Биологическое тестирование ветеринарной инновационной лекарственной формы

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности

Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал

ФГБОУ ВО «ВолгГМУ» Минздрава России

ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет»

Биологическое тестирование ветеринарной инновационной лекарственной формы

А.В. Локарев, С.А. Гринь, М.А. Огай,

И.Н. Матвеева, А.И. Сливкин, А.С. Беленова

АННОТАЦИЯ

Импорт ветеринарных препаратов в России неуклонно растет. Процессы импортозамещения в данной области развиваются недостаточно активно, поэтому Российское производство находится в зависимости от импортных поставок лекарственных субстанций и оборудования. Анализ имеющихся на сегодняшнем рынке отечественных ветеринарных препаратов, показал, что они не обеспечивает его в полном объеме. В лучшем случае покрытие спрос-предложение, составляет 15-20 % и эта тенденция стала закономерной с конца прошлого века. Развитие ветеринарной фармации может идти по различным направлениям и включать разработку, исследования, изготовление, стандартизацию, хранение и реализацию кормовых добавок и лекарственных препаратов для животных. Не все средства по уходу за животными подлежат Государственной регистрации, при которой достаточно основательно оцениваются показатели безопасности. Оценка части из них проводится только на соответствие требованиям Технического регламента Таможенного союза «О безопасности парфюмерно-косметической продукции» и, соответственно, существуют определенные риски попадания на рынок средств, не отвечающих всем показателям безопасности.

Необходимость внедрения ускоренных скрининговых методов и тест-систем обуславливается исследованием большого числа проб на соответствие требованием безопасности. В связи с этим, актуальным является интегральный контроль безопасности продукции на основе биотестирования, по определению острой или общей токсичности. Для оценки токсичности продукции применяют биотестирование с использованием животных, одноклеточных организмов и клеточных культур. В этом ключе, с успехом можно применять биотесты, используя Parametium caudatum и сперматозоиды быка. Биологические исследования на Parameсium caudatum - в ходе эксперимента анализируются их размножение, рост, характер движения, и время остановки. Среди всего многообразия микроорганизмов, парамеции являются одним из наиболее удобных тест-объектов для медико-экологических, фармакокинетических и токсикологических исследований, так как изучены хорошо, имеют большие размеры, позволяющие работать с отдельными организмами. Экспресс- метод оценки in vitro (на культуре подвижных клеток сперматозоидов быка), основан на регистрации изменений зависимости двигательной активности сперматозоидов от времени воздействия испытуемых проб.

Ключевые слова: биотестирование, Parametium caudatum и сперматозоиды быка, скрининг, ветеринария, животноводство.

BIOLOGICAL TESTING OF VETERINARY INNOVATIVE DOSAGE FORMS

ABSTRACT

Import of veterinary drugs in Russia is steadily growing. Import substitution processes in this area are not developing actively enough, so Russian production is dependent on imported supplies of medicinal substances and equipment. Analysis of the veterinary drugs available on the market today has shown that it does not provide it in full. In the best case, the supply-demand ratio is 15-20 %, and this trend has become natural since the end of the last century. The development of veterinary pharmacy can go in the direction of research, first of all, the raw material base, as well as the development, research, production, standardization, storage and sale of medicines and feed additives for animals. Animal care products often do not belong to medicinal products and are not subject to State registration, which is a fairly thorough assessment of safety indicators. The assessment is carried out only when confirming compliance with the requirements Of the technical regulations of the Customs Union "on the safety of perfume and cosmetic products" and, accordingly, there are certain risks of entering the market of products that do not meet all safety indicators.

The need to monitor a large number of samples for compliance with safety requirements requires the introduction of accelerated screening methods and test systems. In this regard, integrated product safety control based on bioassay, to determine acute or General toxicity, is relevant. A large number of bioassay methods are known to assess the toxicity of products using animals, single-celled organisms, and sometimes cell cultures. In this vein, you can successfully apply biotests using Parametum caudatum and bull spermatozoa. Biological studies on Ragamesium caudatum-during the experiment, their reproduction, growth, movement pattern, and stopping time are analyzed. Among all the variety of microorganisms, Paramecia are one of the most convenient test objects for medical-ecological, pharmacokinetic and Toxicological studies, as they are well studied and have large dimensions that allow working with individual organisms. The Express method of in vitro evaluation (on the culture of motile cells of bull spermatozoa) is based on recording changes in the dependence of the motor activity of spermatozoa on the time of exposure of the test samples.

Keywords: bioassay, Parametum caudatum and bull spermatozoa, screening, veterinary medicine, animal husbandry.

