Генетическое разнообразие и дифференциация ценопопуляций сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), сформированных в болотных и суходольных экотопах

Исследования проведены на территории Республики Марий Эл, находящейся в среднем течении р. Волга на территории Среднего Поволжья. Среднее Поволжье расположено в Европейской части России между 54° и 58° с.ш. и между 44° и 52° в.д. В качестве объектов исследования подобраны две группы ценопопуляций сосны обыкновенной, произрастающие на песчаных почвах с разным режимом увлажнения на территории четырех лесничеств (табл. 1). Первая группа ценопопуляций представляла собой четыре суходольных насаждения, произрастающие на сухих и влажных песках. Возраст суходольных насаждений варьировал от 50 до 90 лет. Суходольные насаждения представлены сосняком лишайниковым (III класс бонитета), брусничным (I класс бонитета) и лишайниково-брусничным (II класс бонитета). Вторая группа ценопопуляций включала три насаждения сосны обыкновенной, сформированные на верховых болотах. Все болотные насаждения, сформированные в типе условия произрастания А представляли собой сосняк сфагновый (V класс бонитета). Для изученных болот характерен практически сплошной сфагновый покров, состоящий из нескольких видов сфагнума. Все ценопопуляции представляли собой либо чистые насаждения сосны обыкновенной, либо доля участия данного вида составляла 90%. С учетом того, что наиболее интенсивное изреживание древостоев в ходе естественного отбора у сосны обыкновенной наблюдается в возрасте до 40 лет, для исследований подобраны ценопопуляции возраста 40 лет и выше. Все насаждения находились на территории Республики Марий Эл, сформированы в однородных климатических условиях. В каждой из ценопопуляций для молекулярно-генетического анализа отобрано по 30 деревьев, произрастающих на расстоянии не менее 40-50 м друг от друга.

ДНК для анализа генетического полиморфизма выделена из камбиального слоя ствола с использованием СТАВ-метода [8]. Для выявления генетической изменчивости и дифференциации ценопопуляций применен ISSR-анализ с праймерами (САЕАССТ, (СА)АО, (CALGT, (CA)AC, (AGLT и (AG1GCT [9].

Для амплификации ДНК с ISSR-праймерами использована следующая реакционная смесь общим объемом 10 мкл: 1 мкл ПЦР-буфера; 0,2 мкл 10 мМ dNTPs; 0,1 мкл 100мкМ праймера; 1 мкл образца ДНК; 0,1 мкл Taq-полимеразы (2 ед/ мкл); 7,6 мкл воды. Режим ПЦР: 5 мин денатурация при 94°С, 35 циклов: 0,5 мин денатурация при 94°С, 45 с отжиг при 60°С, элонгация 45 с при 72°С, финальная элонгация в течение 7 мин при 72°С. ПЦР выполнена с использованием коммерческого набора Encyclo Plus PCR kit (ЗАО "Евроген", Россия) и термоциклера MJ MiniTM Gradient Thermal Cycler (Bio-Rad, США). Визуализация результатов ПЦР проведена путем электрофореза в 1,5% агарозном геле в ТВЕ буфере. Фиксирование результатов и обработка данных выполнены с использованием системы гель-документирования GelDoc 2000 (Bio-Rad, США) и программного пакета Quantity One® Version 4.6.3. Длины обнаруженных амплифицированных фрагментов ДНК рассчитаны по отношению к маркеру длин ДНК "100+ bp DNA Ladder" (ЗАО "Евроген", Россия). На основе анализа электрофореграмм составлены бинарные матрицы, в которых присутствующие ПЦР-фрагменты обозначались "1" (аллель 1), а отсутствующие "0" (аллель 0).

Таблица 1 [Table 1]

Местонахождение и характеристика ценопопуляций сосны обыкновенной в Республики Марий Эл

[Location and characteristics of the Pinus sylvestris L. coenopopulations in the Mari El Republic]

Продолжение табл. 1 [Table 1 (cont.)]

