Вплив 24-епібрасиноліду на Bradyrhizobium japonicum у чистій культурі та симбіозі з рослинами сої

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Інститут фізіології рослин і генетики Національної академії наук України

Вплив 24-епібрасиноліду на Bradyrhizobium japonicum у чистій культурі та симбіозі з рослинами сої

Л.І. Рибаченко, С.Я. Коць, К.П. Кукол,

П.П. Пухтаєвич, О.Р. Рибаченко, Л.А. Кудрявченко

Брасиностероїди (БС) -- група рослинних стероїдних гормонів, які регулюють широкий спектр фізіологічних реакцій, зокрема, подовження клітин, фотоморфогенез, диференціювання ксилеми, проростання насіння тощо. Вони сприяють формуванню бобово-ризобіальних симбіотичних систем. Прикладні дослідження вказують на потенційно складну роль цих гормонів в утворенні бульбочок із позитивними і негативними ефектами. Саме тому дослідження, спрямовані на вивчення їх участі у процесах формування та функціонування симбіозу, актуальні. Мета нашої роботи полягала у тому, щоб з'ясувати, як впливає 24-епібрасинолід (24-ЕБЛ) на ріст Bradyrhizobium japonirnm у чистій культурі та реалізацію азотфіксувального потенціалу в симбіозі з рослинами сої. Виявлено, що штам B. japonirnm РС08 не мав вираженої реакції на застосування 24-епібрасиноліду в досліджуваних концентраціях 5 * 10--⁴ і 1 * 10--⁵ г/л. Як позитивний, так і негативний вплив досліджуваної речовини на ріст ризобій цього штаму був незначним або повністю відсутнім. Додавання фітогормона у середовище вирощування бульбочкових бактерій штаму B. japonicum Т21-2 стимулювало наростання маси ризобіальних клітин. У контрольованих умовах вегетаційного досліду встановлено, що 24-епібрасинолід забезпечував збільшення кількості кореневих бульбочок незалежно від концентрації та способу його застосування. Відмічено істотний вплив залученого в роботу фітогормону в концентрації 1 * 10--⁵ г/л на ріст кореневої системи рослин сої. Отже, у результаті наших досліджень виявлено зміни ростової активності ризобій за впливу 24-епібрасиноліду. При цьому ефект від його застосування значною мірою визначав штам B. japonicum, який ми використовували. Зроблено припущення, що реакція на застосування 24-епібрасиноліду залежить від властивостей і походження штаму. Підтверджено позитивний вплив 24-епібрасиноліду на кількість утворених кореневих бульбочок на пізніх етапах формування симбіотичного апарату. Виявлені нами зміни азотфіксувальної активності симбіотичних систем за впливу 24-епібрасиноліду свідчать на користь гіпотези про те, що брасиностероїди впливають на функціонування кореневих бульбочок.

Ключові слова: Bradyrhizobium japonirnm, регулятори росту, 24-епібрасинолід, нодуляційна активність, азотфіксація, соя.

EFFECT OF 24-EPIBRASSINOLIDE ON BRADYRHIZOBIUM JAPONICUM IN PURE CULTURE AND IN SYMBIOSIS WITH GLYCINE MAX

L.I. Rybachenko, S.Ya. Kots, K.P. Kukol, P.P. Pukhtaievych, O.R. Rybachenko, L.A. Kudryavchenko

Institute of Plant Physiology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv

Brassinosteroids are a group of plant steroid hormones that regulate a wide range of physiological responses, including cell elongation, photomorphogenesis, xylem differentiation, seed germination, etc. It has been proven that these hormones contribute to the formation of legume-rhizobia symbiotic systems. Applied research indicates the potentially complex role of brassinosteroids in the formation of nodules with both positive and negative effects. Therefore, research aimed at studying their role in the processes of symbiosis formation and functioning remains relevant. The aim of the study was to investigate the effect of 24-epibrassinolide on growth indicses of Bradyrhizobium japonicum in pure culture and realization of their nitrogen-fixing potential in symbiosis with soybean plants. It was found that the B. japonicum PC08 strain did not show a pronounced response to the application of concentrations 5 * 10~⁴, 1 * 10~⁵ g/L of 24-epibrassinolide. Both positive and negative effects of the tested substance on the growth dynamics of this strain were weakly expressed or completely absent. The addition of this phytohormone to the growth medium of the rhizobial strain B. japonicum T21-2 led to stimulation of the growth of rhizobial cells. It was found that 24-epibrassinolide provided an increase in the number of root nodules, regardless of its concentration and the method of application. It had a significant effect on the growth of the root system of soybean plants, while its use as a component of the inoculation suspension in concentration 1 * 10~⁵ g/L was more effective. As a result of our research, changes in the dynamics of rhizobia growth under the influence of 24-epibrassinolide were revealed. The effect of its application was largely determined by the strain of B. japonicum that we used. We believe that the reaction to the use of 24-epibrassinolide depends on the properties and origin of the strain. The positive effect of 24-epibrasinolide on the number of formed root nodules at the late stages of the formation of the symbiotic apparatus was confirmed. Recorded changes in nitrogen-fixing activity of symbiotic systems under the influence of 24-epibrasinolide indicate that brassinosteroids effect on the functioning of root nodules.

