Определение пестицидов методом газовой хроматографии в подморе медоносных пчел после летальной интоксикации

Размещено на http://www.allbest.ru/

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕСТИЦИДОВ МЕТОДОМ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ В ПОДМОРЕ МЕДОНОСНЫХ ПЧЕЛ ПОСЛЕ ЛЕТАЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ

ОБУ «Курская областная ветеринарная лаборатория»

Роик Богдан Олегович, ведущий инженер химико-токсикологического отдела,

Ермилов Иван Валерьевич, руководитель учреждения, кандидат ветеринарных наук.

Аннотация

Определение пестицидов в пчелином подморе является весьма актуальной, и в то же время трудной для практической реализации задачей. Трудность, в основном, заключается в отсутствии утвержденных методических указаниях или ГОСТов по проведению соответствующей пробоподготовки биоматериала и газохроматографического анализа. Таким образом, в работе представлена разработка методики определения хлор- и фосфорорганических пестицидов в подморе пчел методом газовой хроматографии. Проведена валидация процесса подготовки патматериала пчел по современному и эффективному методу QuEChERS. Разработанный и прошедший валидацию метод определения пестицидов в трупах пчел носит рекомендательный характер и может быть использован ветеринарными лабораториями при возникновении вспышек массовой гибели медоносных пчел.

Summary

DETERMINATION OF PESTICIDES BY GAS CHROMATOGRAPHY IN THE CORPSES OF HONEY BEES AFTER LETHAL INTOXICATIONS

RBI «Kursk regional veterinary laboratory»

Roik Bogdan Olegovich, leading engineer of chemical and toxicological department.

Ermilov Ivan Valer 'evich, Director of the head of the institution, PhD of Veterinary Scienses.

RBI «Kursk regional veterinary laboratory»

Determination of pesticides in bee corpses is a very important, but at the same time difficult for practical implementation task. The difficulty mainly lies in the absence of approved guidelines for the appropriate sample preparation of biomaterial and gas chromatographic analysis. Thus, the paper presents the development of methods for determining pesticides in bee sub pestilence by gas chromatography. Validation of the process of preparation of bee pathological material for a modern and efficient QuEChERS method was conducted. Developed and validated method for determination of pesticides in the corpses of bees is advisory and can be used by veterinary laboratories in the event of outbreaks of mass death of honey bees.

Введение

Влияние пестицидов на организм пчел. Садоводам и фермерам довольно часто приходится сталкиваться с проблемами, связанными с порчей растений и плодов по причине образования насекомых-вредителей, грибковых и прочих неблагоприятных образований. Защитить свой урожай от наплыва таких вредителей и различных случаев, возможно только с применением специальных агрохимических препаратов - инсектицидов, которые обладают уничтожающим действием на вредных насекомых, включая их потомство. Но если для борьбы с насекомыми-вредителями, их личинками и яйцами, эффективными препаратами являются ядохимикаты из класса инсектицидов, то для полезных насекомых они оказывают вредное и губительное действие, в большинстве случаев летальное. К тому же, у многих вредных насекомых уже выработана генетическая устойчивость к большинству препаратов идентичного действия и состава, что не сказать, например, о пчелах.

Причинами возникновения летальной интоксикации пчел может стать неправильная организация трудовой деятельности агрохимических компаний при обработке сельскохозяйственных угодий и полей. Так же, известно длительные токсикозы пчел, протекающие практические без симптомов, которые возникают вследствие поедания пчелами меда, с занесенным в улей вместе с пыльцой летальным количеством инсектицидов [8, 9, 11]. Причинами отравления пчел пестицидами могут быть различные факторы, чаще всего обусловленные некомпетентностью персонала агрофирм, проводящих обработку полей [8]. Пчелы являются весьма чувствительными насекомыми даже для незначительных микроколичеств пестицидов, а именно инсектицидного ряда. В итоге, после того, как ядохимикаты попадают на цветочные растения, пчелы заносят собранную отравленную пыльцу и нектар в улей. Поэтому пчелы все чаще подвержены неумышленной летальной интоксикации различными пестицидами даже и в зимний период. Агрохимикаты, попавшие в мёд, которым пчелы кормятся, убивают их спустя некоторое время. Выжившие после интоксикации пчелы способны рождать трутней с мутациями или иными генными дефектами. Основным признаком токсикоза является массовая гибель летных пчел, причем основная часть погибает сразу же в поле, другие особи, долетев до улья, погибают возле него [8, 11].

