Применение современных средств стерилизации для введения в культуру in vitro чеснока (Allium Sativum L.)

¹ Федеральный научный центр овощеводства (филиал Всероссийский научно-исследовательский институт овощеводства) д. Верея,

² Московский государственный областной университет г. Mыmищи

Аннотация

Цель. Исследование эффективности различных дезинфицирующих препаратов для стерилизации растительного материала чеснока при введении в культуру in vitro.

Процедура и методы. Стерилизацию растительного материала проводили по двухступенчатой схеме. Были использованы хлорсодержащие и четвертичные аммонийные соединения, водорастворимые гранулы «Главхлор», концентрированные жидкие препараты «Део-бактер» и «Мегацид». Препараты применяли в концетрации от 1 до 3% по действующему веществу и экспозиии 20 минут.

Результаты. Исследования показали, что препарат «Главхлор» при стерилизации растительного материала чеснока позволяет получить до 90% свободных от инфекции эксплантов, а препарат «Мегацид» позволяет снизить уровень контаминации на 7-29%. Использование препарата «Део-бактер» оказалось малоэффективным.

Теоретическая и/или практическая значимость. Доказано, что препарат «Главхлор» можно использовать в качестве альтернативного средства для стерилизации растительного материала при введении в культуру in vitro.

Ключевые слова: чеснок, воздушная луковичка, эксплант, стерилизация, донце

Чеснок является исключительно вегетативно размножаемым растением. В связи с этим проблема инфицированное посадочного материала этого культурного вида растения стоит особенно остро. Стандартные схемы получения посадочного материала чеснока предусматривают двухили трёхлетнюю, трудоёмкую и энергозатратную, технологию производства. Поэтому рынок постоянно испытывает недостаток, а зачастую, и отсутствие, высококачественного посадочного материала этой культуры. Для скорейшего насыщения отечественного рынка высококачественным посадочным материалом чеснока, отвечающим современным требованиям производства, необходимо совершенствование всех этапов биотехнологического процесса [2].

На этапе введения в культуру при стерилизации растительного материала необходимо максимально снизить уровень инфицированности Для стерилизации материала применяют различные химические соединения и препараты на их основе. По действующему веществу стерилизующие препараты делятся на хлор-, кислород-, спиртосодержащие, четвертичные аммонийные (ЧАС), фенольные и некоторые другие соединения Наиболее часто используют препараты, содержащие в качестве действующего вещества активный хлор. Соединения хлора обладают сильным окислительным действием. При взаимодействии с водой большинство хлорсодержащих соединений образуют хлорноватую кислоту с отщепляющимся атомарным кислородом, благодаря которому происходит разрушение клеток микроорганизмов По спектру противомикробной активности хлорсодержащие препараты характеризуются выраженным фунгицидным, бактерицидным, вирулицидным, а также спороцидным эффектом. К положительным свойствам относится достаточно быстрое время воздействия на микроорганизмы. В группу хлорсодержащих препаратов входит гипохлорит натрия натриевая соль хлорноватистой кислоты (№ОС1), которая выпускается как в чистом виде, так и в виде различных торговых брендов для дезинфекции: «Белизна» и некоторые другие. Гипохлорит натрия производят в жидком виде различной концентрации (от 9 до 17%), недостатком является неустойчивость при хранении.

В биотехнологической практике работы с растениями не нашли широкого применения твёрдые водорастворимые соединения на основе хлора, хотя в медицинской и ветеринарной области их используют для стерилизации материалов и инструментов. Чаще всего применяется натриевая соль дихлоризоциануровой кислоты (ДХЦК, ДХЦА). Как правило, это водорастворимые гранулы или таблетки различных торговых марок: «Главхлор», «Ока-таб», «Дезхлор» и др.

В настоящее время широкое применение в качестве стерилизаторов наш ли четвертичные аммонийные соединения (ЧАС) это органические соли с четвертичным атомом азота в качестве характерной химической группы. Антимикробное действие ЧАС имеет множественный характер, они проникают через стенки клеток, нарушают физиологические процессы, вызывают распад белков, тем самым ингибируют рост микроорганизмов и развитие спор Положительными свойствами соединений являются низкая летучесть, высокая моющая способность и низкая токсичность. К отрицательным свойствам следует отнести недостаточную активность в отношении грамотрицательных бактерий и простых вирусов, низкую спороцидность [1]. К таким препаратам относятся «Деобактер» с содержанием алкилдиметилбензиламмоного хлорида (АДБАХ) 18% и «Мегацид», содержащий Ы,Ы -бис(3-аминопропил)додециламин 6% идидецилдиметиламмоний хлорид 4%.

Хозяйственное мыло это смесь водорастворимых натриевых или калиевых солей высших жирных кислот до 72% и щелочей до 20%. Высокое содержание щелочей обусловливает антимикробное действие, а жирные кислоты моющую способность Положительным качеством хозяйственного мыла является его низкая токсичность и высокая моющая способность Хозяйственное мыло используется на предварительном этапе обеззараживания материала для освобождения его от загрязнений и частичной дезинфекции.