Key words: Bradyrhizobium japonirnm, growth regulators, 24-epibrassinolide, nodulation activity, nitrogen fixation, soybean.

Вступ

На сьогодні ефективне функціонування агропромислового комплексу ґрунтується не лише на досягненні високої продуктивності культурних рослин, а й екологічній безпеці отриманого урожаю. Тобто, основою конкурентоздатної сільськогосподарської продукції на світовому ринку є як економічні критерії її вартості, так і суворий контроль якості та безпеки [1, 2].

Важливе економічне та екологічне значення під час вирощування бобових культур має процес симбіотичної азотфіксації. Залучення бобово-ризобіального симбіозу в сільськогосподарське виробництво є альтернативним шляхом забезпечення культурних рослин біологічно чистим азотом, що допомагає отримувати високі врожаї екологічно безпечної продукції рослинництва [3]. Одним із важливих чинників підвищення ефективності азотфіксації може бути використання регуляторів росту рослин разом з інокуляцією насіння.

Дослідники встановили, що крім регуляції фізіологічних процесів у рослинному організмі ці сполуки позитивно впливають також на розвиток і функціонування мікрофлори ґрунту [4]. Передусім вони активізують мікробіологічні процеси в зоні кореневої системи. Разом з цим здатні стимулювати органогенез кореневих бульбочок і забезпечувати формування потужного симбіотичного апарату. Їх участь у нодуляційному процесі може бути прямою чи опосередкованою, зокрема на біохімічному рівні, коли вони виступають аналогами фітогормонів. При цьому ефект від застосування регуляторів росту визначається природою речовин у їх складі, генотипом макросимбіонта, ступенем комплементарності сортів із гомологічними ризобіями [5].

Особливу увагу слід звернути на брасиностероїди (БС). Це група полігідроксильованих стероїдних фітогормонів, необхідних для розвитку, росту і формування урожаю рослин. Вони беруть участь у регуляції поділу, подовження та диференціації багатьох типів клітин протягом усього життєвого циклу рослини [6]. До цієї групи фітогормонів входить понад 70 представників, серед яких найактивнішим є 24-епібрасинолід. БС відіграють ключову роль у підтриманні нормального росту рослин як за оптимальних умов, так і під впливом несприятливих чинників середовища. Вони зв'язуються зі специфічними рецепторами та опосередковують їх дію через каскад сигнальної трансдукції, що в кінцевому підсумку веде до зміни експресії тисяч ядерних генів, залучених до регуляції різноманітних функцій рослинного організму. Крім специфічних білків у трансдукції беруть участь універсальні сигнальні медіатори небілкової природи, такі як іони кальцію, активні форми кисню, оксид азоту (NO), сірководень (H₂S), а також компоненти ліпідного сигналу [7].

Встановлено, що екзогенні брасиностероїди, зокрема епібрасинолід і епікастастерон, зв'язуються з рослиною специфічними рецепторними кіназами BRI-1 на поверхні плазматичної мембрани, що приводить до запуску брасиностероїдспецифічних сигнальних реакцій та модифікації метаболічних і фізіологічних процесів. Активація BRI-1рецепторів сприяє стимуляції входу Са²+ крізь плазматичну мембрану в клітину та зростанню цитоплазматичної активності Са²+ [8].

Відомо, що обробка брасиностероїдами впливає на нодуляційні процеси та активність фіксації азоту в Arachis hypogaea L., Glycine max (L.) Merr., Pisum sativum L. [9, 10]. Проте літературні дані щодо впливу цих сполук на ризобії та подальше утворення симбіозу досить суперечливі. Зокрема, доведено, що екзогенні брасиностероїди здатні посилювати процеси нодуляції, а обробка ними рослин під час вегетації підвищує також азотфіксувальну активність [11]. Водночас встановлено, що у гіпернодулювального мутанта сої обробка брасиностероїдами листків, навпаки, пригнічувала формування кореневих бульбочок та азотфіксувальну активність залежно від дози нанесеного препарату. Однак на рослини дикого типу БС не діяли. За обробки листків рослин дикого типу брасиназолом -- інгібітором біосинтезу брасиностероїдів -- кількість бульбочок збільшувалась і значно сповільнювалось подовження стебла.

