Сравнительный анализ активности гидролизатов белков крови

Размещено на http://www.allbest.ru/

Сравнительный анализ активности гидролизатов белков крови

Гусева Марина Николаевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник; Шевченко Максим Александрович, ведущий ветеринарный врач; Доронин Максим Игоревич, кандидат биологических наук, научный сотрудник; Михалишин Дмитрий Валерьевич, кандидат ветеринарных наук, заведующий лабораторией профилактики ящура; Федорова Ольга Евгеньевна, аспирант, технолог 1 категории; Клюкина Надежда Дмитриевна, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник; Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Аннотация

В статье приведен сравнительный анализ биологической активности серий гидролизата белков крови (ГБК), полученных для использования в производстве противоящурных вакцин в 2017-2018 гг. При исследовании активности ГБК в концентрации 0,25% высокоактивными признаны 67 серий (46%), удовлетворительными - 79 серий (54%). Всего одна серия (0,7%) была выбракована. Высокая токсичность серий гидролизата не выявлена. Количество аминного азота в исследуемых образцах варьировало от 0,94 до 1,12±0,02%. Было отмечено, что его количество влияло на пролиферацию клеток ВНК-21.

Массовая доля сухого остатка в продуктах гидролиза белков крови колебалась от 9,49 до 10,2±0,07%. Содержание полипептидов находилось в диапазоне от 39,98±1,53 до 48,00. При исследовании влияния данного количества полипептидов на рост клеток линии ВНК-21 существенные различия не обнаружены.

Практически все серии гидролизата белков крови, поступившие для производства противоящурных вакцин, были не токсичны, пригодны для выращивания клеток ВНК-21 и обладали высоким или удовлетворительным уровнем биологической активности.

Summary

Comparative analysis of blood protein hydrolysate activity

Guseva Marina Nickolayevna, Candidate of Science (Biology), Senior Researcher; Shevchenko Maxim Alexandrovich, Leading Veterinarian; Doronin Maxim Igoryevich, Candidate of Science (Biology), Researcher; Mikhalishin Dmitry Valeryevich, Candidate of Science (Veterinary Medicine), Head of Laboratory for FMD Prevention, Fedorova Olga Yevgenyevna, PhD Student, Category 1 Technologist; Klyukina Nadezhda Dmitrievna, Candidate of Science (Veterinary Medicine), Senior Researcher, Federal State-Financed Institution “Federal Centre for Animal Health”

The article represents the results of the comparative analysis of biological activity of blood protein hydrolysate (BPH) batches produced for FMD vaccine formulation in 2017-2018. Tests of 0.25% BPH demonstrated high activity in 67 batches (46%) and satisfactory activity in 79 batches (54%). Only one batch (0.7%) was discarded. No high toxicity of hydrolysate batches was identified.

The amino nitrogen content in the tested samples varied from 0.94 to 1.12±0.02%. Its amount was demonstrated to have an effect on BHK-21 cell proliferation. The dry residue mass fraction in blood protein hydrolysate products ranged from 9.49 to 10.2±0.07%. The polypeptide content ranged from 39.98±1.53 to 48.00. Studies of the effect of such polypeptide amount on BHK-21 cell growth did not demonstrate any significant differences.

Nearly all batches of blood protein hydrolysate supplied for FMD vaccine production were non-toxic and suitable for BHK-21 cell growth. They also demonstrated high or satisfactory level of biological activity.

Введение

В последнее время в клеточной биотехнологии четко определено и интенсивно развивается направление, связанное с конструированием питательных сред, содержащих в качестве ростовой аминокислотной пептидной составляющей гидролизаты белкового сырья [3, 8, 9].

Белковые гидролизаты представляют собой продукты расщепления белка до аминокислот, ди- и трипептидов. Гидролизаты обычно содержат 16-20 аминокислот в вариабельной концентрации, а также пептиды разной молекулярной массы [3].

Предложено много препаратов этой группы. Большинство из них получено путем глубокого расщепления протеина до аминокислот при воздействии на сырье концентрированных кислот. Известны три метода гидролиза белков -- кислотный, щелочной, энзимный (ферментативный). При всех этих видах гидролизации полипептиды расщепляется на составные части, однако продукты гидролиза различны.

Кислотный и щелочной гидролиз осуществляется в процессе кипячения белка с концентрированными растворами кислот и щелочей. Эти способы гидролиза являются грубыми и часто вызывают рацемизацию аминокислот (превращение природных L-форм в неусваиваемые организмом D-формы), разрушение ароматических аминокислот, их частичное дезаминирование (отщепление NH2-группы от аминокислоты) и, как следствие, ослабление или потерю биологической и физиологической ценности, а также снижение фармакологической активности аминокислот [5, 7].

