Исследование распространённости носительства Ureaplasma Diversum у взрослого крупного рогатого скота в северо-западном федеральном округе России

Размещено на http://www.allbest.ru/

Исследование распространённости носительства Ureaplasma Diversum у взрослого крупного рогатого скота в северо-западном федеральном округе России

ФБУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии

им. Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Адрес: 197101, Россия, г. Санкт-Петербург, ул. Мира, д. 14

Ваганова Анастасия Николаевна, науч. сотрудник. Е-mail: van.inprogress@gmail.com. Тел: +7 (905) 236-94-53

Аннотация

Ureaplasma diversum является оппортунистическим патогеном крупного рогатого скота. Как правило, колонизация репродуктивной системы животных не сопровождается выраженной симптоматикой, однако она может быть связана с абортами, бесплодием и заболеваниями репродуктивной системы крупного рогатого скота. U. diversum часто выявляется у животных, содержащихся на молочных животноводческих предприятий Северо-западного федерального округа России, где распространённость носительства может достигать 58,3 % на отдельных предприятиях. Колонизация преддверия влагалища U. diversum более распространена среди нетелей и первотёлок, чем среди коров старшего возраста. 75 % нетелей и 87 % первотёлок на отдельных хозяйствах могут быть носителями U. diversum, в то время как на тех же хозяйствах только 36 % коров после третьего отёла являются носителями. Таким образом, носительство U. diversum более распространено среди животных младшего возраста. Высокая частота носительства U.diversum среди поголовья животноводческих предприятий Северо-Западного региона может быть связана с возрастной структурой поголовий, отличающейся сдвигом в сторону более раннего возраста.

Ключевые слова: Ureaplasma diversum, крупный рогатый скот, репродуктивные заболевания, ПЦР

ADULT CATTLE UREAPLASMA DIVERSUM CARRIAGE PREVALENCE RESEARCH AT RUSSIA NORTH-WEST FEDERAL DISTRICT

Saint-Petersburg Research Institute of Epidemiology and Microbiology named after Pasteur of Federal Service

for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing, Federal Budget Scientific Institution

Address: 197101, Russia, St.-Petersburg, Mira st., 14

Vaganova Anastasia N., Researcher. Е-mail: van.inprogress@gmail.com. Тєі: +7 (905) 236-94-53

Summary. Ureaplasma diversum is a cattle opportunistic pathogen. It commonly persists asymptomatically in the reproductive system, but it also may be associated with abortion, infertility and other reproductive disorders of the cattle. U. diversum is widely spread in dairy cows in the Leningrad region of Russia, where the frequency of carriage is more than 58 % in particular farms. Colonization of vestibulum by U. diversum is more frequent in bred heifers and fresh cows, than in older age groups. 75 % of bred heifers and 87 % of fresh cows at particular farm may be the carriers of U. diversum, but at the same time only 36 % of cows after third calving are colonized by U. diversum in the same farm. So U. diversum carriage is more spread in younger animals. High frequency of U.diversum carriage in cattle from the Leningrad region may be related to the age pattern of dairy farm, that is specifically shifted to the younger age.

Keywords: Ureaplasma diversum, cattle, reproductive disorders, PCR

Введение

Уреаплазмы являются оппортунистическими патогенами, отличающимися строгой гостальной специфичностью и способностью к длительной персистенции на слизистых оболочках хозяина. Инфицированность коров уреаплазмами составляет в различных странах (13-52,9) % [5, 6, 8, 10]. При этом, несмотря на то, что носительство, как правило, протекает бессимптомно, отмечена более высокая частота выявления U. diversum у коров и нетелей с симптоматикой заболеваний репродуктивной системы, чем у здоровых животных [3]. Также носительство уреа- плазм в репродуктивном тракте часто сопровождается колонизацией органов половой системы крупного рогатого скота патогенными микоплазмами, в частности [4]. diversum возрастной поголовье заражение

Несмотря на то, что носительство U. diversum в большинстве случаев протекает бессимптомно, колонизация репродуктивной системы коров данными уреаплазмами может приводить к абортам. Отмечено, что в Финляндии U. diversum является ведущей причиной абортов у крупного рогатого скота [9].