В основном, сельское хозяйство при обработке полей использует ядохимикаты контактного и системного действия (пиретроидные, хлор- и фосфорорганические пестициды), которые проникают через наружные защитные покровы пчел [12]. Фосфорорганические ядохимикаты, по числу соединений, применяемых в сельском хозяйстве, занимают первое место наряду с другими классами органических химикатов. Отдельные группы данного класса пестицидов, являются частыми виновниками отравления медоносных пчел при обработке сельхозкультур [6]. Даже при незначительном отравлении симптомы выражаются в большинстве случаев в возбуждении центральной нервной системы, в параличе и судорогах конечностей, в потере координации движений насекомого, и почти всегда приводит к интоксикации и гибели пчелы.

В составе пчелиного подмора чаще всего содержатся компоненты пыльцы, воск, маточное молочко, прополис, остатки меда, аминокислоты, ферменты, гормоноподобные вещества, хитин, жир, пищевые волокна и другие составляющие. При этом известно, что наружный покров насекомых состоит из кутикулы и гиподермы. Кутикула представляет собой прозрачную влажную оболочку, которая помогает насекомым сохранить водный баланс при помощи секреторных выделений, распределенных по всей поверхности организма насекомого. Состоит кутикула из эпикутикулы, экзокутикулы и эндокутикулы. Все три слоя кутикулы являются своего рода барьерами, выполняющими защитную функцию. Проникновение ядовитых веществ в тельце пчелы происходит через верхние покровы и зависит от степени проницаемости самой кутикулярной оболочки. В основном, проницаемость покровов кутикулы обуславливается толщиной и органическим составом, в который обычно входят такие компоненты, как липоиды, хитин и протеин. Экзокутикула и эндокутикула выполняют защитную функцию от механических частиц, попадающих в насекомое. Эпикутикулу следует считать первым барьером, стоящим на пути проникновения контактных инсектицидов в организм пчелы. Гиподерма является внутренней оболочкой и имеет всего один слой, образованный подкутикулярными клетками [5].

Проникновение инсектицидов через покровы тельца пчелы связано в основном с явлением проницаемости живых мембран, а не с эффектом обычной диффузии [2, 3, 5]. К тому же, задержка инсектицидной пыли на лапках, крылышках и ворсинках тельцев медоносных пчел способна попадать в мед вместе с пыльцой, а также заражать других особей. Считается, что в местах расположения щетинок и волосков тела насекомого, кутикула имеет тонкий слой, через который проникновение инсектицидов происходит гораздо быстрее. На рисунке 1 представлен вид ворсинок, расположенных на крылышках пчел.

У пчел также весьма уязвимыми и чувствительными являются лапки, так как они покрыты щетинками, которые удерживают частицы пестицидов, а также тонким слоем кутикулярной оболочки, через которые происходит интоксикация контактным инсектицидом. На рисунке 2 представлены щетинки, покрывающие лапки пчел.

Многие исследователи ссылаются на то, что пестициды из класса хлорорганических препаратов являются весьма губительными для насекомых. Интоксикации чаще всего подвергаются и полезные насекомые - медоносные пчелы [5, 11, 14, 16,17].

В настоящее время существует и применяется в сельском хозяйстве достаточно много пестицидов, относящихся к различным группам и классам опасности. В основном, широкое применение в сельском хозяйстве приобрели хлор-, фосфор-, ртутьорганические соединения, а также в последнее время активное применение отводится пиретроидным инсектицидам. Последние, в свою очередь, обладают широким спектром губительного действия для насекомых-вредителей, но являются весьма токсичными для пчел и других полезных насекомых.

Значительный ущерб пчеловодству и резкий упадок численности насекомых-опылителей приносят неправильное и некорректное применение инсектицидов. Профилактика отравлений пчел может быть достигнута только при правильном использовании пестицидов, хранении их на складе по соответствующим нормам и технологиям, а также в утилизации отработанных контейнеров и пакетов полным сжиганием [8].

В периоды массовых обработок агрофирмам следует проводить специальные мероприятия, которые подразумевают извещение пчеловодов о предстоящей химической обработке, вследствие которого пасеки должны быть перенесены на безопасное расстояние (5-7 км) от места использования ядохимикатов. В свою очередь, пчеловоды обязаны обеспечить соответствующие меры по защите ульев и изоляции медоносных пчел. При этом каждая пасека должна иметь ветеринарно-санитарный паспорт, подписанный и заверенный главным ветеринарным врачом [1, 4, 6, 7]. Изолирование пчелиных семей осуществляется по специально разработанным пчеловодческим приемам (перевозка пасек, изоляция пчел в гнезде, изоляция при помощи сетки и др.), а контроль за данной операцией осуществляется ветеринарной службой и службой по защите растений [1, 8].