В отличие от кислотного и щелочного ферментативный гидролиз, протекающий при умеренной температуре (37-55°С), мягко воздействует на белок, не вызывая рацемизацию аминокислот и разрушение триптофана. Кроме того, он обеспечивает сохранность биологически активных веществ (витаминов, нуклеиновых и желчных кислот). Учитывая, что ферментативный гидролиз протекает медленно, требуется гораздо больше времени для получения препарата, лишенного нативного белка, полипептидов и пептидов. Ферментативные гидролизаты получают, инкубируя белковое сырье (казеин, кровь, фибрин) с протеолитическими ферментами. При этом не всегда удается полностью расщепить протеины в этих условиях. По этой причине введение во внутреннюю среду организма в медицинских целях ферментных гидролизатов часто сопровождается анафилактическими реакциями, а также развитием микрофлоры и выделением токсических продуктов при использовании в области биотехнологии [4, 7].

В нашей стране широко используются гидролизаты из белков крови животных, главным образом, крупного рогатого скота (КРС). Кровь является лучшим сырьем, поскольку содержит 18 % полноценного белка, а также минеральные вещества, которые остаются в готовом препарате [3].

Ферментативный гидролиз белков крови включает в себя несколько критических этапов, которые могут достаточно сильно влиять на химические и биологические свойства конечного продукта:

- точность расчета необходимого количества железы и ее свежесть;

- использование при остановке процесса концентрированного раствора соляной кислоты;

- внесение хлористого кальция для коагуляции и осаждения крупномолекулярных продуктов гидролиза и гемовых пигментов;

- удаление избытка CaCl₂ путем введения в гидролизат двузамещенного фосфата натрия;

- применение хлороформа в качестве бактериостатика.

Малейшие отклонения в силу различных причин от технологического процесса могут привести к появлению токсичности гидролизата белков крови, снижению ростовых свойств питательных сред, в составе которых используется ГБК вплоть до гибели клеток [1, 6]. По этим причинам в биотехнологическом производстве важен контроль входящего сырья, в данном случае, оценка качества серий ГБК.

Целью исследования был сравнительный анализ химической и биологической активности серий гидролизата белков крови, полученных в 2017-2018 гг.

Материалы и методы

Клеточная линия. В работе использовали суспензионную клеточную линию из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК- 21) с 1 и 2 пассажей и концентрацией не ниже 3,0х106 кл/см³.

Среда для культивирования клеток. Для выращивания клеток линии BHK-21 применяли культуральную среду на основе раствора Хэнкса, содержащую необходимый для роста клеток набор солей, аминокислот, витаминов, в сочетании с 5 % фетальной сыворотки крови КРС фирмы SERANA, инактивированной при температуре 56°С в течение 30 минут, а также исследуемый ГБК. Стерилизацию ГБК проводили паровоздушным методом путем автоклавирования при температуре (132±2)°С, при давлении 0,2 МПа в течение 1 ч.

Определение биологической активности гидролизатов белков крови.

Выращивание клеток осуществляли в культуральных флаконах с приготовленным раствором питательной среды и посевной концентрацией клеток 0,4-0,7х106 кл/см³. Для оценки биологической активности ГБК тестировали в двух концентрациях: 0,25 и 0,50% по сухому веществу. Инкубацию клеток осуществляли в стеклянных культиваторах, помещенных в термостатируемый шейкер Incubation Schьttelschrank BS 4 со скоростью перемешивания суспензии 150±5 об/мин и при температуре 37,0±0,5°С. Показатель кислотности клеточной суспензии поддерживали в диапазоне 7,0-7,2 с использованием стерильного 7,5%-ого раствора гидрокарбоната натрия. Пересев клеток проводили через каждые 48 ч в течение 5 последовательных пассажей.

Оценка интенсивности прироста клеток. Концентрацию клеток ВНК-21 в суспензии определяли с помощью камеры Горяева для счета форменных элементов крови. Количество клеток в 1 см³ суспензии рассчитывали по формуле [2]:

где Х - количество клеток в 1 см³,

А - общее количество клеток в камере,

В - разведение суспензии.

Увеличение концентрации клеток оценивали по интенсивности прироста (ИП), пользуясь формулой:

ИП= a/b,

где a - концентрация клеток через 48 ч после посева,

b - посевная концентрация клеток.

