Дослідження вмісту окремих захисних низькомолекулярних протеїнів хлоропластів у сортів озимої пшениці різної жаро-посухостійкості

Размещено на http://allbest.ru

Інститут фізіології рослин і генетики

Національної академії наук України

Відділ фізіології та екології фотосинтезу

Дослідження вмісту окремих захисних низькомолекулярних протеїнів хлоропластів у сортів озимої пшениці різної жаро-посухостійкості

Шевченко Віктор Валентинович Д-р. біол. наук,

старший науковий співробітник

Бондаренко Оксана Юріївна канд. біол. наук,

науковий співробітник

Україна

Анотація

Фенотипування сучасних сортів озимої пшениці за стійкістю до впливу таких абіотичних чинників, як висока температура та посуха, є одним із важливих завдань фізіологів рослин. Особливе значення для вирішення цього питання набуває пошук різних генетичних та фізіологічних маркерів. Тому нами були проведені дослідження вмісту трьох захисних низькомолекулярних протеїнів хлоропластів, 21, 16,5 та 14 кДа, у десяти сортів озимої пшениці різної жаро-посухостійкості. В результаті було встановлено, що вміст цих протеїнів був нижчим у нестійких сортів і підвищувався у більш стійких сортів. Було отримано високий коефіцієнт кореляції між показником жаро-посухостійкості та вмістом протеїнів 21 та 16,5. Зроблено висновок, що вміст в хлоропластах протеїнів 21 та 16,5 кДа може бути одним із маркерів жаро-посухостійкості.

Ключові слова: Triticum aestivum L., озима пшениця, фотосинтез, захисні низькомолекулярні протеїни фотосинтетичного апарату, жаро-посухостійкість.

Глобальне потепління клімату супроводжується грунтовою посухою та підвищеною температурою [1]. Через вплив цих двох факторів сільське господарство зазнає значних збитків. Так, для озимої пшениці, яка є однією з стратегічних продовольчих культур для людства, втрати врожайності через посуху можуть сягати 60-80 % [2].

Фотосинтетичний апарат рослини, який забезпечує рослину енергією та асимілятами, є основною структурою рослинного організму, що страждає через вплив посухи та високої температури.

За дії посухи, в першу чергу, відбувається закриття продихів, що призводить до порушення транспірації [3]. Також чутливими до дії посухи та пов'язаним із нею підвищенням температури листка є кисень-виділяючий комплекс, фотосистема ІІ, електрон-транспортний ланцюг та Рубіско-активаза. Порушення електронного транспорту призводить до продукування активних форм кисню, які руйнують, в першу чергу, фотосистему ІІ та викликають перекисне окиснення ліпідів.

У рослини є кілька механізмів для запобігання дії осмотичного стресу. Один з них це синтез антиоксидантних ферментів, які нейтралізують активні форми кисню [5]. фізіологічний рослина озимий пшениця

Вважається, що стійкість рослинного організму до стресу на 70 % залежить від стійкості його фотосинтетичного апарату, як основного процесу, що забезпечує рослинний організм енергією для подолання стресу. Тому вивчення особливостей організації фотосинтетичного апарату у сортів з різною стійкістю до дії стресу має важливе значення для розробки критеріїв відбору на жаро-посухостійкість.

В умовах глобального потепління клімату зусилля багатьох дослідників і селекціонерів направлені на виведення сортів культурних рослин, стійких до посухи та підвищенних температур. Значний інтерес також проявляється до пошуку маркерів стійкості для фенотипування нових сортів [6]. Однак пошук генетичних маркерів ускладнюється тим, що стійкість до підвищених температур є полігенною ознакою. Тому разробка підходів до фенотипування сортів на основі оцінки стійкості фотосинтетичного апарату являється перспективною.

Для дослідження використані 10 різних сортів озимої пшениці. Сорти з невисокої стійкістю - Поліська 90, Перлина Лісостепу, Дарунок Поділля; середньої стійкості - Наталка, Ладижинка, Достаток; високої стійкості - Подолянка, Астарта, Куяльник, Одеська 267.

Озиму пшеницю висівали на ділянках розміром 3х1 м у вересні місяці. Грунт сірий-підзолистий, внесення NPK стандартне, за технологією вирощування.