Определение пестицидов в пчелином подморе является весьма актуальной, но в то же время трудной для практической реализации задачей. Трудность, в основном, заключается в отсутствии утвержденных методических указаний и ГОСТов по проведению соответствующей пробоподготовки биоматериала и газохроматографического анализа.

Рис. 1. Ворсинки, расположенные на крылышках пчел, на которых происходит удерживание мелких частиц контактных инсектицидов

Данную проблему, вызванную отсутствием конкретной методики пробоподготовки, возможно решить только при точном определении принадлежности патматериала подмора пчел и классификацию самого биоматериала. Таким образом, классифицированный биоматериал подмора, логически, можно будет подготавливать и анализировать по аналогии с образцами схожей формы и консистенции, осуществив перенос методики исследования с соответствующим валидационным подтверждением. Большинство применяемых пестицидов для сельского хозяйства подвержены детоксикации через 1-7 дней, в зависимости от класса опасности пестицидов, после чего они становятся безвредными для пчел [1].

Рис. 2. Щетинки, покрывающие лапки пчел

Отравление пчел пестицидами, пусть даже неумышленное, влечет за собой уголовную ответственность аграриев, обрабатывающих поля без предварительного предупреждения пасечников. В основу разработки и тестирования любого агрохимиката должна быть положена концепция определения токсикологического влияния на организм пчел. Следует отметить, что многие производители инсектицидных препаратов все же указывают на этикетке класс опасности и влияние активного вещества на пчёл. Однако, трудность, с которой предстоит столкнуться как пасечнику, так и исследователю, состоит в сложности подсчета ущерба, вызванного протравкой полей ядохимикатами, пагубно влияющими на пчёл. К тому же, во-первых, гибель пчел должны подтвердить соответствующие органы власти и ветеринарная служба. Во-вторых, доказать гибель пчел при судебном разбирательстве, будет весьма трудно из-за отсутствия все тех же утвержденных государственных химико-аналитических методик, чем должен руководствоваться исследователь при определении пестицидов в биоматериале подмора пчел. При явных признаках отравления пчел, когда лабораторная диагностика не может быть проведена из-за отсутствия соответствующей методики определения пестицидов в подморе пчел, решение ветеринарной комиссии о предполагаемой причине гибели пчел является окончательным результатом [7]. Несмотря на то, что Федеральный закон «О пчеловодстве» был принят в РФ, районы и областные центры по-прежнему испытывают нехватку экспертов и ветеринарных врачей, специализирующихся на отрасли пчеловодства, особенно связанной с интоксикацией и гибелью пчел. В основном отсутствуют специалисты по хроматографическим исследованиям, область которых направлена на определение остаточного количества пестицидов в трупах медоносных пчел.

Методические рекомендации, представленные НИИ Пчеловодства, описывают определение пестицидов в трупах пчел, основанные на качественных исследованиях и фотометрическом и химическом анализах, при этом достаточно хорошо продемонстрирована подготовка патматериала пчел к исследованиям различными методами экстракции органическими растворителями [6].

Цель работы состояла в адаптации и оптимизации метода QuEChERS в пробоподготовке биоматериала к исследованию, а также в получении валидационных характеристик для газохроматографического анализа пестицидов в пчелином подморе.

Материалы и методы

Работа была выполнена в химико-токсикологическом отделе ОБУ «Курская областная ветеринарная лаборатория». Разработку и валидацию методики определения пестицидов в пчелином подморе проводили с применением современного оборудования и метода пробоподготовки. Таким образом, патологический материал пчел подготавливали к анализу на пестициды в соответствии с методическими рекомендациями метода QuEChERS (КУЭЧЕРС, Интерлаб, IL-5650- Экстракционный набор VetExQ, или другой стандартизованный QuEChERS). Определение пестицидов осуществлялось методом высокоэффективной газовой хроматографии на приборе «Хромос ГХ-1000» (Россия, ООО «Хромос»), с детектором по захвату электронов (ЭЗД) и капиллярной колонкой «VF-1701» for Pesticides (30м*0.32мм*0.25мкм).