Патологический процесс, развивающийся при заражении U. diversum, у коров характеризуется поражением слизистой оболочки преддверия влагалища в виде гранулярного вульвовагинита, сопровождающегося пустулёзной сыпью и гиперемией слизистой оболочки [1]. В отдельных случаях возможно развитие воспалительных процессов в области шейки матки и внутриматочных инфекций, приводящих к эндометритам, в том числе в послеродовом периоде, сальпингитам, оваритам, метритам и задержанию последа [2].

Для молодняка КРС характерно носи- тельство уреаплазм в респираторном тракте. Как правило, носительство U. diversum среди молодняка менее распространено, чем среди взрослого КРС. В различных странах установлена частота носительства уре- аплазм в респираторном тракте молодняка крупного рогатого скота (9-20,2) % [7]. Сурфактант, продуцируемый эндотелием лёгких, обладает бактерицидной активностью в отношении уреаплазм, что может быть одним из факторов, сдерживающих развитие инфекционного процесса при колонизации лёгких U. diversum, поэтому носительство уреаплазм в респираторном тракте телят зачастую протекает бессимптомно. Однако развитие инфекционного процесса может вести к заболеваниям, протекающим в лёгкой, среднетяжёлой или тяжёлой формах, приводящим к гибели молодняка. Отмечено, что уреаплазмы значительно чаще выявляются в трахеобронхеальном лаваже у молодняка с симптомами респираторных заболеваний. При развитии бронхопневмонии, ассоциированной с U. diversum, у телят отмечается кашель, одышка, при обострении процесса возможна асфиксия. В качестве единственного этиологического агента U. diversum может выступать при гнойной пневмонии. Кроме того, U. diversum выделяется из легких телят при пневмонии в ассоциации с другими бактериями, в том числе микоплазмами, а также с вирусами [4]. Подобные смешанные инфекции характеризуются более тяжелым течением [7].

Молочное животноводство занимает ведущее место в агропромышленном комплексе Северо-Западного федерального округа Российской Федерации, поэтому распространение инфекционных заболеваний крупного рогатого скота может иметь существенные последствия для экономики региона. Целью данного исследования была оценка распространенности но- сительства U. diversum в поголовье молочных животноводческих хозяйств Северо-западного федерального округа.

Материалы и методы

Клинический материал

Исследуемую группу составляли коровы (n=89) и нетели (n=20) из поголовья трех животноводческих предприятий, расположенных в Северо-Западном федеральном округе России. Из поголовья предприятия № 1 было отобрано для исследования 27 взрослых коров, из поголовья предприятия № 2 -- 32-е взрослых коровы и 20 нетелей, из поголовья предприятия № 3 -- 30 взрослых коров. Таким образом, общее количество исследованных животных составило 109 голов.

С целью исследования были взяты мазки с поверхности слизистых оболочек преддверия влагалища (109 образцов). Забор материала у коров проводился в первые две недели после отела. Материал отбирался с помощью зондов-тампонов. Забор мазка из преддверия влагалища проводился в области нижнего свода влагалища с захватом области ямки клитора и локализации патологических изменений при их наличии.

Непосредственно после отбора зонды- тампоны помещались в пластиковые пробирки с пробкой, содержавшие 1,5 мл среды “УРЕАПЛАЗМА СРЕДА” (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера) для поддержания жизнеспособности уреа- плазм до замораживания материала.

Непосредственно после отбора проб материал был заморожен при температуре -20 °С и перевезен для исследования в лабораторию молекулярно-биологических технологий НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера (Санкт-Петербург, Россия) в термоконтейнерах, обеспечивающих поддержание температуры материала на уровне (-15±5) °С.

Выделение ДНК

Перед выделением ДНК зонд-тампон извлекался из транспортной среды. Транспортную среду в полном объеме переносили в микроцентрифужную пробирку типа эп- пендорф объемом 1,5 мл. Образец концентрировали 5-минутным центрифугированием при 14 000 g на центрифуге “MiniSpin” (Eppendorf, Германия). Надосадочную жидкость удаляли, осадок на дне пробирки использовали для выделения ДНК. Выделение ДНК из проводилось с помощью набора “ДНК-сорб-В” (ФБУН НИИ эпидемиологии, Москва) согласно инструкции.

