Физиолого-биохимические свойства растений-регенерантов сахарной свеклы в культуре in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

Физиолого-биохимические свойства растений-регенерантов сахарной свеклы в культуре in vitro

Е.Н. Васильченко 1,

О.А. Землянухина 2,

Т.П. Федулова 1

1 - ФГБНУ "Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свеклы и сахара им. А.Л. Мазлумова" 2 - Воронежский государственный университет

Аннотация

Представлены результаты получения растений-регенерантов сахарной свеклы (Beta vulgaris L.), несущих чужеродные гены - индукторы неспецифической устойчивости к фитопатогенам в культуре in vitro. Для проведения генетической трансформации использовали генетическую конструкцию с бактериальным геном mf2 в штамме Agrobacterium tumefaciens. Агробактериальную трансформацию осуществляли методом кокультивирования экспланта с агробактерией. Показано, что для успешного проведения генетической трансформации необходимо в качестве реципиентной системы использовать растительные ткани основания черешка и ткани переходной зоны между черешком семядоли и гипокотилем. Инкубирование эксплантов при температуре 30°С в условиях темноты приводило к увеличению выхода регенерантов. Частота регенерации составила в среднем у переходной зоны 34.8 %, а у черешков 27.4 %.

Наилучшим способом трансформации явилось нанесение поранений за 24 часа до кокультивирования эксплантов. При этом частота регенерации составила 23.7 %. Наиболее благоприятным условием кокультивирования реципиентной ткани с агробактерией явилось однократное погружение эксплантов в суспензию агробактерий с последующим культивированием на агаризованной среде. Молекулярно-генетическая оценка предполагаемых трансгенных растений сахарной свеклы на наличие целевого гена, с использованием специфических праймеров, позволила отобрать 4 растения с геном mf2. В данных растениях был выявлен ДНК-ампликон гена белка-индуктора соответствующего размера. свекла ген регенерант

Биохимическая оценка выявила различия между контрольными и опытными образцами. Установлено увеличение общей пероксидазной активности в 1.5-2.5 раза у опытных образцов. Показаны структурные изменения в изоферментном спектре пероксидазы. Отмечалось появление новых зон изоформы у опытных образцов, по сравнению с контролем. Увеличение ферментативной активности в 2.5 раза (0.03 ФЕ/мл у контрольных растений против 0.08 ФЕ/мл у опытных форм) отмечалось при изучении активности фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Высокая активность ферментов, играющих ключевую роль при окислительно-восстановительных реакциях, имеет тесную взаимосвязь с защитными реакциями растений-регенерантов сахарной свеклы при встраивании чужеродного гена.

Ключевые слова: сахарная свекла, Agrobacterium tumefaciens, регенерация, ферментативная активность, пероксидаза, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа, биохимическая оценка

PHYSIOLOGICAL-BIOCHEMICAL CHARACTERISTICS OF SUGAR BEET PLANTS-REGENERANTS UNDER IN VITRO CULTURE

E. N. Vasilchenko1, O. A. Zemlyanukhina2, T. P. Fedulova1

1Federal State Budgetary Scientific Institution "The A.L. Mazlumov All-Russian Research Institute of Sugar Beet and Sugar" 2Voronezh State University

Results of obtaining sugar beet (Beta vulgaris L.) plants-regenerants bearing alien genes - inductors of nonspecific resistance to phytopathogens under in vitro culture are presented. Genetical structure with the bacterial gene mf2 in Agrobacterium tumefaciens strain has been used to carry out genetic transformation. Agrobacterial transformation has been performed by method of explant co-cultivation with the agrobacterium. It has been shown that it is necessary to use plant tissues of petiole basis and tissues of transitional zone between cotyledon petiole and hypocotyl as a recipient system for successful genetic transformation. Incubation of explants at temperature of 30°С under conditions of darkness has led to gain in yield of regenerants. Frequency of regeneration has averaged 34.8 % in transition zone, and 27.4 % in petioles. The best method of transformation is wounding 24 hours prior to co-cultivation. Here, regeneration frequency is 23.7 %. Single submergence of explants in agrobacteria suspension with subsequent cultivation on agar medium is the most favourable conditions for co-cultivation of recipient tissue with the agrobacterium. Molecular-genetic evaluation of prospective transgenic sugar beet plants for presence of the target gene using specific primers has allowed selection of 4 plants with the gene mf2. A DNA amplicon of the corresponding size of the inducer protein gene was detected in these plants. Biochemical evaluation has revealed differences between control and experimental samples. In the experimental samples, 1.5-2.5-fold increase of total peroxidase activity has been determined. Structural changes in an isozyme spectrum of peroxidase are shown. Appearance of new isoform bands in the experimental samples in comparison with control has been registered. When studying activity of the glucose-6-phosphate-dehydrogenaze enzyme, 2.5-fold increase of enzyme activity (0.03 enzyme unit/ml in control plants vs. 0.08 enzyme unit/ml in experimental forms) is noted. If inserting an alien gene, high activity of the enzymes playing a key role in oxidation-reduction reactions is closely related to defense reactions of sugar beet plants-regenerants.

