Определение количества ингибитора трипсина как маркера селекции сортов кукурузы с различной устойчивостью к грибковым заболеваниям

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Определение количества ингибитора трипсина как маркера селекции сортов кукурузы с различной устойчивостью к грибковым заболеваниям

Г.В. Шехватова, В.В. Ашин, Е.Ф. Сотченко

Научно-производственная фирма «Гамма», Пущино, Российская Федерация, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, Российская Федерация, Всероссийский научно-исследовательский институт кукурузы, Пятигорск, Российская Федерация

Аннотация. Устойчивость растений к патогенным грибам является важной селекционной составляющей. Механизмы устойчивости очень разнообразны и могут включать в себя взаимодействия ферментов и их ингибиторов. В связи с этим проведено сравнение содержания ингибитора трипсина (ИТ), как возможного маркера селекции, в зрелых зернах сортов кукурузы с известной устойчивостью к пыльной головне, пузырчатой головне и стеблевой гнили. В качестве изучаемых объектов взяты 6 устойчивых и 12 чувствительных сортов. Для гарантированного извлечения из экстрактов молотых зерен кукурузы только ИТ применялась колоночная аффинная хроматография на трипсин-агарозе в аналитическом варианте. В результате выяснилось, что содержание ИТ варьирует внутри обеих групп сортов кукурузы: в устойчивой группе -- максимум 347 и минимум 162 мкг/г, в чувствительной группе -- максимум 200 и минимум 84 мкг/г. Соотношения максимумов к минимумам (2,3) одинаковы в обеих группах, но максимальное и минимальное содержание почти в два раза выше в группе устойчивых сортов кукурузы. В среднем в устойчивых сортах кукурузы содержание ИТ выше в 1,7 раза. Полученные данные подтверждают возможность использования содержащегося в кукурузных зернах ИТ в качестве маркера при выведении новых сортов кукурузы, устойчивых к пыльной головне, пузырчатой головне и стеблевой гнили.

Ключевые слова: кукуруза, ингибитор трипсина, трипсин-агароза, грибковые патогены, пыльная головня, пузырчатая головня, стеблевые гнили.

Quantitative determination of trypsin inhibitor as a breeding marker in maize varieties with different resistance to fungal diseases

Galina V. Shekhvatova, Viktor V. Ashin, Elena F. Sotchenko

Scientific Research Production Company Gamma, Pushchino, Russian Federation, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms RAS, Pushchino, Russian Federation, Russian Research Institute of Maize, Pyatigorsk, Russian Federation

Abstract. Determination of plant resistance to fungal pathogens is an important breeding component. Thus, the study of protein profiles from corn kernels (13 genotypes) revealed a constitutively pronounced 14 kDa protein, trypsin inhibitor (TI), which is present at a relatively high level of concentration in seven Aspergillus flavus-- resistant maize lines, but at low concentrations or is absent in six sensitive lines. The 14 kDa trypsin inhibitor (TI) also showed antifungal activity against other mycotoxicogenic species. In this regard, the task was to determine the content of TI in varieties of maize with known properties, resistance, or sensitivity to such fungal pathogens of maize as head smut, common smut, and Fusarium stalk rot. According to the data obtained, the content of TI varies in different varieties and can vary by 4 times. However, in disease-resistant varieties its content is increased, which may be the primary marker of resistance of the variety to fungal pathogens.

Key words: maize, trypsin inhibitor, trypsin-agarose, fungal pathogens, head smut, common smut, Fusarium stalk rot

Введение

Растения подвергаются воздействию большого количества инфекционных патогенных грибов. Для кукурузы наиболее распространенными грибковыми патогенами на территории РФ являются пыльная головня, пузырчатая головня, стеблевые гнили, фузариоз. В то время как в странах с жарким и засушливым климатом наиболее распространены патогены рода Aspergillus, воздействие которых наиболее полно изучено.

Так, исследование профилей белка из зерен кукурузы (13 генотипов) выявили конститутивно-выраженный 14 кДа белок, ингибитор трипсина (ТИ), который присутствовал в относительно высоких концентрациях в семи устойчивых к А. flams линиях кукурузы, но в низких концентрациях или отсутствовал вообще в шести чувствительных линиях [1]. 14 кДа ТИ также проявлял антигрибковую активность против других микотоксикогенных видов [2].

Хотя растения не имеют иммунной системы, они используют защитные механизмы, включающие синтез низкомолекулярных соединений, белков и пептидов, имеющих антигрибковую активность. К настоящему времени известно 13 классов антигрибковых белков, среди них можно отметить PR-1 белки, 1,3-Р-глюканазы, хитиназы, хитин-связывающие белки, тауматин подобные белки, дефензины, циклофилин-подобные белки, ингибиторы протеиназ и другие белки [3].