Окончание табл. 1 [Table 1 (end)]

Примечание. Состав: Ps - сосна обыкновенная Pinus sylvestis L., Bp - береза повислая Betulapendula Roth. Типы леса: бр - брусничный, лш - лишайниковый, бр-лш - бруснично-лишайниковый, сфаг - сфагновый.

[Note. Stand composition: Ps - Pinus sylvestis L., Bp - Betulapendula Roth. Forest type: ling - lingonberry, lich - lichen, ling-lich - lingonberry-lichen, sphag - sphagnum].

Расчет параметров генетической изменчивости и подразделённости це- нопопуляций выполнен в программе POPGENE 1.31 [10]. Генетическая дифференциация ценопопуляций оценивалась на основе анализа генетической дистанции Нея [11] и ""-статистики Нея [12]. Для оценки статистической значимости различий встречаемости аллелей использован х 2-тест, различия считались статистически значимыми при p<0,01. Дендрограмма генетического взаимоотношения ценопопуляций построена в программе POPTREEW [13] методом UPGMA на основе генетических дистанций Нея [11]. Анализ молекулярной вариансы (AMOVA) выполнен в программе GenAlEx [14], анализ главных координат (PCoA) и тест Мантеля для установления корреляции между матрицей географических и генетических дистанций по Нею выполнены с использованием программы PAST 3.25 [15].

Результаты исследования и обсуждение

ISSR-маркеры позволяют провести оценку уровня внутрипопуляционного и межпопуляционного генетического разнообразия, а также определить степень дивергенции популяций. ISSR-маркеры относятся к полилокус- ным ДНК-маркерам, у которых при использовании одного праймера обнаруживается множественное число локусов. В результате ПЦР с шестью ISSR-праймерами у 240 деревьев из семи ценопопуляций выявлено всего 215 локусов, из которых 208 оказались полиморфными. Количество локусов у разных праймеров варьировало от 27 до 40, а их длина находилась в пределах от 200 до 2 500 п.н. Из табл. 2 видно, что изученные ценопопуляции отличались по количеству обнаруженных ISSR-локусов.

Таблица 2 [Table 2]

Параметры генетического разнообразия ценопопуляций сосны обыкновенной [Genetic diversity indicators of Pinus sylvestris L. coenopopulations] (M±IHM) число аллелей на локус; Ne - эффективное число аллелей; He - ожидаемая гетерозиготность. [Note. N - Number of loci; P - Percentage of polymorphic loci; Na - Observed number of alleles per loci; Ne - Effective number of alleles; He - Expected heterozygosity].

Наименьшее количество ISSR-локусов обнаружено в суходольной ценопопуляции из Моркинского лесничества "МЛ" (162 шт.), в то время как наибольшее количество наблюдалось в болотной ценопопуляции "Илюшкино" (194 шт.).

Доля полиморфных локусов при 100-процентном критерии полиморфности в большинстве случаев оказалась выше у выборок деревьев из болотных ценопопуляций (79,3-88,5%) по сравнению с деревьями из суходольных насаждений (67,9-79,1%). Также для болотных ценопопуляций выявлены наибольшие значения наблюдаемого числа аллелей на локус (от 1,795 до 1,842). Напротив, для суходольных ценопопуляций установлены наименьшие значения наблюдаемого числа аллелей на локус (от 1,679 до 1,791). Интересно отметить, что суходольные ценопопуляции различались между собой в большей мере по эффективному числу аллелей и ожидаемой гетерозиготности, чем болотные. Об этом свидетельствует тот факт, что именно в суходольных ценопопуляциях выявлены как минимальные значения эффективного числа аллелей и ожидаемой гетерозиготности (1,279 и 0,174 соответственно), так и максимальные (1,331 и 0,207 соответственно). В целом значения основных показателей генетического разнообразия ISSR-маркеров свидетельствовали о высоком уровне генетического полиморфизма изученных болотных и суходольных ценопопуляций, так как полученные значения не уступали аналогичным показателям, установленным для сосны обыкновенной другими авторами с использованием того же вида ДНК-маркеров [9, 16].