Keywords: sugar beet, Agrobacterium tumefaciens, regeneration, enzyme activity, peroxidase, glu- cose-6-phosphate-dehydrogenaze, biochemical evaluation

Одной из важных и перспективных проблем в селекции сахарной свеклы является создание сортов и гибридов с повышенной устойчивостью к различным стрессовым факторам внешней среды. Болезни растений, вызванные патогенными грибами, бактериями и вирусами, продолжают наносить серьезный ущерб сельскому хозяйству, несмотря на его интенсивное развитие. Сахарную свеклу поражают различные болезни, что приводит к значительному снижению урожая и ухудшению качества сырья. Так, от корневых гнилей за вегетационный период с каждого гектара теряется до 7.5 и более тонн корнеплодов. Высокая стоимость обработок посевов и экологические нарушения, вызванные применением химических средств защиты растений, заставляют искать новые пути решения данной проблемы [1]. В связи с этим, большое значение приобретает селекция на повышение устойчивости растений к болезням. Использование метода трансгеноза, предусматривающего передачу в растения целевых генов и их экспрессию, способствует решению данной проблемы [2, 3].

При создании трансгенных растений в качестве донора генов устойчивости могут выступать не только близкородственные растения, как в классической селекции, но и организмы, отстоящие далеко от данного растения в плане генетического родства, такие как бактерии, грибы и многие другие. Одним из них является микробный фактор (MF2), который был выделен из клеточных экстрактов Bacillus thuringiensis [4]. Выделенный фактор (MF2), является термостабильным, низкомолекулярным белком и имеет большую степень гомологии с колд-шок белками (cold shock proteins, CSP) видов Bacillus и других бактерий. Действие MF2 заключается в индукции защитных механизмов растения, а не в непосредственном угнетении фитопатогенов [5,6].

Комбинация традиционных способов селекции и методов трансгенеза позволяет эффективно совместить полезные признаки, кодируемые вносимым геном, с набором выходных сортовых характеристик, полученных благодаря многолетнему труду селекционеров.

Для выявления и оценки генетически-модифи- цированных клонов, получение которых становится возможным вследствие интеграции плазмидной ДНК в геном исходного растения, особое значение имеет применение физиолого-биохимических методов. Эпигенетика рассматривает не просто зависимость функционирования генов от последовательности нуклеотидов, но главным образом от химического окружения и взаимодействия его с хромосомами, от метилирования ДНК и др. [7]. Как свидетельствуют литературные данные, высокая активность ферментов, играющих ключевую роль при окислительно-восстановительных реакциях, биосинтезе фенолов, процессах лигнификации, имеет тесную взаимосвязь с защитными реакциями при действии индукторов устойчивости к фитопатогенам [8]. В связи с этим выявление биохимических свойств у регенерантов с геном mf2, обусловленных введением чужеродных генов, является важным и перспективным направлением исследований.

Методика эксперемента

В качестве материалов для исследований были использованы растения сахарной свеклы мужскостерильных форм (МС), фертильных форм (РФ) и линий закрепителей стерильности (О-тип) селекции ВНИИСС. В качестве реципиентной ткани использовали черешки и ткани из области семядольных узлов, содержащих меристематические клетки, компетентные к прямой регенерации побегов in vitro.

Для модификации растений сахарной свеклы использовали метод агробактериальной трансформации. В работе использовали плазмидную конструкцию AGLO+pBilt7 с бактериальным геном mf2 в штамме Agrobacterium tumejaciens, предоставленную лабораторией молекулярной генетики (Джавахия В.Г., ВНИИФ, Голицино, Московская обл.). Трансформацию растений осуществляли методом кокультирования экспланта сахарной свеклы с Agrobacterium tumefaciens.

Выделение суммарной клеточной ДНК, используемой в качестве матрицы для ПЦР, из листьев предполагаемых растений-трансформантов сахарной свеклы проводили по методу Дрейпера и Скотта, с использованием протеиназы К и специфического осадителя ДНК - СТАВ (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide).

Анализ ДНК на наличие искомой ДНК- мишени включал: 1) получение пробы растительной массы и выделение из нее суммарной ДНК; 2) идентификацию искомой ДНК (собственно ПЦР-анализ) и 3) выявление ПЦР-продукта - ам- плифицированного фрагмента ДНК методом эле- трофореза.