К осадку добавлялось 300 мкл лизирующего раствора, входящего в состав набора. Осадок ресуспензировался в лизирующем растворе путем вортексирования и помещался в твердотельный термостат для лизиса при температуре 65° C на 5 минут. По окончании лизиса пробирки извлекались из твердотельного термостата. Для связывания ДНК в пробирки вносили по 25 мкл сорбента на основе кремниевых частиц (silica). После сорбции в течение 7-ми минут проводилась отмывка сорбента от белковых и других примесей путем его ресуспендирования в 300-х мкл отмывочного раствора 1 с последующим осаждением сорбента центрифугированим при 5000 g и удаления супернатанта (однократно) и ресуспендирования в 500-х мкл отмывочного раствора 2 с последующим осаждением сорбента центрифугированием при 10 000 g и удаления супернатанта (двукратно). По окончании процедуры отмывки осадок сорбента высушивался 5 минут при 65 °С, элюция ДНК проводилась в объеме 50 мкл буфера ТЕ в течение 5-ти минут при 65 °C.

ПЦР в реальном времени

Для выявления ДНК U. diversum применялась тест-система для ПЦР в реальном времени “Ureaplasma diversum Amp” (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера). Постановку реакции проводили согласно инструкции. Для приготовления реакционной смеси использовали 5 мкл Реактива-Amp 1 и 10 мкл Реактива-Amp 2. В 15 мкл полученной смеси вносили 10 мкл препарата ДНК.

Для проведения реакции был использован амплификатор CFX96 (Bio-Rad, США). Детекция накопления продуктов амплификации проводилась по каналам FAM и HEX. По каналу FAM оценивалось накопление продукта амплификации специфической последовательно сти, содержащейся в геноме U. diversum. Детекция внутреннего контроля амплификации проводилась по каналу HEX. В качестве внутреннего контроля была использована специфическая последовательность в геноме крупного рогатого скота (Bos taurus). Интерпретация результата ПЦР в реальном времени проводилась согласно инструкции к используемому набору с использованием программного обеспечения CFX-Manager. В качестве достоверных результатов рассматривались только результаты, полученные в образцах, в которых при проведении ПЦР в реальном времени было отмечено накопление флуоресцентного сигнала по каналу HEX.

Статистический анализ

Статистическая обработка результатов исследований проводилась с использованием электронных таблиц Microsoft ® Office Excel. Для оценки различий между выборками был применен t-критерий Стьюдента. Для оценки взаимосвязи показателей использовался коэффициент корреляции Пирсона. Значение P<0,05 рассматривалось как статистически значимое.

Результаты исследования

Для исследования на предмет распространения носительства U. diversum в поголовье молочных хозяйств Северо-Западного федерального округа России случайным образом было отобрано 109 коров. У всех коров в исследуемой группе были взяты мазки из преддверия влагалища. Исследование препаратов ДНК, выделенных из мазков с поверхности слизистых оболочек преддверия влагалища, выявило ДНК крупного рогатого скота в 108-ми из 109-ти образцов. В одном образце была отмечена деградация ДНК крупного рогатого скота, и он был исключен из дальнейшего анализа. По результатам проведенного исследования уровень инфицированности U. diversum в Северо-Западном федеральном округе среди коров до статочно высок и составляет 58,3 %, то есть 63 животных из 108-ми обследованных.

Для 32-х коров и 20-ти нетелей из хозяйства № 2 были доступны данные о возрасте обследованных животных. Материал у коров отбирался в родильном отделении, где на момент исследования находились все включенные в исследуемую группу животные. Нетели содержались в отдельном здании, обособленном от мест содержания молодняка и коров старшего возраста. На момент отбора материала все обследованные коровы содержались в родильном отделении хозяйства. Взятие мазков проводилось в помещениях, где животные содержались на момент проведения исследования.

При исследовании мазков с поверхности слизистых оболочек преддверия влагалища, полученных от 20-ти нетелей, методом ПЦР в реальном времени носительство U. diversum было обнаружено в 15-ти случаях (75 %). Носительство U. diversum в репродуктивном тракте взрослых коров отмечалось реже и составило 18 случаев из 32-х (56,25 %).

При этом в группе животных, у которых материал отбирался после первой стельности, частота носительства U. diversum составляла 87 % (7 из 8-ми случаев); среди коров, обследованных после второй стельности, частота носительства U. diversum отмечалась реже и составила 53,8 % (7 из 13-ти случаев), а в группе коров, обследованных после трех и более стельностей, составила 36,6 % (4 из 11-ти случаев). Таким образом, отмечалась тенденция к снижению частоты носительства U. diversum в исследованных группах коров старшего возраста (табл. 1).

Таблица 1