Ендогенні брасиностероїди також впливають на формування кореневих бульбочок. Так, встановлено, що у брасиностероїддефіцитних мутантів гороху утворювалось значно менше бульбочок, ніж у рослин дикого типу [12, 13].

З вищеописаних результатів досліджень чітко видно, що брасиностероїди активно залучаються у процеси нодуляції й азотфіксації. Проте, на жаль, залишається ще багато невивчених запитань, зокрема, підбір максимально ефективних сполук, їх концентрацій і способів застосування. Тому ми поставили собі за мету з'ясувати вплив 24-епібрасиноліду на ріст B. japonicum у чистій культурі та реалізацію їх азотфіксувального потенціалу в симбіозі з рослинами сої.

Методика

У дослідженнях використано 2 штами бульбочкових бактерій із музейної колекції азотфіксувальних мікроорганізмів відділу симбіотичної азотфіксації Інституту фізіології рослин і генетики НАН України (ІФРГ НАН України): Bradyrhizobium japonicum Т21-2 і РС08. Перший штам отриманий шляхом міжвидової кон'югації B. japonicum 646 і Escherichia coli S17-1. У геномі клітин бульбочкових бактерій цього штаму наявний фрагмент гену неоміцинфосфотрансферази транспозону Тп5 завдовжки 517 пн, що відрізняє його від вихідного штаму і забезпечує стійкість до канаміцину сульфату в концентрації 200 мг/мл. Штам Т21-2 характеризується підвищеною продукцією екзополісахаридів, непатогенний, з високою екологічною пластичністю та конкурентоздатністю. Штам B. japonicum РС08 виділений із бульбочок сої сорту Київська 27, що росла на темно-сірому опідзоленому ґрунті. Він висококонкурентоздатний і має велику технологічність [14].

Бактерії культивували за 26--28 °С на манітно-дріжджовому середовищі такого складу, г/л: KH₂PO₄ -- 0,5; MgSO₄ -- 0,2; NaCl -- 0,1; дріжджовий екстракт -- 1,0; маніт -- 10,0 [15]. Перед висівом ризобій у відповідних варіантах у середовище вирощування вносили 24епібрасинолід у концентраціях 5 * 10--⁴, 1 * 10--⁵ г/л. Контроль -- культивування ризобій без застосування епібрасиноліду (Т21-2 -- контроль 1; РС08 -- контроль 2). Посівний матеріал у колби вносили у концентрації 2 % об'єму поживного середовища, чисельність ризобій у суспензії становила 10⁸ кл/мл. Культуру вирощували методом періодичного інкубування на кругових качалках у колбах Ерленмейера, що містили 200 мл поживного середовища. Чистоту культури перевіряли шляхом її висівання на м'ясо-пептонний агар, на якому ризобії не ростуть. Приріст біомаси мікроорганізмів контролювали на 3-тю та 4-ту доби культивування за показником оптичної густини, яку вимірювали спектрофотометром Shimadzu UV-1900 (Японія) за довжини хвилі 600 нм. Чисельність мікроорганізмів у бактеріальній суспензії визначали методом послідовних розбавлень.

Вегетаційні досліди проводили на базі ІФРГ НАН України. У відповідних варіантах насіння сої сорту Алмаз перед посівом інкубували у розчинах 24-ЕБЛ (1 год) та інокулювали (1 год) бульбочковими бактеріями штаму Т21-2 (чистими або з додаванням відповідних концентрацій 24-ЕБЛ) за такою схемою:

1) B. japonicum Т21-2 + насіння (контроль);

2) [B. japonicum Т21-2 + 24-ЕБЛ (1 * 10--⁵ г/л)] + насіння;

3) [в. japonicum Т21-2 + 24-ЕБЛ (5 * 10--⁴ г/л)] + насіння;

4) [насіння + 24-ЕБЛ (1 * 10--⁵ г/л)] + B. japonicum Т21-2;

5) [насіння + 24-ЕБЛ (5 * 10--⁴ г/л)] + B. japonicum Т21-2.

Сою вирощували по 6 рослин у 4-кілограмових посудинах, за природних освітлення і температури, оптимального водозабезпечення (60 % повної вологоємності (ПВ)). Як субстрат використовували промитий річковий пісок. Джерелом мінерального живлення слугувала поживна суміш Гельригеля, збагачена мікроелементами: молібденом, бором, марганцем і міддю, збіднена на азот -- 0,25 норми (1 норма азоту відповідає 708 мг Са^0₃)₂ * 4H₂O на 1 кг субстрату).