Ингибиторы протеиназ являются составной частью системы защиты от вредителей и болезней [4]. Было показано, что патогенные грибы Fusariumи Helmin-thosporium выделяют в окружающую среду ферменты, расщепляющие белковые и синтетические субстраты. Разные виды грибов характеризуются неодинаковой активностью внеклеточных протеиназ. Высокое содержание ингибиторов внеклеточных протеиназ патогенных грибов Fusariumи Helminthosporium в семенах гороха, гречихи и кукурузы может служить одним из важных факторов, обеспечивающих устойчивость этих культур к поражению корневыми гнилями [5].

Аналогично, было показано, что содержание ИТ 14 кДа в семенах кукурузы коррелирует с устойчивостью сортов к заболеванию A. flavus [3] и, соответственно, накоплению афлатоксина.

ИТ из кукурузы 14 кДа, как было показано, помимо трипсин-ингибирующей активности, обладает активностью альфа-амилазы, и, будучи добавленным в питательную среду, он подавлял прорастание конидий и рост гиф фитопатогенов Aspergillus flavus, Asp. paprasiticus, F. moniliforme, а также проявлял антигрибковую активность против других микотоксикогенных видов [2, 6].

Нами была предпринята экспериментальная работа по исследованию содержания ИТ 14 кДа в образцах кукурузы с заведомо известными свойствами, устойчивости или чувствительности к грибковым патогенам, таким как пыльная головня (возбудитель -- Sphacelotheca reiliana), пузырчатая головня (возбудитель болезни -- Ustilago maydis, U. zeae)и стеблевые гнили кукурузы (возбудитель -- гриб Fusarium moniliforme).

Материалы и методы

кукуруза грибковый селекционный патогенный

Объект исследования. Сорта кукурузы с известными свойствами устойчивости (чувствительности) к грибковым патогенам (пыльная головня, пузырчатая головня, стеблевые гнили) были предоставлены из ВНИИ кукурузы г. Пятигорск. Были исследованы 6 сортов, устойчивых к грибковым инфекциям и 12 сортов, чувствительных к грибковым патогенам.

Подготовка образцов. Семена размалывали, каждый образец кукурузы (10 г) экстрагировали 20 мл 0,2 М раствора NaCl, перемешивали 2,5 ч, затем фильтровали, получали примерно по 15 мл экстракта.

К каждому образцу добавляли по 6 г сульфата аммония (60% насыщения), оставляли в холодильнике на ночь на 18 ч. Затем центрифугировали 10 мин, осадок растворяли в 5 мл буфера (20 мМ трис-HCl, 0,15 М NaCl, рН 6,8). Использовали для нанесения на трипсин-агарозу или на ВЭЖХ.

Аффинная хроматография на трипсин-агарозе. В качестве метода выделения был выбран аффинный сорбент -- трипсин-агароза [7]. Трипсин-агароза получена иммобилизацией TPCK-трипсина на BrCN-агарозе.

Для количественной оценки метода использовали стандартный образец 14 кДа ТИ, 200 мкг в 1 мл уравновешивающего буфера.

Образцы по 1,2 мл каждого экстракта наносили на колонку с трипсин-агарозой (4 мл) со скоростью 0,5 мл/мин. После промывки уравновешивающим буфером (10 мМ трис-HCl, 0,3 M NaCl, pH 7,0) проводили элюцию 0,15 М раствором уксусной кислоты.

ВЭЖХ (гидрофобная хроматография).Анализ образцов проводили на колонке RP-304 (250x4,6) Bio Rad. Использовали следующие условия: 3' -- 0% CH3CN; 40' -- 100% CH3CN; 50' -- 100% CH3CN, 65' -- 0% CH3CN.

200 мкг 14 кДа ТИ предварительно использовали в качестве стандарта.

Электрофорез в ПААГ.SDS-PAGE электрофорез в 15% геле использовали для анализа образцов.

Результаты

Исследовано 6 устойчивых к пузырчатой головне и пыльной головне и 12 сортов, неустойчивых к пузырчатой головне, пыльной головне и стеблевым гнилям. Данные образцы зерен кукурузы с заведомо известными свойствами устойчивости (чувствительности) к таким грибковым патогенам были предоставлены из ВНИИ кукурузы г. Пятигорск.

Площади пиков, полученных в результате хроматографии на трипсин-агарозе, рассчитывались математическими методами. Количество 14 кДа ТИ определяли на основании калибровки, для этого использовали образец, содержащий 200 мкг ТИ (рис. 1).

Типичная картина хроматографии экстрактов зерен кукурузы на трипсин-агарозе приведена на рис. 2.

