Сравнительная оценка каталазной активности и устойчивости к неблагоприятным факторам среды штаммов клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum и Sinorhizobium fredii селекции ВНИИ сои

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Сравнительная оценка каталазной активности и устойчивости к неблагоприятным факторам среды штаммов клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum и Sinorhizobium fredii селекции ВНИИ сои

М.В. Якименко, С.А. Бегун, А.И. Сорокина

Коллекционные штаммы клубеньковых бактерий сои Bradyrhizobium japonicum (Jordan, 1982) и Sinorhizobium fredii (Scholla, Elkan, 1984) различаются по стрессоустойчивости (повышенное содержание NaCl в питательной среде, повышенная температура выращивания) и обладают различной каталазной активностью. Высокую каталазную активность показали 10 % коллекционных штаммов B. japonicum и 12 % штаммов S. fredii, среднюю -- 13 % штаммов B. japonicum и 15 % штаммов S. fredii. У 40 % штаммов ризобий сои обоих видов каталазная активность не проявилась. Среди ризобий B. japonicum преобладали штаммы с умеренной каталазной активностью (44 %). Штаммы B. japonicum с повышенной каталазной активностью оказались устойчивыми к концентрации 8,5 г/л хлористого натрия в минерально-растительной среде и температуре выращивания +39...+40 С. Устойчивость штаммов S. fredii к неблагоприятным факторам среды была выше по сравнению со штаммами B. japonicum и не зависела от каталазной активности.

Ключевые слова: клубеньковые бактерии сои, ризобии, Bradyrhizobium japonicum, Sinorhizobium fredii, виды, штаммы, каталаза, стрессоустойчивость, солеустойчивость, температурный шок.

Comparative evaluation of catalase activity and resistance to unfavorable environmental factors of strains of nodule bacteria Bradyrhizobium japonicum and Sinorhizobium fredii, selected in ARSRI of Soybean.

M.V. YAKIMENKO, S.A. BEGUN, A.I. SOROKINA (All-Russian Scientific Research Institute of Soybean, Blagoveshchensk).

Collection strains of soybean nodule bacteria Bradyrhizobium japonicum (Jordan, 1982) and Sinorhizobium fredii (Scholla, Elkan, 1984) differ in stress tolerance (increased content of NaCl in the nutrient medium, increased growing temperature). It was established that the collection strains of B. japonicum and S. fredii have different catalase activity. 10 % of B. japonicum collection strains and 12 % of S. fredii strains showed high catalase activity, 13 % of B. japonicum strains and 15 % of S. fredii strains showed an average catalase activity. In 40 % of soybean rhizobia strains of both species, catalase activity was not revealed. Among the rhizobia of B. japonicum, strains with moderate catalase activity (44 %) prevailed. The strains of B. japonicum with increased catalase activity were resistant to concentration of 8.5 g/l sodium chloride in the mineral-plant medium and to growing temperature +39...+40 °С. The resistance of S. fredii strains to unfavorable environmental factors was higher compared with the strains of B. japonicum and did not depend on catalase activity.

Key words: soybean nodule bacteria, rhizobia, Bradyrhizobium japonicum, Sinorhizobium fredii, species, strains, catalase, stress tolerance, salt tolerance, temperature shock.

Введение

Особенностью почв южной сельскохозяйственной зоны Дальнего Востока России является широкое распространение в них клубеньковых бактерий сои родов Brady- rhizobium и Sinorhizobium, которые представляют важную составляющую биологических ресурсов.

Во Всероссийском научно-исследовательском институте сои (ВНИИ сои) в результате длительного поиска и отбора наиболее ценных по хозяйственно полезным свойствам штаммов из самых северных в мире природных популяций ризобий Восточно-Азиатского региона была создана уникальная коллекция чистых культур этих микроорганизмов. Большинство коллекционных штаммов выделено из почв Амурской области. Отдельные штаммы взяты из почв Еврейской автономной области, Хабаровского и Приморского краев, а также пограничных регионов Китая [10].

Детальное изучение культуральных, физиолого-биохимических и хозяйственно полезных свойств природных популяций ризобий (скорость роста, метаболическая активность, вирулентность, эффективность и др.) позволило выявить среди них два вида: медленнорастущий Bradyrhizobium japonicum (Jordan, 1982) и быстрорастущий Sinorhizobium fredii (Scholla, Elkan, 1984) [2]. В настоящее время лабораторная коллекция чистых культур ризобий насчитывает 103 штамма B. japonicum, 66 штаммов S. fredii и 101 штамм ризобий, выделенных из клубеньков других зернобобовых культур (арахис, люпин, вигна и др.).