Интерпретация результата исследования биологической активности ГБК. Оценка качества гидролизата белков крови по значению ИП проводилась следующим образом:

- если среднее значение ИП за пять пассажей составляло 4,5-5,0, то ГБК считали биологически активным;

- если ИП находилось в диапазоне от 3,0 до 4,5, то гидролизат считали удовлетворительным;

- если ИПср ниже 3,0, то ГБК выбраковывался.

Токсичность гидролизата белков крови оценивали следующим образом: если на протяжении пяти последовательных пассажей клетки ВНК-21 оставались живыми (в 4 и 5 пассаже допускалось не менее 60%), то такой ГБК считался нетоксичным.

В противном случае ГБК выбраковывали.

Исследование химической активности ГБК. Массовые доли сухого остатка, аминного азота и полипептидов определяли согласно ТУ 100913791 от 1991 г.

Статистическая обработка данных. Для статистической обработки полученных результатов вычисляли значение средней арифметической и ее ошибку. Степень различия между средними значениями двух выборок оценивали с помощью критерия Стьюдента (t). Уровень значимости отражал степень достоверности полученных данных и показывал вероятность случайного возникновения исследуемых показателей [2]. Цифровой материал статистически обрабатывали на персональном компьютере общепринятыми методами вариационной статистики с использованием программы Microsoft Excel.

Результаты исследований и обсуждение

В течение года было исследовано 146 серий гидролизатов белков крови. При анализе биологической активности ГБК в концентрации 0,25% интенсивность прироста клеток в пяти последовательных пассажах, равную 4,5-5,0, имели 67 серий (46%), ИП 3,0-4,5 - 79 серий (54%). Всего одна серия (0,7%) ГБК имела среднюю интенсивность прироста, равную 3,0. При исследовании ГБК в концентрации 0,50% ИП свыше 4,5 имели 95 серий (65%), ИП 3,0-4,5 - 46 серий (31,5%), ИП ниже 3,05 (3,5%) - 5 серий. Результаты исследований отражены на рисунке 1 и в таблице 1.

Таблица 1. Биологическая активность различных серий ГБК

В более ранних исследованиях был проведен анализ различных серий ГБК согласно ТУ 100913791 от 1991 г. [9]. Серии ГБК проверяли на количество сухого остатка (%), аминного азота (%), полипептидов (%). Было отмечено, что количество аминного азота влияло на пролиферацию клеток линии ВНК-21. Так, при концентрации аминного азота до 1,0 % индекс пролиферации составлял 4,88±0,13 (n=166), свыше 1,0 % - 4,45±0,13 (n=134). Для всех указанных групп различия существенны (р<0,001). При исследовании влияния количества полипептидов на рост клеток линии ВНК - 21, существенные различия обнаружены не были [9].

Аминный азот в ГБК (%) - азот, входящий в свободные аминогруппы -NH2 аминокислот и других продуктов гидролиза белков. Его определяют при изучении активности протеолитических ферментов, состава форм азотистых соединений в сырье, полупродуктах и готовой продукции [3].

Аминокислоты служат донорами аминного азота при синтезе всех азотсодержащих небелковых соединений: нуклеотидов, гема, креатина, холина и других веществ [3].

При сравнении биологической активности ГБК и его химических показателей также выявили зависимость между количеством аминного азота и интенсивностью прироста клеток. Так, при ИП свыше 4,5 количество аминного азота было 1,12±0,02 %, а при ИП ниже 3,0 - 0,94-0,96 % (различия существенны, р<0,001). Результаты анализа представлены в таблице 2 и на рисунке 3.

Рис. 1. Биологическая активность 146 серий гидролизата белков крови

Рис. 2. Зависимость интенсивности прироста клеток ВНК-21 от концентрации сухого остатка в ГБК

Рис. 3. Зависимость интенсивности прироста клеток ВНК-21 от количества аминного азота в ГБК

Таким образом, можно предположить, что азот, входящий в свободные аминогруппы - NH2 аминокислот и других продуктов гидролиза белков, является важным элементом для питания и роста клеточной популяции.

Полипептиды в ГБК (%) - полимеры, состоящие из остатков аминокислот, связанных между собой пептидными связями. Условно считается, что полипептиды - это полимеры, содержащие от 50 аминокислотных остатков с молекулярной массой более 5000-10000 Да [3].

В исследуемых сериях ГБК количество полипептидов колебалось от 39,98±1,53 до 48 % (таблица 2, рисунок 4), данное содержание пептидов не влияло на интенсивность прироста клеточной популяции.

Таблица 2 Зависимость интенсивности прироста клеток линии ВНК-21 от химических показателей ГБК (сухого остатка, аминного азота, количества полипептидов)