Отбор патматериала пчел для анализа. Для подтверждения токсикоза и отравления медоносных пчел пестицидами в ветеринарную лабораторию следует направлять пробы трупов пчел, меда, пыльцы или перги, а также растения с обработанного участка для одновременного и сравнительного анализа. Соответственно, отбор проб и пересылка материалов осуществляется по установленной методике под контролем ветеринарного специалиста. Вместе с пробами в ветеринарную лабораторию направляется сопроводительный документ, в котором следует указать опись содержимого и предполагаемый пестицид или препарат, на который необходимо провести исследование. К сопроводительному письму должен быть прикреплен комиссионный акт о предположительном отравлении пчел. По установленным нормам, срок предоставления проб для исследования на пестициды не должен превышать 5-7 суток с момента отбора материала [8]. Для фосфорных пестицидов не более 3 суток.

Установлено, что для анализа на пестициды следует предоставлять в лабораторию среднее количество одной пробы до 300-500 пчел (около 25 г) от одной пчелиной семьи, около 300 г свежесобранного меда, сразу же после обнаружения токсикоза пчел, до 200 г перги в соте и около 500 г собранной зеленой массы с обработанного ядохимикатами участка. Каждый образец пробы должен быть упакован и предоставлен в соответствующем виде, то есть быть опечатанным, пронумерованным и с указанным номером пчелиной семьи. Также упаковка подразумевает исключение возможного соприкосновения и перемешивания проб в процессе доставки.

Методика пробоподготовки QuEChERS (рекомендации). Основной проблемой при анализе пестицидов в подморе пчел является отсутствие утвержденной методики пробоподготовки или методических рекомендаций, с описанием газохроматографических условий, приемлемых для определения ядохимикатов. Ко всему прочему, стоит отметить и то, что патологический материал подмора пчел трудно соотнести с конкретным биоматериалом, матрица которого имеет аналогичный компонентный состав, структуру и тип волокон, а также консистенцию, что позволило бы без труда определить подходящую методику пробоподготовки и условия хроматографического анализа при помощи переноса и верификации.

В данной работе была использована методика пробоподготовки QuEChERS, основанная на быстрой экстракции искомых компонентов при помощи растворителей и специально подобранных по составу и соотношению солей, а также качественной очистке аликвоты от мешающих анализу примесей (жиров, восков, пигментов и т.д.), что обеспечивается наличием надлежащего сорбента, после чего проба готова к измерению. Само слово QuEChERS является аббревиатурой, образованной от слов (quick, easy, cheap, effective, rugged, safe), характеризующих достоинства данного метода по его эффективности и точности. В силу того, что утвержденные методические указания на подготовку патматериала пчел к хроматографическому анализу пестицидов практически отсутствуют, то данный метод QuEChERS является актуальным и вполне реализуемым вариантом, который может быть использован для осуществления поставленной цели. Методические рекомендации по выделению пестицидов из биологической матрицы пчелиного подмора представлены ниже.

Для анализа следует тщательно перемешать и отобрать среднюю часть пробы пчелиного подмора. Из общей массы отмерить около 1 г (±0.1 г) биологического образца и максимально гомогенизировать в пластиковой пробирке. При необходимости проверки процента извлечения, к содержимому пробирки добавить 1 мл смеси стандартных образцов пестицидов с концентрацией, равной средней точке градуировки.

Экстракцию проводить внесением в пробирку от 5 до 10 мл ацетонитрила, после чего, в течение 1 минуты интенсивно встряхивать. Добавить 0.5 мл концентрированной соляной кислоты и перемешать. После экстракции растворителем добавить одну упаковку буферных солей из набора QuEChERS для усиленной экстракции компонентов. Центрифугировать в течение 10 минут при скорости 3500 об/ мин. Аликвоту верхнего слоя перенести в пробирку из набора объемом 15 мл, которая содержит сорбент для очистки экстракта. Провести повторную экстракцию 3-5 мл ацетонитрилом, центрифугировать и объединить слои в пробирке с сорбентом. Далее эту пробирку следует интенсивно встряхивать, а затем при тех же условиях центрифугировать. Верхнюю часть аликвоты упарить досуха в токе воздуха при 40-50°С. Сухой остаток восстановить в 1 мл н-гексана, пропустить через одноразовый шприцевой фильтр с порами 0.45 мкм в виалу для последующего хроматографического анализа.

Условия хроматографирования (рекомендации). Условия для хроматографического анализа пестицидов в биологическом материале указаны в таблице 1.

Таблица 1. Условия хроматографирования пестицидов