Рис. 1

В данном случае нанесено 200 мкг 14 кДа ТИ для калибровки

Рис. 2. Типичная кривая хроматографии экстракта зерен кукурузы на трипсин-агарозе: второй пик -- элюция ТИ

Методом ВЭЖХ были исследованы 4 экстракта разных сортов кукурузы (рис. 3, 4). Были получены следующие результаты:

1-й образец -- 4,14% 14 кДа ТИ (устойчив к пыльной головне, R);

2-й образец -- 0,09% 14 кДа ТИ (чувствителен к пыльной головне, Б);

3-й образец -- 3,40% 14 кДа ТИ (устойчив к пузырчатой головне, R);

4-й образец -- 3,60% 14 кДа ТИ (чувствителен к пузырчатой головне, Б).

В дальнейшем был проведен анализ экстрактов зерен разных сортов кукурузы -- устойчивые сорта, Б -- чувствительные) с использованием аффинной хроматографии на трипсин-агарозе (табл. 1). Было исследовано еще 18 образцов. Для калибровки использовали стандартный образец, содержащий 200 мкг 14 кДа ТИ.

Таблица 1. Результаты скрининга сортов кукурузы по количеству 14 кДа ТИ

Обсуждение результатов

Ранее [1], при исследовании экстрактов зерен кукурузы (13 генотипов) было показано присутствие конститутивного 14 кДа ТИ на относительно высоком уровне концентрации в семи устойчивых к A. flavusсортах кукурузы, но в шести чувствительных сортах ТИ присутствовал в низкой концентрации или отсутствовал вовсе.

Механизм действия ТИ против грибкового роста может быть частично обусловлен ингибированием грибковой амилазы, приводящим к ограничению доступа A. flavusк простым сахарам [5], необходимым не только для роста патогенных грибов, но и для производства ими токсинов. ТИ также продемонстрировал противогрибковую активность и в отношении других микотоксигенных видов [2].

В [6] исследовалось содержание ТИ в разных сортах индийской кукурузы, устойчивых и чувствительных к A. Parasiticus, данные приведены в табл. 2.

Протеомный анализ белков зародышей пшеницы и белков эндосперма сортов кукурузы, устойчивых и чувствительных к Aspergillus flavus, разделенных методом двумерного электрофореза (2 D PAGE), показал, что имеется еще 5 конституитивных маркерных белков, а именно: запасающие белки (глобулин 1 и глобулин 2), белки позднего эмбриогенеза (LEA), белки, связанные с засухой (LEA3 и LEA14) или осмотическим стрессом (WSI18 и альдозоредуктаза) и белки, связанные с тепловым стрессом (HSP16.9). Альдозоредуктазная активность, измеряемая у резистентных и восприимчивых генотипов до и после заражения, свидетельствует о важности конститутивных уровней этого фермента для устойчивости [7].

Скрининг сортов индийской кукурузы стойчивых и чувствительных к A. parasiticus, на содержание ТИ [6]

Таблица 2

Большинство протеомных исследований связано с изучением устойчивости к роду Aspergillus (flavus и parasiticus)[8]; проведенные нами исследования содержания ТИ в разных сортах кукурузы, устойчивых (чувствительных) к пыльной головне, пузырчатой головне, стеблевым гнилям показали, что количество ТИ повышено в устойчивых сортах и понижено в чувствительных, однако имеются и промежуточные варианты, в литературе такие сорта названы «умеренно чувствительными» [6].

Выводы

Исходя из важности присутствия ингибиторов протеиназ в растениях предприняли скрининг разных сортов кукурузы на содержание ингибитора трипсина. Выделение ТИ производили с использованием аффинного сорбента -- трипсин- агарозы.

Оценка количества ТИ в зернах кукурузы может служить первичным маркером устойчивости (чувствительности) к грибковым патогенам, таким как пыльная головня, пузырчатая головня и стеблевые гнили. Количество ТИ повышено в устойчивых сортах и снижено в чувствительных, однако имеются и промежуточные варианты -- сорта, в литературе называемые умеренно чувствительными.

Литература

1. Chen Z.-Y., Brown R. L., Lax A.R., Guo B.Z., Cleveland T.E., Russin J.S. Resistance to Aspergillus flavus in corn kernels is associated with a 14-kDa Protein // Phytopathology. 1998. Vol. 88. No. 4. P. 276--281. doi: 10.1094/PHYTO.1998.88.4.276

2. Chen Z-Y., Brown R.L., Lax A.R., Cleveland T.E., Russin J.S. Inhibition of plant-pathogenic fUngi by a corn trypsin inhibitor overexpressed in Escherichia coli// Appl. Environ. Microbiol. 1999. No. 65. P. 1320--1324.