Обобщенные значения параметров генетического разнообразия для суходольных и болотных ценопопуляций оказались близкими: доля полиморфных локусов составила 94,9 и 93,5%, наблюдаемое число аллелей - 1,949 и 1,935, эффективное число аллелей - 1,347 и 1,327 и ожидаемая гетерозиготность - 0,224 и 0,211 соответственно для суходолов и болот. Существенной зависимости уровня генетического разнообразия, выраженного через гетерозиготность, от почвенно-экологических условий не выявлено. Другими авторами на основе анализа разных видов молекулярных маркеров для популяций древесных видов также показано отсутствие связи между уровнем гетерозиготности и почвенно-экологическими условиями [5, 17, 18].

Свидетельством отличающейся генетической структуры может служить разная частота встречаемости ПЦР-фрагментов (аллелей). Анализ встречаемости ISSR-маркеров у обобщенных выборок деревьев из суходольных и болотных экотопов показал, что одинаковые ПЦР-фрагменты могут встречаться в разных ценопопуляциях как с близкой, так и с существенно различающейся частотой. Например, при использовании праймера (CA)6AC ПЦР-фрагмент длинной 2 500 п.н. обнаружен у 70% деревьев из болотных ценопопуляций. У группы деревьев из суходольных ценопопуляций тот же самый фрагмент найден только у 15% деревьев. В то же время для ряда ПЦР-фрагментов установлена близкая встречаемость у сравниваемых групп деревьев. Например, близкой встречаемостью характеризуются полученные с праймером (CA)6AC ПРЦ-фрагменты длинной 1 450, 740, 450 п.н. и др. Сравнение рядов распределения встречаемости ПЦР-фрагментов у выборок деревьев из болотных и суходольных экотопов выполнено на основе расчета критерия х 2 (табл. 3). Установлено, что различия математически значимы для 5 случаев из 6 (p<0,01). Только для праймера (AG)8T установлено, что частоты встречаемости ПЦР-фрагментов у выборок деревьев из болотной и суходольных ценопопуляций отличались статистически не значимо. Выявленная статистическая значимость различий встречаемости ISSR-маркеров, полученных с пятью праймерами, позволяет говорить об отличающейся генетической структуре болотных и суходольных ценопопуляций сосны обыкновенной, сформированных в относительно однородных климатических условиях в пределах Республики Марий Эл. Формирование отличающейся генетической структуры может происходить вследствие ярко выраженной репродуктивной изоляции между суходольными и болотными популяциями, выявленной ранее для сосны обыкновенной [6]. Ранее также были установлены различия в количестве аллелей аллозимных локусов для насаждений сосны обыкновенной и сосны черной, произрастающих в разных почвенноэкологических условиях [5, 17].

Таблица 3 [Table 3] Результаты х 2-теста встречаемости ISSR-маркеров в болотных и суходольных ценопопуляциях

[Result of Chi-square tests for occurrence of ISSR-markers in the bog land and dry land coenopopulations]

[Table х 2, p<0.01],,

Примечание. * статистически не значимо (р<0,01). [Note. * not significant, p<0.01].

Наименьшие генетические дистанции Нея установлены между выборками деревьев из суходольных ценопопуляций "ML" и "PL" (0,100) и между болотными ценопопуляциями "Izi Kup" и "45 km" (0,111). Самые большие значения генетической дистанции Нея выявлены между древостоем болота "Изи Куп" и суходольным насаждением "PL" (0,317), а также между болотной ценопопуляцией "45 km" и суходольной ценопопуляцией "KL" (0,308). Построенная методом UPGMA дендрограмма показала, что болотные насаждения составляют отдельный кластер (рис. 1). Это может указывать на наличие генетических процессов, обусловливающих дивергенцию суходольных и болотных ценопопуляций сосны обыкновенной.

Рис. 1. UPGMA дендрограмма, построенная с использованием генетической дистанции по Нею между болотными и суходольными ценопопуляциями.

