Эффективность использования лентивирусных векторов для трансформации сперматогенных клеток семенника петухов in vivo

Размещено на http://www.allbest.ru/

Эффективность использования лентивирусных векторов для трансформации сперматогенных клеток семенника петухов in vivo

Н.А. Волкова, А.Н. Ветох*, Л.А. Волкова, Н.А. Зиновьева

Федеральный научный центр животноводства -- ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, Московская область, Российская Федерация

Аннотация

Клетки гонад самцов рассматриваются в качестве перспективных клеток-мишеней для введения рекомбинантной ДНК в рамках получения генетически модифицированных особей с заданными признаками. Использование стволовых клеток семенников, а именно клеток сперма-тогоний, представляет наибольший интерес. Данный тип клеток в ходе дифференциации может давать начало многочисленной популяции зрелых половых клеток у самцов, которые в случае их генетической трансформации могут быть использованы для осеменения самок с целью получения потомства трансгенов.

Цель исследования -- изучить эффективность применения лентивирусных векторов для локальной трансформации клеток сперматогенного ряда в семенниках петухов. Использовали лентивирусный вектор, содержащий репортерный ген ZsGreen под контролем CMV промотора. Трансформацию сперматогенных клеток петуха in vitro осуществляли путем инфицирования вирусным препаратом, in vivo -- посредством множественной инъекции вирусного препарата в паренхиму семенников петухов (n = 5). Эффективность трансформации оценивали по экспрессии репортерного гена ZsGreen в трансфецированных сперматогенных клетках. Успешность использования лентивирусных векторов для генетической трансформации сперматогенных клеток семенника петуха была показана в ходе экспериментов как in vitro, так и in vivo. Эффективность трансформации данного типа клеток в культуре in vitro варьировала от 45 до 57% и составила в среднем 48 ± 4%. В экспериментах in vivo экспрессия гена-репортера ZsGreen в клетках сперматогенного эпителия семенников была обнаружена практически у всех экспериментальных петухов. Количество семенных канальцев с трансформированными клетками сперматогенного ряда варьировало у петухов, исследованных в ходе опыта, от 10 до 22% и составила в среднем 16 ± 2%. При этом эффективность генетической трансформации сперматогенных клеток семенников (эффективность трансгенеза) достигала 1,8 ± ± 0,2%. Полученные результаты подтверждают успешность применения лентивирусных векторов с целью создания особей с генетически измененными половыми клетками методом трансформации сперматогенных клеток семенников петухов in vivo, а также возможность получения потомков с заданными свойствами от этих мужских особей.

Ключевые слова: петухи, сперматогенные клетки семенников, генетическая трансформация, лентивирусный вектор, трансгенез

Abstract

лентивирусный петух трансформация сперматогенный клетка

The efficiency of use lentiviral vectors for the transformation of rooster spermatogenic cells in vivo

Natalia A. Volkova, Anastasiya N. Vetokh,

Lyudmila A. Volkova, Natalia A. Zinovieva

FederalScienceCenterforAnimalHusbandry namedafterAcademyMember L.K. Ernst, Moscowregion, RussianFederation

Male gonadal cells are considered as promising target cells for the introduction of recombinant DNA in the framework of obtaining genetically modified individuals with specified traits. The use of testicular stem cells, namely spermatogonia cells, is of greatest interest. In the course of differentiation, this type of cells can give rise to a large population of mature germ cells in males, which, in the case of their genetic transformation, can be used to inseminate females in order to obtain offspring of transgenes.

The aim of the study was to study the effectiveness of the use of lentiviral vectors for the local transformation of spermatogenic cells in the testes of roosters. A lentiviral vector containing the ZsGreen reporter gene under the control of the CMV promoter was used. The transformation of spermatogenic cells of a rooster in vitro was carried out by infection with a viral preparation, in vivo - by means of multiple injection of a viral preparation into the parenchyma of the testicles of roosters (n = 5). The transformation efficiency was assessed by the expression of the ZsGreen reporter gene in transfected spermatogenic cells.

The success of using lentiviral vectors for the genetic transformation of spermatogenic cells in the testis of a rooster has been shown in both in vitro and in vivo experiments. The transformation efficiency of this type of cells in in vitro culture varied from 45 to 57% and averaged 48 ± 4%. In in vivo experiments, the expression of the ZsGreen reporter gene in the cells of the spermatogenic epithelium of the testes was found in almost all experimental roosters. The number of seminiferous tubules with transformed cells of the spermatogenic row varied in the males studied during the experiment, from 10 to 22% and averaged 16 ± 2%. At the same time, the efficiency of genetic transformation of spermatogenic cells of the testes (efficiency of transgenesis) reached 1.8 ± 0.2%. The results obtained confirm the success of the use of lentiviral vectors in order to create individuals with genetically altered germ cells by the method of transformation of spermatogenic cells of the testicles of roosters in vivo, as well as the possibility of obtaining offspring with desired properties from these males.