Для виділення хлоропластів відбирали верхні, прапорцеві листки на фазі колосіння-цвітіння. Листки гомогенізували 2 хвилини на гомогенізаторі MPW - 302 (Польща) в середовищі, що містило 50 мM трицину pH 7,6, 0,4 М сахарози, 10 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2. Після чого гомогенат пропускали через 2 шари бязі та центрифугували на центрифузі К-13А (Німеччина) 5 хвилин зі швидкістю 400 g для осадження фрагментів клітин, крохмальних зерен, тощо. Супернатант центрифугували вдруге протягом 10 хвилин зі швидкістю 1000 g, отримуючи в осаді фракцію хлоропластів.

Осад ресуспендували, пропускаючи його через капрон, в 10 мМ трициновому буфері pH 7,6 з додаванням 0,1 M сахарози, 10 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2.

Електрофорез хлорофіл-білкових комплексів проводили у поліакриламідному гелі [7]. Розподільний гель містив 12 % акріламіду, 0,1 % бісакріламіду, 6 М сечовину, 0,375 М Tris-HCl (pH 8,9), 0,003 % персульфату амонію, 0,0003 % TEMED. Концентруючий гель містив 8 % акріламіду, 0,1 % бісакріламіду, 6 М сечовину, 0,175 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,003 % персульфату амонію, 0,0003 % TEMED.

Зразки, що містили 5 мкг хлорофілу, інкубували 16 годин при кімнатній температурі з додаванням буфера (1/6 від об'єму зразка), який в кінцевому об'ємі складався з 2 % SDS, 3 % гліцерину. Перед інкубацією в зразки додавали меркаптоетанол до кінцевої концентрації в зразках 10 %.

Електрофорез проводили з використанням Tris-glycine буферної системи за методикою Лаеммлі. Потужність електричного току при електрофорезі складала 1,5 W на пластину. Гель фарбували органічним барвником Brilliant Blue R в водному розчині 10 % оцтової кислоти з додаванням 30 % етанолу 12 годин при кімнатній температурі. Обезбарвлювання гелю проводили в водному розчині, що містив 10 % етанолу та 10 % оцтової кислоти. Пластинки гелю сканували на сканері “Mustek ScanExpress 12000P", реєстрограми обробляли за допомогою комп'ютерної програми обробки гелей “ScnImage". Для ідентифікації смуг використовували суміш маркерних білків фірми “SIGMA", USA.

Статистичний аналіз проводили за стандартними програмами MicrosoftExel. Середні значення розраховували за даними не менше п'яти дослідів при 3-5 аналітичних повторностях. Рівень значущості 0,95.

В нашій роботі проведені дослідження вмісту у фотосинтетичних мембранах хлоропластів різних сортів озимої пшениці ряду захисних низькомолекулярних протеїнів. Ці дослідження спрямовані на більш глибоке розуміння структурно-функціональних механізмів стійкості та лабільності фотосинтетичного апарату до впливів різноманітних факторів навколишнього середовища. Білок 21 кДа - водорозчинний хлорофіл-білок що стабілізує ФС ІІ. Дослідження адаптацій рослин до осмотичних стресів виявили присутність білків 20-22 кДа (з різних джерел), що має гомологію з WSCP (WSCP - watersoluble chlorophyl-protein) - водорозчинний хлорофіл-білок, що індукується сольовим стресом. Раніше було показано, що накопичення мРНК-22 поліпептиду індукується сольовим стресом та посухою [8]. Передбачено, що цей білок зменшує протеазну активність в адаптованих до посухи листках, чим затримує їхнє руйнування [9]. Білок 16 кДа сприяє тримеризації ФСІ та її стабілізації. Білок 14 кДа необхідний для забезпечення необхідної конформації для щільного зв'язування Ca++ та Cl-.

У більш посухостійких сортів спостерігали високу інтенсивність забарвлення зони осідання досліджуваних білків.

На рис. 1. представлені електрофоретичні доріжки осідання білків 21, 16,5 та 14 кДа.

Рис. 1. Електрофореграми білків хлоропластів з рослин озимої пшениці сортів (за номерами доріжок) 1, 2 - Перлина Лісостепу; 3 - Астарта; 4 - Подолянка; 5 - Ладижинка; 6 - Достаток; 7 - Куяльник; 8,9 - Поліська 90; 10, 11 - Дарунок Поділля; 12, 13 - Наталка; 14 - Одеська 267

В таб. 1. представлені розраховані значення відносного вмісту цих протеїнів у хлоропластах різних сортів.