В узлах ветвления приведены значения бутсрэп-поддержки (10 000 репликаций) [Fig. 1. UPGMA tree constructed using Nei's genetic distances of bog land and dry land coenopopulations]

На основе результатов анализа главных координат (PCoA) все изученные ценопопуляции можно разделить на 3 группы (рис. 2). В первую группу отнесены все болотные ценопопуляции (Изи Куп, Илюшкино и 45 км), вторую группу составили суходольные ценопопуляции из Пригородного лесничества (PL), Моркинского лесничества (ML) и Учебно-опытного лесничества (UOL).

Рис. 2. Расположение в пространстве главных координат (PCoA) деревьев сосны обыкновенной из суходольных и болотных ценопопуляций [Fig. 2. Projection of Pinus sylvestris L. individuals from upland and bog land coenopopulations on the two-coordinate system according to the PCoA analysis]

* UOL; ? KL; x ML; A PL; Izi Kup; ¦ Ilushkino; + 45 km

Обособленное положение ценопопуляции из Килемарского лесничества (KL) может быть объяснено некоторым удалением данного насаждения от всех других, вследствие чего может наблюдаться изоляция расстоянием. Для оценки влияния изоляции расстоянием выполнен тест Мантеля, который показал наличие слабой положительной корреляции между генетической и географической дистанциями для изученных ценопопуляций сосны обыкновенной (R = 0,3085, p = 0,1728).

Анализ молекулярной дисперсии (AMOVA) показал, что в составе общей генетической изменчивости 9% генетического разнообразия приходилось на изменчивость между группами суходольных и болотных ценопопуляций, 13% - на изменчивость между ценопопуляциями внутри групп и 78% - на внутрипопуляционный полиморфизм (табл. 4).

Оценка структуры генетического разнообразия и дифференциации по ISSR-локусам выполнена путем расчетов ожидаемой доли гетерозиготных генотипов во всей выборке (HT), ожидаемой доли гетерозиготных генотипов в ценопопуляциях (HS) и показателя генетической подразделённости (GST) (табл. 5). Ожидаемая доля гетерозигоных генотипов для всех суходольных и болотных ценопопуляций, а также ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в отдельных суходольных и болотных ценопопуляциях оказались близкими (0,222 и 0,211; 0,192 и 0,192 соответственно). Суходольные ценопопу- ляции более генетически дифференцированы друг от друга по сравнению с болотными, на что указывает большее значение показателя генетической подразделенности GST (0,138 против 0,093).

Таблица 4 [Table 4]

Значения молекулярной вариансы (AMOVA) в ценопопуляциях сосны обыкновенной [Values of molecular variance (AMOVA) for Pinus sylvestris coenopopulations]

Таблица 5 [Table 5]

Показатели структуры генетического разнообразия и дифференциации болотных и суходольных ценопопуляций сосны обыкновенной

[Indicators of the structure of genetic diversity and differentiation of the bog land and dry land Pinus sylvestris coenopopulations] (M±mM

Показатель генетической подразделённости всех изученных ценопопуляций (Gst) составил 0,170, а это означает, что основная доля полиморфизма ISSR-локусов (0,83) приходится на изменчивость внутри насаждений сосны обыкновенной. Сосредоточенность основной части генетического полиморфизма внутри популяций древесных видов также выявлена с использованием анализа аллозимов [5], ISSR-маркеров [9], SNPs [19] и ядерных микросателлитов [20]. Необходимо отметить, что установленная генетическая подразделённость географически близких болотных и суходольных ценопопуляций сосны обыкновенной по ISSR-маркерам превышает уровень подразделённости, выявленный ранее с использованием такого же набора праймеров, для насаждений сосны обыкновенной, находящихся на расстоянии 150-600 км друг от друга (0,170 против 0,127) [21]. Данный вывод согласуется с результатами исследования роли экологических факторов в формировании генетической структуры популяций ели европейской, в ходе которых выявлен более высокий эффект экологической изоляции по сравнению с влиянием изоляции расстоянием [22].

Заключение