ВВЕДЕНИЕ

Обеспеченность ветеринарии и животноводства лекарственными средствами и БАВ отечественного производства снижается с начала девяностых годов прошлого века и на настоящее время составляет до 15 % от объема необходимого рынку. К 2020 году планировалось [1] увеличение доли продукции отечественного производства в общем объеме потребления на внутреннем рынке до 50% в стоимостном выражении, повышение доли инновационных препаратов до 60%; увеличение экспорта фармацевтической продукции в 8 раз; обеспечение лекарственной безопасности РФ; увеличение доли отечественных фармацевтических субстанциий до уровня необходимого для обеспечения выпуска 50% готовых лекарственных форм в денежном выражении и не менее 85% по номенклатуре из списка стратегических лекарственных средств [2-8].

Вступление в ВТО России привело к усилению внимания к использованию фармакологических препаратов и кормовых добавок. Важнейшее место при этом должна занять ветеринарная фармация. Перед ветеринарной фармацевтической промышленностью и ветеринарной фармакологией стоят задачи по разработке, промышленному производству, изучению и внедрению в практику ветеринарии и животноводства эффективных и малотоксичных лекарственных препаратов отечественного производства [8-11].

Вместе с тем, не все средства по уходу за животными [9, 10] подлежат Государственной регистрации, при которой достаточно основательно оцениваются показатели безопасности. Оценка части из них проводится только для подтверждении соответствия требованиям Технического регламента Таможенного союза «О безопасности парфюмерно-косметической продукции» [12] и, соответственно, возможен риск попадания на рынок средств, не отвечающих всем показателям безопасности.

Необходимость внедрения ускоренных скрининговых методов и тест-систем обуславливается исследованием большого числа проб на соответствие требованием безопасности. В связи с этим, актуальным является интегральный контроль безопасности продукции на основе биотестирования, по определению острой или общей токсичности. Для оценки токсичности продукции применяют биотестирование с использованием животных, одноклеточных организмов и клеточных культур [13-15].

Результатом данных исследований явилось разработка мягкой лекарственной формы на основе природного лекарственного растительного сырья - инновационного противоартритного и противоартрозного средства, проведение экспериментальной оценки методик определения токсичности для контроля безопасности и выбора эффективной комбинации.

Проведенные исследования с использованием методик биотестирования на Parametium caudatum и культуре клеток сперматозоидов быка позволили обосновать состав БАВ в качественном и количественном отношении, подтвердить безопасность разработанного препарата и некоторые элементы специфической активности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для получения геля, необходимо получить комплексное спирто-водное извлечение из лекарственного растительного сырья (ЛРС).

Нами были получены жидкие экстракты методом перколяции, с применением в качестве экстрагента спирта этилового 70%. Экстрагирование сырья в батарее из шести диффузоров проводится по принципу противотока, при котором извлечение, полученное из первого диффузора, направляется во второй, извлечение, полученное из второго диффузора, направляется в третий и т. д. Все шесть доз экстрагента при таком способе экстрагирования подаются в первый диффузор. После ввода в работу всех диффузоров батареи отбор всех шести порций экстракта производят из головного, шестого диффузора, выводя поочередно, с началом отбора готовый продукции хвостовые диффузоры.

Биологические исследования на Paramedum caudatum заключались в том, что в ходе эксперимента анализировали их размножение, рост, характер движения, и время остановки [16]. Среди всего многообразия микроорганизмов, парамеции являются одним из наиболее удобных тест-объектов для медико-экологических, фармакокинетических и токсикологических исследований, так как изучены хорошо, имеют большие размеры, позволяющие работать с отдельными организмами. Для них разработаны методы культивирования, обеспечивающие необходимую стандартизацию культуры относительно недорогими методами, и среди них отсутствуют патогенные формы [17, 18]. Парамеции широко используются в фармакологии, как биологическая модель для скрининга лекарственных средств антиоксидантного (регулирующего перекисное окисление липидов) и мембраностабилизирующего типов действия. Парамеции способны вырабатывать защитные реакции, направленные на ослабление повреждающего воздействия различных раздражителей, причем устойчивость к раздражителям некоторое время после его удаления сохраняется. Это свойство парамеций используют для скрининга природных соединений, обладающих адаптогенными свойствами. В медицинских и микробиологических исследованиях существуют различные модификации микроскопического счета. Для проведения эксперимента из взвеси с организмами забирают несколько капель и подсчитывают под микроскопом число инфузорий. Микроскопический метод позволяет проводить визуальные наблюдения за изменениями функциональных и структурных показателей парамеций под влиянием веществ различной природы в условиях как острого, так и хронического экспериментов. В качестве фармакологического индикатора (токсиканта), преимущественно повреждающего липидную часть мембраны, предлагается пероксид водорода 1 %, который расщепляется до перекисных радикалов in vivo, инициирующих процесс перекисного окисления [19, 17, 18] липидов (ПОЛ) мембран; фармакологическим индикатором, повреждающим преимущественно структуру белковой биомембраны является 14 % этиловый спирт, приводящий к денатурации и ферментных, и мембранных белков [17-21]. В качестве исследуемых объектов были использованы жидкие спирто-водные комбинации (после удаления жидкой фракции) и растворения в воде очищенной.