Для идентификации гена mf2 сахарной свеклы использовали олигонуклеотидные праймеры следующего нуклеотидного состава:

5'- atc caa aca ggt aaa gtt - 3'

5' - agt ttt ttg taa сgt tag cag с - 3'

Структура белка и его функции, а также нуклеотидная последовательность соответствующего гена, были заявлены в патентной заявке (финский патент Fi 953688, приоритет от 02.08.1995, опубликован в Хельсинки 03.02.1997, международный: РСТ-International от 02.08.1996 г. Dyavakhia e.a.)

Полимеразную цепную реакцию проводили в суммарном объеме 25 мкл. В качестве контролей для ПЦР использовали: 1) для внутреннего контроля - деионизованную воду в качестве матрицы; 2) для отрицательного контроля - ДНК нетрансгенного растения; 3) для положительного контроля - плазмиду, несущую целевой ген. ПЦР проводили в автоматическом режиме на амплификаторе "Терцик" (ДНК-технология, Россия).

Продукты амплификации разделяли с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле в присутствии 0.01% бромистого этидия. Результаты электрофореза визуализировали с помощью системы фото-видеодокументирования DNA-analysis ("ДНК-технология", Россия). Исследуемые образцы сравнивали с положительными и отрицательными контролями, сопоставляя наличие и размеры ПЦР-продуктов с известными ДНК-маркерами.

Активность пероксидазы (ПО) определяли в гомогенатах тканей растений в реакции окисления бензидина [9]. Изоферментный анализ ПО проводили электрофоретически по стандартному методу Дэвиса в вертикальных пластинах ПААГ в окрашивающей смеси [10] в нашей модификации [11] с использованием 50% спиртового раствора 0.1% бензидина, содержащего 6% ацетата натрия (рН 7.0), и 1% раствора перекиси водорода. Окраску в виде коричневых зон ПО проявляли в течение 5-30 мин, после чего гели высушивали на стеклянных пластинах, в целлофане (Балаково), в растворе спирт: глицерин (1:1), а затем сканировали с разрешением 300 dpi [12] .

Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (гл.-6-Ф-ДГ) определяли в присутствии 0.25 мМ NADP+, 1мМ глюкозо-6-Ф в 0.05 мМ трис-нС 1 буфере, рН 7.5 по увеличению оптической плотности при 340 нм.

Расчет относительной общей активности проводили путем отнесения изменения оптической плотности на единицу времени (мин) в мл ферментативного препарата без учета коэффициента молярной экстинкции (именуется в дальнейшем "общая активность", ФЕ/мл) [13,14].

Обсуждение результатов

Для успешного проведения генетической трансформации необходимо правильно выбрать реципиентную систему, так как не все растительные ткани способны к регенерации. Клетки реци- пиентной ткани должны обладать следующими свойствами:

1) быть физически доступны для донорной ДНК;

2) активно делиться и сохранять это свойство после введения чужеродной ДНК;

3) обладать хорошей способностью к регенерации.

Для сахарной свеклы наилучшими эксплантами явились: основание черешков (период культивирования проростков в культуре in vitro 3-4 недели) и переходная зона между черешком семядоли и гипокотилем, изолированная от 7-10 дневных асептических проростков.

Количество регенерантов, образованных в результате прямой регенерации у сахарной свеклы, составило у основания черешка 2-3 побега на эксплант, у переходной зоны - 5-7 и более побегов на один эксплант, что соответствовало 13.6 % у черешков и 27.9 % у переходной зоны (табл.1).

Частота регенерации является необходимым условием проведения агробактериальной трансформации, так как сам процесс проникновения агробактерии в растительные клетки тормозит регенерацию.

В ходе наших экспериментов установлено, что инкубирование эксплантов при температуре на 3-50C выше (т.е. 300С) в условиях темноты приводило к увеличению выхода регенерантов. Частота регенерации составила в среднем у переходной зоны 34.8 %, а у черешков 27.4 %. Наилучшим способом трансформации явилось нанесение поранений за 24 часа до кокультивирования эксплантов. При этом частота регенерации составила 23.7 %, против 13.3 % при поранении непосредственно перед кокультивированием. Наиболее "щадящим" условием кокультивирования реципиентной ткани с агробактерией явилось однократное погружение эксплантов в суспензию агробактерий с последующим культивированием на агаризованной среде, чем кокультивирование эксплантов в жидкой среде с добавлением агробактерий. В первом случае количество регенерирующих эксплантов составило 51.1 %, а во втором 22.1 % [15].

Таблица 1.

Влияние происхождения экспланта на прямую регенерацию растений сахарной свеклы