Удосконалення методики полімеразної ланцюгової реакції в режимі реального часу для детекції ДНК вірусу африканської чуми свиней

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія аграрних наук України

Інститут ветеринарної медицини НААН

Удосконалення методики полімеразної ланцюгової реакції в режимі реального часу для детекції ДНК вірусу африканської чуми свиней

Ситюк М.П., д-р вет. наук, ст. наук. сп.,

Тарасов О.А., к-д вет. наук, ст. наук. сп.,

Гладій М.В., д-р екон. наук, проф., академік НААН

Анотація

В статті наведені результати наукових досліджень щодо удосконалення методики постановки полімеразної ланцюгової реакції в режимі реального часу для виявлення ДНК вірусу африканської чуми свиней. Для детекції ДНК вірусу африканської чуми свиней використовували наступні праймери: АЧС F - CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA, АЧС R - GATACCACAAGATCAGCCGT, АЧСprobe - FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG- TAMRA. Оптимізовано протокол дослідження ПЛР у реальному часі для детекції вірусу АЧС, при цьому найнижча кількість для успішної постановки діагнозу складає 1 х 103 ГЕ/см3 вірусу. Найнижчі стандартне відхилення та коефіцієнт варіації були визначені при температурі 58°C (SD 0,16%, CV 2,02). Отримані дані також свідчать про високу збіжність результатів якісного виявлення ДНК вірусу АЧС.

Ключові слова: африканська чума свиней, полімеразна ланцюгова реакція у режимі реального часу, праймери, валідація.

Abstract

IMPROVEMENT OF THE REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION METHODOLOGY FOR DETECTION OF AFRICAN SWINE FEVER VIRUS DNA / Sytiuk M., Tarasov O., Hladiy M.V.

Introduction. Currently, a significant number of effective different methods for ASF diagnosing have been developed worldwide, among which the leading role is played by the polymerase chain reaction (PCR) in its various variants.

The goal of the work. To improve the methodology of real-time polymerase chain reaction for detection of African swine fever virus DNA.

Materials and methods. For the detection of ASF virus DNA, primers were used for the conserved 250 base pairs (bp) region of the B646L gene, which encodes the P72 protein.

For DNA extraction, a commercial reagent kit Allprep DNA/RNA Kit (QIAGEN) was used.

Samples of biological material from the collection of the IVM NAAN were used in the study. The following primers were used to detect African swine fever virus DNA: ASF F - CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA, ASF R - GATACCACAAGATCAGCCGT, ASF probe - FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA.

Results of research and discussion. The amplification parameters varied at annealing temperatures (Ta) of 50°C, 53°C, 55°C, 58°C, and 60°C (Table 3). At the same time, for annealing temperatures of 50°C (SD 1.57%), 53°C (SD 0.64%), and 60°C (SD 0.84%), the SD value was greater than 0.5, which is beyond the range of reliability, and the lowest SD was found for the temperature of 58°C (SD 0.16%).

As a result of the studies, it was found that the optimal annealing temperature for primers in real-time PCR reconstruction is 58°C.

The confidence interval of the analytical sensitivity of the method at 1*105 GE/cm3, 1*104 GE/cm3 and 1*103 GE/cm3 is 100%. However, at 1*102 GE/cm3 and 1*101 GE/cm3, the confidence interval of the analytical sensitivity of the method was 50% and 20%, respectively. At the same time, the coefficient of variation was 1.48, 0.65 and 2.57, respectively, which confirms the high convergence of the results. An important result of the research is that the chosen methodology is well suited for routine screening programs, as it has high analytical sensitivity. The detection limit established in the present study is slightly higher than that described by the authors who performed real-time PCR analysis with the same target gene.

The high limit of analytical sensitivity of the test is an important parameter when, during screening studies, obtaining false-negative results carries the risk of spreading a dangerous infection among the pig population.

Conclusions and prospects for further research.

The real-time PCR protocol for detecting the ASF virus was optimized, with the lowest amount for a successful diagnosis being 1*103 GE/cm3 of virus.

The lowest standard deviation and coefficient of variation were found at 58°C (SD 0.16%, CV 2.02).

The data also indicate a high convergence of the results of qualitative detection of ASF virus DNA.

Further research will improve protocols for the detection of African swine fever virus by real-time PCR.

Keywords: African swine fever, real-time polymerase chain reaction, primers, validation.

Вступ

Африканська чума свиней (АЧС) - особливо небезпечна вірусне захворювання домашніх та диких свиней, що в останні 10 років завдає великих збитків галузі свинарства України та має тенденції до постійного розповсюдження в її межах. Оскільки засобів специфічної профілактики з АЧС в світі не існує, а лікування неефективне та заборонено, саме своєчасна й ефективна діагностика виступає одним з головних атрибутів у комплексі заходів з профілактики та боротьби з цією хворобою [1-3]. Наразі у світі розроблено значну кількість ефективних різних методів діагностики АЧС, серед яких провідну роль відводиться полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР) у різних її варіантах [4-8].

