации молекулярно-генетических маркеров в последнее время пополняется за счет микросателлит (STR) [29, 30], SNP [31] и ISSR [32].

Работа проводилась в рамках темы «Разработка видоспецифичных ДНК- диагностических систем для выявления возбудителей меторхоза и микст-инвазий в промежуточных и дефинитивных хозяевах юга Беларуси» (ГПНИ «Биотехнологии»).

Список литературы /References

1. Судариков, В.Е.Метацеркарии трематод - паразиты пресноводных гидробионтов Центральной России. М.: Наука, 2002. 298 с.

2. Lin J., Chen Y., Li Y. The discovery of natural infection of human with Metorchisorientalis and the investigation of its focus // Chin. J. Zoonoses, 2001. Vol. 17. P. 38-53.

3. Sitko J. Integrative taxonomy of European parasitic flatworms of the genus MetorchisLooss, 1899 (Trematoda: Opisthorchiidae) // Parasitology International, 2016. Vol. 65. P. 258-267.

4. Mordvinov V.A., Yurlova N.I., Ogorodova L.M., Katokhin A.V.Opisthorchisfelineus and Metorchisbilis are the main agents of liver fluke infection of humans in Russia // Parasitol. Int., 2012. Vol. 6., № 1. P. 25-31.

5. Pozio E., Armignacco O., Ferri F., Morales M.A.G.Opisthorchisfelineus, an emerging infection in Italy and its implication for the European Union // Acta Trop, 2013. Vol. 126. № 1. P. 54-62.

6. Armignacco O., Caterini L., Marucci G., Ferri F., Bernardini G., Raponi G., Natalini L., Alessandra B., Morales T., Gomez M.A., Pozio E. Human illnesses caused by Opisthorchisfelineus flukes, Italy // Emerg. Infect. Dis., 2008. Vol. 14. № 12. P. 19021905.

7. Petney T.N., Andrews R.H., Saijuntha W., Wenz-Mucke A., Sithithaworn P. The

zoonotic, fish-borne liver flukes Clonorchissinensis, Opisthorchisfelineus and Opisthorchisviverrini// Int. J. Parasitol., 2013. Vol. 43, № 12-13. - P. 1031-1046.

8. Chen D., Chen J., Huang J., Chen X., Feng D., Liang B., Che Y., Liu X., Zhu C. Epidemiological investigation of Clonorchissinensis infection in freshwater fishes in the Pearl River Delta // Parasitol. Res., 2010. Vol. 107.№ 4. P. 835-839.

9. Сидоров Е.Г. Природная очаговость описторхоза. Алма-Ата: Наука, 1983. 240 с.

10. Ятусевич ^.^.Руководство по ветеринарной паразитологии. Минск: ИВЦ Минфина, 2015. 496 с.

11. Schuster R., Gregor B., Heidrich J., Nockler K., Kyule M., Wittstatt U. A sero- epidemiological survey on the occurrence of opisthorchiid liver flukes in red foxes (Vulpesvulpes) in Berlin, Germany // Parasitol. Res., 2003. Vol. 90. № 5. P. 400-404.

12. Schuster R., Bonin J., Staubach C., Heidrich R. Liver fluke (Opisthorchiidae) findings in red foxes (Vulpesvulpes) in the eastern part of the Federal State Brandenburg, Germany - a contribution to the epidemiology of opisthorchiidosis/ // Parasitol. Res., 1999. Vol. 85. № 2. P. 142-146.

13. Shimalov V.V., Shimalov V.T., Shimalov A.V.Helminth fauna of otter (Lutralutra Linnaeus, 1758) in Belorussian Polesie// Parasitol. Res., 2000. Vol. 86. № 6. P. 528.

14. Shimalov V.Helminth fauna of the stoat (Mustelaerminea Linnaeus, 1758) and the weasel (M. nivalis Linnaeus, 1758) in Belorussian Polesie// Parasitol. Res., 2001. Vol. 87. № 8. P. 680-681.

15. Mordvinov V.A., Furman D.P. The Digenea parasite Opisthorchisfelineus: a target for the discovery and development of novel drugs // Infect. Disord. Drug Targets., 2010. Vol. 10. № 5. P. 385-401.