Нами был использован экспресс-метод оценки in vitro (на культуре подвижных клеток спермы быка). Методика основана на регистрации изменений зависимости двигательной активности сперматозоидов от времени под воздействием агентов, содержащихся в экстракте из испытуемых проб. Те ст-функцией (измеряемый параметр) являлась подвижность суспензии половых клеток m, которая пропорциональна концентрации сперматозоидов cm и среднему модулю скорости движения клеток v: m=cmv. Подвижность сперматозоидов m=m(t) для контрольного и опытного образцов регистрировалась анализатором видеоизображений. Анализатор токсичности вычисляет индекс токсического действия It, как отношение средневзвешенного времени подвижности сперматозоидов в испытуемой и контрольной пробе. Критерием отсутствия токсичности в испытуемой пробе служила величина индекса токсичности более 80% и менее 120. В качестве контрольной пробы готовился глюкозо-цитратный буфер (глюкоза - 0.4 г; цитрат натрия трехзамещенный - 0.1 г; вода дистиллированная - 10.0 см³) [22].

ветеринарный инновационный лекарственный биотестирование

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Разработано комплексное спирто-водное извлечения из 13 объектов лекарственного растительного сырья.

Несмотря на многокомпонентность состава, основной упор был сделан на полифенольную группу соединений, представленную флавоноидами. Многокомпонентное извлечение сочетает в себе ромашку (цветы) 0.04 части, календулу (цветки) 0.05 частей, тмин (плоды) 0.03 части, сосну (почки) 0.50 частей, тысячелистник (трава) 0. 05 частей, мяту (лист) 0.16 частей, шиповник (плоды) 0.06 части, фенхель (плоды) 0.30 част, солодку (корень) 0.25 частей, полынь (трава) 0.40 частей, чабрец (трава) 0.15 частей, зверобой (трава) 0.05 частей, чистотел (трава) 0.02 части.

Гель получали, сочетая полученное комплексное извлечение (предварительно включенное в структуру липосом), для усиления противоартритной и противоартрозной активности, с дополнительными ингредиентами.

В геле присутствовал комплексный экстракт из лекарственного растительного сырья - 13 наименований, экстракт мартини душистой, мумие, гидролизат коллагена, натрия гидроксид, оливковое масло очищенное, карбопол, глюкозамина гидрохлорид, глицерин, феноксиэтанол, этилгек- силглицерин, полиэтиленгликоль стеарат, воду очищенную.

Выбор основы для получения геля, в виде кар- бопола, не случаен и является основополагающим этапом разработки состава. Известно, что основа не является индифферентным носителем фармакологически активных веществ, а, напротив, оказывает существенное влияние на терапевтический эффект препарата посредством обеспечения оптимального их высвобождения. Из проанализированных составов, наиболее оптимальной оказался карбопол.

Для оценки безопасности объектов проводили исследования согласно Методическим указаниям по проведению токсикологических исследований ингредиентов косметических средств в эксперименте на животных № 05РЦ/3140 от 30.11.1991 г. и Методам определения и оценки токсикологических и клинико-лабораторных показателей безопасности и безвредности для человека товаров народного потребления, Рег. № 004- 0612 от 18.07.2012 г.

Биологические исследования на Paramecium caudatum

Размер парамеций защищенных разработанными комбинациями меньше, чем в контрольной группе. Однако, по шкале активности, эта экспериментальные группы относится к очень активным и по истечении 3 суток количество парамеций в 3 раза превосходит контроль. Анализ данных, приведенных в таблице 2, подтверждает, что комбинации в экологическом отношении для парамеций благоприятна.

Разработанная комбинация существенно удлиняла время остановки движения парамеций под воздействием клеточных ядов - спирта этилового и пероксида водорода. Удлинение времени прекращения движения парамеций, характеризует мембраностабилизирующую активность разработанной комбинации, под воздействием спирта этилового, подобранные компоненты, которой препятствуют в качественном и количественном соотношении повреждению белковой части биомембраны. Антиоксидантная активность присутствует, так как происходило удлинение времени движения парамеций под воздействием раствора перекиси водорода, что связано со способностью компонентов разработанной комбинации тормозить перекисное окисление липидов мембраны. Наличие мембраностабилизирующего и антиоксидантного эффекта в разработанном комплексе, может характеризовать опосредованно наличие противовоспалительного (противоартритного, противо- артрозного) действия.

Экспресс-метод оценки in vitro (на культуре подвижных клеток спермы быка) Результаты исследования разработанных мазей представлены в таблице 3. Как видно из таблицы 3, компоненты разработанного геля не вызывали изменений зависимости двигательной активности сперматозоидов быка по сравнению с контролем.

Таблица 1