В Україні, зокрема Інститутом ветеринарної медицини Національної академії аграрних наук України (ІВМ НААН) розроблено декілька вітчизняних діагностичних тест-систем [9, 10], однак роботи по удосконаленню методики продовжуються.

Мета роботи. Удосконалити методику постановки полімеразної ланцюгової реакції в режимі реального часу для виявлення ДНК вірусу африканської чуми свиней методом ПЛР-РЧ.

Матеріали і методи досліджень

Для детекції ДНК вірусу АЧС було використано праймери до консервативної ділянки гену B646L розміром 250 пар нуклеотидів (п.н.), що кодує білок P72.

Для екстракції ДНК використовували комерційний набір реагентів Allprep DNA/ RNA Kit (QIAGEN).

У роботі використовували генетичний матеріал, виділений від загиблих від АЧС свиней, з колекції ІВМ НААН. За підготовки дослідних зразків використовували: шафу біологічної безпеки 2 клас, виробник ESCO;

центрифугу з охолодженням Z 32 НК, Z 216 -МК (Hermle Labortechnik); центрифугу-міні вортекс FVL-2400N, (BioSan); шейкер лабораторний Vortex Genius-3 (Ika Werke); ваги лабораторні AXIS A500; млин ножовий (блендер) лабораторний Grindomix GM 200 (Retsch).

Реакційну суміш готували у боксі для ПЛР PCR-4A1 (ESCO), при цьому використовували комерційно доступні мастермікс Universal qPCR Master Mix (New England Biolab, USA).

Ампліфікацію виділених нуклеїнових кислот проводили за допомогою приладів: Rotor-Gene Q (виробник QIAGEN Hilden, Німеччина) та CFX96 (BioRad, США).

Оцінку якості нуклеїнових кислот здійснювали за допомогою спектрофотометра NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, USA), кількість ДНК визначали за допомогою приладу Qubit v3 (Thermo Scientific, USA).

Підготовку проб та проведення ПЛР проводили у відповідності до діючих вимог до проведення молекулярно-генетичних досліджень . Для проведення реакції використовували 5мкл виділеної ДНК.

В таблиці 1 представлена нуклеотидна послідовність та характеристика використаних праймерів та флуоресцентних зондів.

Таблиця 1 Характеристика олігонуклеотидних праймерів та флуоресцентних зондів ген B646L вірусу АЧС

Валідацію проводили за показниками чутливості, специфічності, збіжності й відтворюваності.

Для проведення досліджень використовували програму ампліфікації, зазначену в таблиці 2.

Таблиця 2 Програма ампліфікації для виявлення ДНК вірусу АЧС методом ПЛР у реальному часі

Статистичну обробку одержаних результатів проводили з використанням програми StatPlus методами описової статистики, включаючи визначення середньоквадратичного відхилення (SD) та коефіцієнту варіації (CV).

Результати досліджень та їх обговорення

Параметри ампліфікації порівнювали за температур відпалу (Ta) 50°C, 53°C, 55°C, 58°C та 60°C (табл. 3). При цьому для температур відпалу 50°С (SD 1,57%), 53°С (SD 0,64%), і 60°С (SD 0,84%) показник SD був більше 0,5, що виходить за межі діапазону достовірності, а найменьше SD встановлено для темепартури 58°C (SD 0,16%).

В результаті проведених досліджень встановлено, що оптимальною температурою відпалу праймерів в рекації ПЛР у реальному часі є 58°C.

Таблиця 3 Результати оптимізації температури відпалу (Та) ПЛР в реальному часі

Примітка: * Сі - пороговий цикл

Температура 55°C SD 0,39) також відповідає вимогам оптимізованого протоколу, але оптимальною ми визначили температуру 58°C (SD 0,16) із найменьшим стандартним відхиленням, цю температуру ми використовували для подальших досліджень. Ці дані підтверджують результати, отримані D.P King et al. (2003) [6].

Для визначення межі чутливості методу виділену ДНК збудника розводили до концентрацій від 1*105 ГЕ/ см3 до 1x100 ГЕ/ см3 (1ГЕ в данному випадку відповідає приблизній масі 6,27 пікограма).

Результати досліджень наведено в таблиці 4. Дані таблиці свідчать, що довірчий інтервал аналітичної чутливості методу при кількості 1*105 ГЕ/ см3, 1x104 ГЕ/см3 та 1х103 ГЕ/см3 становить 100%. Однак, при кількості 1x102 ГЕ/см3 та 1Х101 ГЕ/см3, довірчий інтервал аналітичної чутливості методу становив 50% та 20% відповідно. При цьому коефіціент варіювання становив 1,48; 0,65 та 2,57 відповідно, що підтверджує високу збіжність результатів. олігонуклеотидний праймер вірус чума

Таблиця 4 Визначення межі чутливості виявлення вірусу АЧС методом ПЛР в реальному часі (Сі)

Таким чином, для довірчого інтервалу 100% межа виявлення становить не менше 1x 103 ГЕ/см3.