3. Selitrennikoff C.P. Antifungal proteins // Appl. Environ. Microbiol. 2001. Vol. 67. No 7. P. 2883--2894. doi: 10.1128/AEM.67.7.2883-2894.2001

4. Зайнутдинова Г.Ф. Белковые ингибиторы экзогенных протеиназ в тканях растений и их физиологическая роль: автореф. дис. ... канд. биол. наук. Уфа, 2001.

5. Chen Z-Y., Brown R.L., Russin J.S., Lax A.R., Cleveland T.E.A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavusa-amylase // Phytopathology. 1999. No 89. P. 902-- 907. doi: 10.1094/PHYTO.1999.89.10.902

6. Hajare S.S., Hajare S.N., Sharma A. Screening of indian corn varieties for aflatoxin resistance // Founder's day. 2006. No. 273. P. 218--230.

7. Lei M.-G., Reeck G.R.Combined use of trypsin-agarose affinity chromatography and reversed -- phase high-performance liquid chromatography for the purification of single-chain protease inhibitor from corn seeds // J. Chrom. 1986. No. 363. P. 315--321. doi: 10.1016/S0021- 9673(01)83751-1

8. Chen Z-Y., Brown R.L., Damann K.E., Cleveland T.E. Proteomics analysis of kernel embryo and endosperm proteins of corn genotypes resistant or susceptible to Aspergillus flavusinfection // Proceedings of the USDA-ARS Aflatoxin Elimination Workshop held at Yosemite / eds Ro- bens J., Cary J.W., Campbell B.C. CA, 2000. P. 88.

9. Chen Z-Y., Brown R.L., Damann K.E., Cleveland T.E.Identification of unique or elevated levels of kernel proteins in aflatoxin-resistant maize genotypes through proteome analysis // Phytopathology. 2002. No. 92. P. 1084--1094. doi: 10.1094/PHYT0.2002.92.10.1084

10. Mosolov V.V., Valueva T.A.Proteinase inhibitors and their function in plants: review // Appl Biochtv Microbiol. 2005. No 41. P. 227--246.doi: 10.1007/s10438-005-0040-6

References

1. Chen ZY, Brown RL, Lax AR, Guo BZ, Cleveland TE, Russin JS. Resistance to Aspergillus flavus in corn kernels is associated with a 14-kDa protein. Phytopathology.1998; 88(4):276-- 281. doi: 10.1094/PHYTO.1998.88.4.276

2. Chen ZY, Brown RL, Lax AR, Cleveland TE, Russin JS. Inhibition of plant-pathogenic fungi by a corn trypsin inhibitor overexpressed in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 1999; 65(3):1320--1324.

3. Selitrennikoff CP. Antifungal proteins. Appl Environ Microbiol, 2001; 67(7):2883--2894. doi: 10.1128/AEM.67.7.2883-2894.2001

4. Zaynutdinova GF. Belkovye ingibitory ekzogennykh proteinaz v tkanyakh rastenii i ikh fiziolo- gicheskaya rol'[Protein inhibitors of exogenous proteinases in plant tissues and their physiological role]. [Dissertation] Ufa; 2001. (In Russ).

5. Chen ZY, Brown RL, Russin JS, Lax AR, Cleveland TE. A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus a-amylase. Phytopathology.1999; 89:902--907. doi: 10.1094/PHYTO.1999.89.10.902

6. Hajare SS, Hajare SN, Sharma A. Screening of Indian corn varieties for aflatoxin resistance. BARC News Letter, Founder's Day Special Issue. 2006; (273):218--230.

7. Lei MG, Reeck GR. Combined use of trypsin-agarose affinity chromatography and reversed -- phase high-performance liquid chromatography for the purification of single-chain protease inhibitor from corn seeds. Journal of Chromatography. 1986; 363(2):315--321. doi: 10.1016/S0021-9673(01)83751-1

8. Chen ZY, Brown RL, Damann KE, Cleveland TE. Proteomics analysis of kernel embryo and endosperm proteins of corn genotypes resistant or susceptible to Aspergillus flavus infection. In: Robens J, Cary JW, Campbell BC. (eds.) Proceedings of the USDA-ARS Aflatoxin Elimination Workshop held at Yosemite. 2000. p. 88.

9. Chen ZY, Brown RL, Damann KE, Cleveland TE. Identification of unique or elevated levels of kernel proteins in aflatoxin-resistant maize genotypes through proteome analysis. Phytopathology. 2002; 92(10):1084--1094. doi: 10.1094/PHYT0.2002.92.10.1084

10. Mosolov VV, Valueva TA. Proteinase inhibitors and their function in plants: a review. Applied Biochemistry and Microbiology.2005; 41(3):227--246. doi: 10.1007/s10438-005-0040-6

Размещено на Allbest.ru