Keywords: roosters, testicularspermatogeniccells, genetictransformation, lentiviralvector, transgenesis

Введение

Применение половых клеток самцов рассматривается как один из способов получения сельскохозяйственных животных с измененным геномом, в т.ч. птицы [1, 2]. При этом в качестве клеток-мишеней для введения рекомбинантной ДНК могут использоваться как зрелые мужские половые клетки -- спермии, так и их предшественники на более ранних сроках дифференцировки -- сперматогонии, сперматоциты и сперматиды [3--5]. С точки зрения эффективности трансгенеза из всей популяции клеток сперматогенного эпителия главный интерес представляет генетическая модификация сперматогонии. Данный тип клеток относят к стволовым клеткам семенников [6]. В процессе дифференцировки они дают начало значительной популяции зрелых мужских половых клеток [7]. Исходя из этого генетическая трансформация половых клеток самцов на стадии сперма-тогоний позволяет повысить эффективность трансгенеза по сравнению с проведением генно-инженерных манипуляций с другими типами сперматогенных клеток, в т.ч. спермиями.

Генетическая трансформация сперматогоний возможна с использованием двух методических подходов: 1) трансфекцией культуры данных клеток in vitro с дальнейшим их введением в семенники самцов-реципиентов, подвергшихся химической стерилизации, и 2) трансформацией клеток сперматогенного ряда in vivoпутем инъекционной обработки генной конструкцией непосредственно в семенники взрослых особей [8--11]. С точки зрения материальных и временных затрат наиболее предпочтительным является второй подход, так как манипуляции проводятся на взрослых самцах, что сокращает сроки получения трансгенных особей. Генетическая трансформация сперматогенных клеток, в том числе спер-матогоний, in vivoвозможна с использованием векторов, основанных на ретро- и лентивирусах. Метод базируется на их природной способности переносить рекомбинантную ДНК в соматические клетки. Таким образом, применение генных конструкций, которые получены на основе этих вирусов, позволяет осуществлять трансформацию отдельных органов и тканей уже во взрослых особях. Ранее нами была показана возможность использования ретровирусных векторов для локальной трансформации клеток семенников петухов и хряков [12]. Мы изучили эффективность использования лентивирусных векторов для генетической трансформации сперматогоний петухов in vivo.

Материалы и методы

В работе использовали лентивирусный вектор, содержащий репортерный ген ZsGreenпод контролем CMV промотора. Источником генной конструкций был выбран вирусный препарат.

Трансформацию культуры клеток сперматогоний петуха in vitroвыполняли с помощью инфицирования препаратом, содержащим рекомбинантный лентивирус. Эффективность заражения клеток определяли как отношение количества полученных генетически трансформированных клеток к общему числу клеток, подвергшихся инфицированию.

Внесение генных конструкций в паренхиму семенников петухов (n = 5) in vivo проводили путем множественных инъекций вирусного препарата (5--8 инъекций на семенник).

По достижении половозрелости от опытных самцов отбирали пробы тканей семенников для анализа экспрессии рекомбинантного белка с использованием флуоресцентной микроскопии. Гистологические срезы толщиной 5 мкм готовили на криостате. От каждого самца проанализировали не менее 15 гистологических срезов.

Результаты и обсуждение

Для оценки возможности использования генных конструкций на основе лентивирусного вектора вначале был проведен ряд исследований по трансформации клеток сперматогоний петухов in vitroв культуре. Использование лентивирусного препарата в проведенных экспериментах показало эффективность трансформации клеток-мишеней у петухов, а количество модифицированных клеток варьировало от 45 до 57% и составляло в среднем 48 ± 4%.

Результаты, полученные в ходе in vitroисследований, послужили заделом для проведения дальнейших опытов по переносу рекомбинантной ДНК in vivo в сперматогенные клетки петухов.

Ранее в наших исследованиях было изучено, что оптимальным периодом для проведения биоинженерных манипуляций с клетками сперматогенного эпителия у петухов является возраст от 1 до 8 недель [13]. В этот возрастной период популяция сперматогенных клеток в семенных канальцах преимущественно представлена сперматогониями и клетками Сертоли. Используя эту наработку, введение генной конструкции проводили в семенники петухов, подобранных по возрасту, который составил 2 месяца.

По достижении половозрелости у опытных петухов была изучена экспрессия репортерного гена ZsGreenв клетках сперматогенного эпителия. Наличие трансформированных флуоресцирующих сперматогенных клеток в семенных канальцах семенников было установлено у всех опытных петухов. Количество семенных канальцев на одном срезе, в которых наблюдались трансформированные клетки, варьировало от 10 до 22% в зависимости от индивидуальных особенностей самцов, что составило в среднем 16 ± 2% (табл. 1).

При этом в одном семенном канальце среднее число трансформированных клеток сперматогенного ряда составило 12 ± 1% при общей эффективности трансгенеза (отношение числа трансформированных сперматогенных клеток к их общему числу во всех исследованных семенных канальцах) 1,8 ± 0,2%.

Таблица 1Эффективность использования лентивирусного вектора для генетической трансформации клеток семенников петухов in vivo

Примечание: * среднее число трансформированных клеток в одном семенном канальце -- отношение числа трансформированных сперматогенных клеток к общему числу исследованных семенных канальцев;

** общая эффективность трансгенеза -- отношение числа трансформированных сперматогенных клеток к их общему числу во всех исследованных канальцах.

Table Efficiency of using a lentiviralvector for genetic transformation of rooster testicular cells in vivo