Згідно з даними, наведеними в табл. 4, мінімальне значення Ct становило 15,78, максимальне - 27,12, а середнє значення SD становило від 0,25 до 0,11, що підтверджує збіжність та відтворюваність результатів, оскільки це значення не повинно бути більше 0,5. При цьому коефіціент варіювання складав 2,02.

Для визначення специфічності та для точної ідентифікації ДНК в зразках різного генезу, використано позитивні та негативні зразки, при цьому підтверджено специфічність вибраних праймерів у відношенні до збудника АЧС (табл. 5).

Таблиця 5 Результати дослідження специфічності методу ПЛР в реальному часі

Важливим результатом проведених досліджень є те ,що обрана методологія добре підходить для рутинних скринінгових програм, оскільки має високу аналітичну чутливість. Межа виявлення, встановлена за проведення досліджень, є 1x103 ГЕ, що вище за ту, що описана авторами, які проводили ПЛРаналіз у реальному часі з тим самим геном -мішенню, яка складала 102 ГЕ [11-12].

Висока межа аналітичної чутливості тесту є важливим параметром, коли під час скринінгових досліджень отримання хибнонегативних результатів несе ризик поширення небезпечної інфекції серед популяції свиней .

Висновки та перспективи подальших досліджень

1. Оптимізовано протокол дослідження ПЛР у реальному часі для детекції вірусу АЧС, при цьому найнижча кількість для успішної постановки діагнозу складає 1x103 ГЕ/см3 вірусу.

3. Отримані дані також свідчать про високу збіжність результатів якісного виявлення ДНК вірусу АЧС.

В подальших наукових дослідженнях планується порівняти оптимізований протокол із наявними на ринку комерційними тест-наборами.

Reference

1. Ministry of agriculture and food production of Ukraine. (2014). Instruktsiya shchodo profilaktiki ta borotbi z afrikanskoyu chumoyu sviney [Regulations on the prevention and control of African swine fever]. Ministry of Agrarian Policy and Food of Ukraine on 05.03.2014 No. 81 [in Ukrainian].

2. Gallardo, C., Reoyo, A.T., Fernandez-Pinero, J., et al. (2015). African swine fever: a global view of the current challenge. Porcine Health Management, 1(1), 14.

3. OIE. (2008). African swine fever. OIE Terrestrial Manual, Chapter 2.8.1, 1069-1082.

4. Nevolko, O.M., Sushko, M.I., Sapachova, M.A., Marushchak, L.V., & Piatenko, S.O. (2014). Diagnostychni skhemy vykorystannya laboratornykh metodiv pry afrikanskii chumi sviney [Diagnostic schemes for the use of laboratory methods in African swine fever]. Veterynarna biotekhnolohiia - Veterinary biotechnology, 25, 67-70 [in Ukrainian].

5. Tignon, M., Gallardo, C., Iscaro, C., et al. (2011). Development and inter-laboratory validation study of an improved new real-time PCR assay with internal control for detection and laboratory diagnosis of African swine fever virus. Journal of VirologicalMethods, 178(1-2), 161-170.

6. King, D.P., Reid, S.M., Hutchings, G.H., et al. (2003). Development of a TaqMan PCR assay with internal amplification control for the detection of African swine fever virus. Journal of Virological Methods, 107(1), 53-61.

7. Wang, K., Wang, X., Liu, Y., et al. (2019). Development of a recombinase polymerase amplification assay for African swine fever virus detection. Journal of Virological Methods, Vol. 276, 113761.

8. Sanchez-Vizcaino, J., Mur, Y., Martinez-Lopez, J.C. (2012). African swine fever virus: a review. Viruses, 4, 1536-1558.

9. Mandyhra, S.S., Myzykina, L.M., Ishchenko, L.M., Kovalenko, H.A., Halka, I.V.,

10. Sytyuk, M.P., Nychyk, S.A., & Spiridonov, V.G. (2017). Rozrobka test-sistemy dlia diferentsiinoi diagnostyky afrykanskoi ta klasychnoi chumy svynei metodom ZT-PLR u rezhymi realnoho chasu [Development of a test kit for differential diagnosis of African and classical swine fever by real-time PCR]. Veterynarna biotekhnolohiia - Veterinary biotechnology, 31, 101-109.

11. Mandygra, S.S., Muzykina, L.M., Ishchenko, L.M., Halka, I.V., Spiridonov, V.G., Sityuk, M.P., & Nychyk, S.A. (2017). Pidbir praimeriv ta optymizatsiia metodu PLR dlia detektsii DNK virusu AChS [Selection of primers and optimization of PCR method for detection of ASFV DNA]. Veterynarna medytsyna - Veterinary Medicine, 103, 304-306 [in Ukrainian].

12. Sun, Q., Zhao, Y., Xu, Z. et al. (2019). Emergence and spread of African swine fever virus variant, China 2018. Emerging Infectious Diseases, 25, 1431-1433.

13. Vu, T.H.T., Pham, A., Nguyen, T., et al. (2020). Clinical and virological features of African swine fever in domestic pigs in Vietnam 2019. Transboundary and Emerging Diseases, 67, 1393-1399.

Размещено на Allbest.ru