Штаммы медленнорастущего вида в чашках Петри дают рост на 7-10-е и даже 20-е сут после посева. Они усваивают ограниченный набор источников углеродного питания с выделением продуктов метаболизма щелочного характера, обладают пониженной осмоустойчивостью, резко замедляют рост на кислых и щелочных питательных средах. В оптимальных условиях этот вид ризобий доминирует при нодуляции растений сои, обладая высокой и устойчивой вирулентностью.

Штаммы быстрорастущего вида в чашках Петри дают рост на 2-4-е сут после посева, хорошо усваивают широкий спектр источников углеродного питания с выделением продуктов метаболизма кислотного характера. Большинство штаммов этого вида обладает высокой осмоустойчивостью. Выделяется группа штаммов S. fredii с различной степенью газообразования [9].

Известно, что координация сложных метаболических превращений, протекающих в различных органеллах бактериальной клетки, может быть нарушена под влиянием внешних воздействий, в том числе стрессов, что сопровождается повышением уровня активных форм кислорода [8], которые играют роль ингибиторов процесса азотфиксации [7]. В процессе эволюции микроорганизмы выработали механизмы защиты от стрессов, основанные на детоксикации активных форм кислорода с участием антиоксидантной системы, одним из компонентов которой является фермент каталаза [4, 5]. В связи с этим актуальным представляется изучение сравнительной характеристики каталазной активности коллекционных штаммов ризобий сои и их стрессоустойчивости. Это позволит выявить среди них наиболее приспособленные к изменениям внешней среды.

В качестве стрессовых факторов в таких исследованиях обычно используют повышение содержания соли (NaCl) в питательной среде и температурный шок при выращивании чистых культур [3, 6].

Цель исследований - изучение каталазной активности и стрессоустойчивости штаммов клубеньковых бактерий сои видов B. japonicum и S. fredii из коллекции ВНИИ сои.

Объекты и методы

Объектами исследований являются чистые культуры ризобий сои видов B. japonicum и S. fredii. Типовой штамм В-1967 для вида B. japonicum получен из коллекции Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина (г. Пущино). Для S. fredii взят штамм КНРб из коллекции Института сельского хозяйства КНР (г. Харбин).

При выращивании чистых культур ризобий использовали минерально-растительную среду следующего состава, г/л: K₂HPO₄ - 0,5, KH₂PO₄ - 0,5, MgSO₄ - 0,1, CaSO₄ - 0,1, NaCl - 0,2, (NH₄)₆ Мо₇О₂₄ - следы; манит - 20,0, соевая мука - 10,0, агар-агар - 20,0 [1]. Каждый штамм высевали в две пробирки, после чего пробирки термостатировали при оптимальной (+26...+28 °С) температуре в течение 10 сут.

Интенсивность роста штриха ризобий определяли по балльной шкале: 0 - нет роста, 1 - скудный, 2 - умеренный, 3 - хороший, 4 - обильный рост.

Солеустойчивость оценивали по интенсивности роста штриха ризобий на минерально-растительной среде с повышенным содержанием NaCl (8,5 г/л). Термоустойчивость изучали по интенсивности роста штриха ризобий после термостатирования пробирок с засеянной культурой при повышенной (+39...+40 С) температуре в течение 10 сут. Каталазную активность определяли по интенсивности образования пузырьков кислорода при внесении в пробирки с культурой 1 мл 3%-й перекиси водорода. При этом использовался балльный метод оценки активности: высокая (+++), средняя (++), умеренная (+), ее отсутствие (-) [11]. Активность каталазы оценивали при комнатной температуре и после прогревания пробирки с чистой культурой при температуре 68 С в течение 30 мин, что позволило выявить термолабильность фермента.

каталазный клубеньковая бактерия соя

Результаты и обсуждение

Сравнительная оценка каталазной активности штаммов видов B. japonicum и S. fredii приведена в табл. 1. Коллекционные штаммы обладают различной каталазной активностью и могут быть разбиты на 4 группы - с высокой, средней, умеренной и нулевой активностью. Штаммов с высокой и средней каталазной активностью среди ризобий обоих видов было практически равное количество. Высокой каталазной активностью обладали 10 % коллекционных штаммов B. japonicum и 12 % штаммов S. fredii, средней - 13 % штаммов B. japonicum и 15 % штаммов S. fredii. У 40 % штаммов ризобий сои изучаемых видов каталазная активность не проявилась. Среди ризобий B. japonicum преобладали штаммы с умеренной каталазной активностью (44 %).

В целом коллекционные штаммы B. japonicum показали более высокую ферментативную активность, чем штаммы S. fredii.

Таблица 1

Общая характеристика коллекционных штаммов ризобий сои по каталазной активности