Таблиця 1

Вміст низькомолекулярних протеїнів в ізольованих хлоропластах з листків різних за толерантністю до посухи сортів озимої пшениці

При аналізі даних видно, що найвищі показники вмісту протеїнів 21 та 16,5 кДа були у сортів Одеська 267, Подолянка, Куяльник, Астарта та Достаток. За результатами сортовипробування всі ці сорти мають оцінку жаро - посухостійкості 8-9 балів. Найменший вміст показали сорти з невисокою жаро-посухостійкістю, яка оцінюється у 5-6 балів - Перлина Лісостепу та Поліська 90. Інші сорти, які відрізняються середньою жаро-посухостійкістю, Ладижинка, Наталка, Дарунок Поділля, та мають у сортовипробуванні оцінку 7-8 балів, зайняли проміжне положення за відносним вмістом протеїнів 21 та 16,5 к Да.

Слід відзначити, що протеїн 14 кДа не показав такої чіткої залежності. Так у сортів з найнижчою жаро-посухостійкістю, Перлина Лісостепу та Поліська 90, його відносний вміст був самий низький, але інші сорти середньої та високої жаро-посухостійкості показали практично близькі значення його відносного вмісту.

За одержаними результатами був проведений кореляційний аналіз залежності між вмістом протеїнів 21 та 16,5 кДа. Результати представлені на рис. 2 та 3.

Рис. 2. Кореляційна залежність між вмістом протеїну 21 кДа та жаро - посухостійкістю різних сортів озимої пшениці

Рис. 3. Кореляційна залежність між вмістом протеїну 16,5 кДа та жаро - посухостійкістю різних сортів озимої пшениці

Як можна бачити з наведених рисунків, для обох протеїнів та показником жаро-посухостійкості отримано високий рівень кореляційної залежності. Критерій r2 показав значення 0,93 та 0,96 між вмістом протеїнів 21 кДа та 16,5 кДа і оцінкою жаро-посухостійкості, відповідно.

Висновки

Таким чином, проведені дослідження дозволяють зробити висновок, що відносний вміст захисних низькомолекулярних мембранних протеїнів хлоропластів, 21 та 16,5 кДа може бути використаний як один із критеріїв для оцінки стійкості селекційного матеріалу при створенні нових сортів озимої пшениці та їхнього фенотипування.

Список використаних джерел

[1] Lesk, C., Rowhani, P. & Ramankutty, N. (2016). Influence of extreme weather disasters on global crop produktion. Nature, 529(7584), 84-87. https://doi.org/10.1038/nature16467.

[2] Zulkiffal, M., Ahsan, A., Ahad, J. & Musa, M. (2021) Heat and Drought Stresses in Wheat (Triticum aestivum L.): Substantial Yield Losses, Practical Achievements, Improvement Approaches, and Adaptive Mechanisms. In book: Plant Stress Physiology. https://doi.org/10.5772/intechopen.92378.

[3] Киризий, Д.А., и др., Т.М. (2014). Ассимиляция СО2 и механизмы ее регуляции. Фотосинтез. (Т. 2, с. 87-300) Київ: Логос. ISBN 978-966171-896-7.

[4] Креславский, В.Д. и др. (2007) Молекулярные механизмы устойчивости фотосинтетич. аппарата к стрессу. Биологические мембраны,(3), 195-217.

[5] Morgun, V.V., Stasik, О.О., Kirizy, D.A. & Sokolovska-Sergienko, O.G. (2019). Effect of drought on photosynthetic apparatus, activity of antioxidant enzymes, and productivity of modern winter wheat varieties. Regulatory Mechanisms in Biosystems, (10), 16-25. https://doi.org/10.15421/021903.

[6] Стасик, О.О., Кірізій, Д.А. & Прядкіна, Г.А. (2021). Фотосинтез і продуктивність: основні наук. досягнення та інноваційні розробки. Фізіологія рослин і генетика, (53), 160-184. https://doi.org/10.15407/frg2021.02.160.

[7] Anderson, J.M. (1989). The Grana Margins of Plant Thylakoid Membranes. Physiol. Plant, (76), 243-248.

[8] Xiong, L., Schumaker, K.S. & Zhu, J.-K. (2002). Cell signaling during cold, drought and salt stress. Plant cell, (14), 165-183. https://doi.org/10.1105Ilami R. (2001). Water-Soluble Chlorophyll Protein in Brassicaceae Plants is a Stress-Induced Chlorophyll-Binding Protein. Plant and Cell Physiology, (42), 906-911. https://doi.org/10.1093/pcp/pce117.

Размещено на Allbest.ru