16. Ильинских Е.Н., Шилов Б.В. Экология и эпидемиология описторхид(Opisthorchisfelineusи Metorchisbilis) // Сборник научных трудов «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии», 2004. Вып. 1. С. 80.

17. Сербина Е.Н., Юрлова Н.И. Участие Codiellatroscheli (Mollusca: Prosobranchia) в жизненном цикле Metorchisalbidus (Trematoda: Opisthorchidae) // Мед. паразитол. и паразитар. бол., 2002. № 3. С. 21-23.

18. Kang S. Molecular identification and phylogenetic analysis of nuclear rDNA se-quences among three opisthorchid liver fluke species (Opisthorchiidae: Trematoda// Parasitol. Int., 2008. Vol. 57. P. 191-197.

19. Ai L. Sequences of internal transcribed spacers and two mitochondrial genes: effec-tive genetic markers for Metorchisorientalis// J. Anim. Vet. Adv.,2010. Vol. 9. P. 23712376.

20. Shekhovtsov S.V. A novel nuclear marker, Pm-int9, for phylogenetic studies of Opisthorchisfelineus, Opisthorchisviverrini,andClonorchissinensis (Opisthorchiidae, Trematoda) // Parasitol. Res., 2009. Vol. 106. P. 293-297.

21. Lu Na. The complete mitochondrial genome of Metorchisorientalis (Trematoda: Opisthorchiidae): Comparison with other closely related species and phylogenetic implications // Infection, genetics and evolution: journal of molecular epidemiology and evolutionary genetics in infectious diseases, 2016. DOI: 10.1016/j.meegid.2016.01.010.

22. Rezac M. Integrative taxonomy and evolutionary history of a newly revealed spider Dysderaninnii complex (Araneae: Dysderidae) // Zool. J. Linnean Soc., 2014. Vol. 172. P. 451-474.

23. Sherrard-Smith E. Distribution and molecular phylogeny of biliary trematodes (Opisthorchiidae) infecting native Lutralutra and alien Neovisonvison across Europe // Parasitol. Int., 2016. Vol. 65. P. 163-170.

24. Mongeau N. Hepatic distomatosis and infectious canine hepatitis in northern Manito-ba// Can. Vet. J., 1961. Vol. 2. P. 33-38.

25. Беэр С.А. Биология возбудителя описторхоза. М.: Тов-во науч. изд-й КМК, 2005. 336 с.

26. Choi M.H. Specific and common antigens of Clonorchissinensis and Opisthorchisviverrini (Opisthorchidae, Trematoda) // Korean J. Parasitol., 2003. Vol. 41(3). P. 155.

27. Брусенцов И.И., Катохин А.В., Сахаровская З.В., Сазонов А.Э., Огородова Л.М., Федорова О.С., Колчанов Н.А., Мордвинов В.А. ДНК-диагностика микст-инвазий Opisthorchisfelineusи Metorchisbilisс помощью метода ПЦР // Медицинская паразитология, 2010. № 2. С. 10-13.

28. BrusentsovI., Katokhin A., Shechovtsov S., Borovikov S., Goncharenko G. Low Genetic Diversity in Wide-Spread Eurasian Liver Fluke Opisthorchisfelineus// PLoS ONE, 2013. Vol. 8 (4). P. 1-12.

29. Гончаренко Г.Г., Зятьков С.А.Микросателлитные ДНК-маркеры в генетической дактилоскопии особей Feliscatusи родственных видов семейства Кошачьи // Известия Гомельского государственного университета имени Ф. Скорины, 2016. № 3. С. 21-25.

30. Гончаренко Г.Г., Зятьков С.А., Крук А.В.STR-маркеры в ДНК дактилоскопии домашних собак Canisfamiliaris L. // Известия Гомельского государственного университета имени Ф. Скорины, 2017. № 3 (102). С. 25-30.

31. Зятьков С.А., Курако И.В. Молекулярно-генетическая дактилоскопия особей Feliscatusакромеланистическихокрасов // Ростовский научный журнал, 2017. № 12. С. 362-366.

32. Козел А.В., Зятьков С.А.ISSR-метод в идентификации особей Elephasmaximus// Academy, 2019. № 12 (51). С. 7-9.

Размещено на Allbest.ru