Обязательным компонентом процесса стерилизации является этиловый спирт Он обладает выраженным бактерицидным и вирулицидным действием, обусловленным денатурацией белков микроорганизмов, но не имеет спороцидного эффекта. 70%-ным этиловым спиртом дезинфицируют растительный материал, руки и инструменты

В отделе биотехнологии ВНИИО филиала ФГБНУ ФНЦО разработана методика получения in vitro посадочного материала чеснока озимого (Allium sativum L), согласно которой для стерилизации растительного материала используется многоступенчатая технология [4]. Она включает в себя применение в качестве стерилизующих агентов растворов хозяйственного мыла, перманганата калия, 70%-ного спирта, «Белизны». Многоступенчатая технология позволяет использовать различные стерилизующие агенты, последовательно уничтожая патогенные микроорганизмы. В целом процесс стерилизации можно разделить на два этапа:

1. Промывка растительного сырья с использованием моющих средств На этом этапе растительный материал преимущественно освобождается от поверхностных минеральных и биологических загрязнений

2. Этап стерилизации в ламинарном боксе, включающий в себя обработку этиловым спиртом для обезжиривания и усиления проникновения стерилизующих веществ внутрь растительного материала и стерилизацию сильнодействующим агентом.

Подобной схемы стерилизации придерживаются многие учёные в России и за её пределами [1; 3; 4; 5]. Индийские учёные в 2018 г. при создании протокола регенерации нескольких сортов местного чеснока для введения в культуру использовали трёхэтапную подготовку материала, которая предусматривала применение 20% раствора гипохлорита натрия [6]. В 2013 г. D. S. Scotton и др. [9] при введении в культуру апексов корней предварительно простерилизованных зубков чеснока использовали 2,5% раствор гипохлорита натрия в течение 20 минут. В 2014 г. J. Gyll [7] и др. для изучения влияния различных фитогормонов на размножение чеснока, а также E. I. Metwally [8], исследуя образование адвентивных побегов на корневых апексах и меристемных зонах чеснока, использовали для стерилизации 5%-ный раствор гипохлорита натрия.

Польскими учёными [10] было исследовано сочетание хлори кислородсодержащих препаратов и показана высокая эффективность их совместного применения. В качестве хлорсодержащего агента был использован препарат АСЕ с содержанием гипохлорита натрия 4,85% и 30%-ная перекись водорода. Комбинация этих препаратов позволила получить до 100 % стерильных эксплантов медвежьего лука (Allium ursinum L.).

При исследовании стерилизующего эффекта комбинации препаратов было отмечено, что применение четвертичных аммонийных соединений на первом этапе дезинфекции снижает уровень инфицированности эксплантов на 7,4-29,6 %. Так, при использовании хозяйственного мыла в сочетании с «Белизной» уровень инфицированности составил 81,5 %, а при использовании препарата «Мегацид» 74,1% В комбинации прпепаратов: мыло и «Део-бактер», а также «Део-бактер» и «Мегацид» применение препарата «Мегацид» снизило инфицированность с 72,7% до 43,1%, соответственно Необходимо отметить, что использование этого препарата позволило уменьшить долю эксплантов, поражённых бактериями. При использовании хозяйственного мыла уровень бактериального загрязнения составил 52,7%, а при использовании препарата «Мегацид» 31,4%. Применение препарата «Главхлор» показало его высокую эффективность как при использовании в сочетании с раствором мыла, так и при использовании с препаратом «Мегацид», что позволяет применять этот препарат в качестве основного стерилизующего агента при введении в культуру воздушных луковичек чеснока. Уровень инфицированности в двух комбинациях составил 32,7-40,4% (табл. 1).

Таблица 2 / Table 2

Влияние различных стерилизующих препаратов в концентрации 3% по д.в. на инфицированность эксплантов чеснока озимого / Effect of various sterilizing agents at an active substance in concentration of 3% on the infection rate of winter garlic explants

Таблица 3 / Table 3

Влияние стерилизующих препаратов на инфицированность эксплантов чеснока ярового с предварительной обработкой раствором препарата «Мегацид» в концентрации 3% по д.в. / Effect of sterilizing preparations on the infection rate of spring garlic explants with pretreatment with a solution of the preparations “Megacid” at an active substance concentration of 3%

При дальнейшем изучении действия дезинфицирующих препаратов была подтверждена высокая стерилизующая способность препарата «Главхлор». При его использовании в среднем инфицированность воздушных луковичек составила 12,4 %, в то время как при использовании препарата «Белизна» 32%. Использование препарата «Део-бактер» не дало достоверных различий по сравнению с контролем, а применение препарата «Мегацид» показало результат значительно ниже контрольных (табл. 2).

Высокая эффективность препарата «Главхлор» подтвердилась в последующих опытах При использовании в качестве эксплантов донца зубка чеснока ярового для введения в культуру применение препарата «Главхлор» в концентрации 3% по д в и экспозиция 20 минут в качестве основного стерилизующего агента позволило получить 90% неинфицированных эксплантов, при этом не наблюдалось бактериальной заражённости (табл. 3).

Заключение

Выявлена высокая эффективность хлорсодержащего препарата «Главхлор» (водорастворимые гранулы, ООО «Авантсепт-Медикал, Россия) при стерилизации растительного материала чеснока для введения в культуру ш vгfmИшользование препарата «Главхлор» в концентрации 3 % по д.в. и экспозиции 20 минут с предварительной обработкой препаратом «Мегацид» (жидкий концентрат, производитель ООО «Самарово»,

Россия) в концентрации 3 % по д. в. и экспозиции 20 минут позволяет получить 90% свободных от инфекции эксплантов и эффективно проводить культивирование в условиях in vitro.

ЛИТЕРАТУРА