Відбір зразків для аналізу процесів формування і функціонування симбіотичного апарату, а також оцінювання показників вегетативної маси проводили у фази трьох справжніх листків, бутонізації та цвітіння.

Нодуляційну активність ризобій визначали підрахуванням кількості бульбочок на коренях рослин і вимірюванням їх маси. Азотфіксувальну активність симбіотичних систем визначали ацетиленовим методом [16]. Газову суміш аналізували на хроматографі Agilent GC System 6850 (США). Азотфіксувальну активність виражали в мікромолях утвореного етилену за 1 годину (мкмоль С₂Н₄/год) на рослину.

Морфометричні показники визначали зважуванням надземної і кореневої маси рослин.

Результати у таблицях наведено у вигляді середніх арифметичних значень та їх стандартних похибок ^±SE). Достовірність відмінностей між вибірками оцінювали методом однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA), за якого відмінності вважаються значущими, якщо p < 0,05 (з поправкою Бонферроні).

Результати та обговорення

Аналіз результатів досліджень показав, що додавання до середовища вирощування ризобій 24-ЕБЛ у концентрації 1 * 10--⁵ г/л мало вираженіший стимулювальний ефект на чисельність ризобіальних клітин штаму Т21-2 порівняно із концентрацією 5 * 10--⁴ г/л (табл. 1). Зокрема зафіксовано зростання досліджуваного показника відносно контролю 1 на 3-тю добу культивування на 10 %, на 4-ту -- на 20 %. Концентрація 24-ЕБЛ 5 * 10--⁴ г/л також чинила стимулювальний ефект на приріст біомаси ризобіальних клітин цього штаму. Так, на 3-тю добу вирощування бактерій спостерігалася лише тенденція до зростання досліджуваного показника, тоді як на 4-ту добу зафіксовано достовірне збільшення чисельності мікробних клітин відносно контролю 1 на 19 %.

Показано, що штам РС08 не мав вираженої реакції на застосування 24-ЕБЛ. Жодна із досліджуваних нами концентрацій цього регулятора росту не викликала істотних змін у динаміці росту бактеріальної культури РС08. Винятком була 3-тя доба культивування ризобій, коли зафіксовано незначне зниження досліджуваного показника відносно контролю 2 на 7 і 8 % у варіантах із концентрацією 24-ЕБЛ 5 * 10--⁴ та 1 * 10--⁵ г/л відповідно (див. табл. 1).

Можливо, виявлена нами різниця у реакції обраних штамів на застосування епібрасиноліду пов'язана із методом їх одержання. Як вище зазначено, штам Т21-2 отриманий методом транспозонового мутагенезу, а отже, є стійкішим до впливу несприятливих чинників різного походження та дії елементів хімічної природи. Крім цього, він характеризується підвищеною продукцією екзополісахаридів, що надає йому додаткової стійкості до впливу різних штучно синтезованих речовин [14].

Отже, ми встановили, що ефект від застосування 24-ЕБЛ значною мірою залежить від штаму ризобій, який ми використовували. Штам бульбочкових бактерій РС08 не мав вираженої реакції на застосування досліджуваних концентрацій 24-ЕБЛ. Як позитивний, так і негативний вплив досліджуваної речовини на ріст ризобій цього штаму був незначним або повністю відсутнім. В той самий час додавання фітогормону у середовище вирощування ризобій штаму Т21-2 привело до стимуляції наростання маси ризобіальних клітин.

епібрасинолід bradyrhizobium japonicum соя

ТАБЛИЦЯ 1. Чисельність ризобіальних клітин (кл/мл, х108) 24-епібрасиноліду (х+SE, n = 9) за впливу різних концентрацій

Примітка. Різні літери верхніх індексів ^{a b c> d} у стовпчиках вказують на значення, які істотно різняться між варіантами, що визначено порівнянням за допомогою тесту Тукі (р <0,05) з поправкою Бонферроні (^{a b} -- вірогідно між варіантами у стовпчику для штаму Т21-2; ^{с> d} -- вірогідно між варіантами у стовпчику для штаму РС08).

Біологічною особливістю сої як бобової культури є здатність утворювати високоефективні азотфіксувальні симбіози з бульбочковими бактеріями, у результаті діяльності яких ґрунти збагачуються доступними для рослин формами азоту [17].

Встановлено, що вирощування ризобій на середовищі з додаванням 24-ЕБЛ у концентрації 1 * 10--⁵ г/л сприяло зростанню відносно контрольних рослин не лише кількості й маси кореневих бульбочок на 39 і 38 % відповідно, а й їх азотфіксувальної активності (АФА) на 59 % у фазу трьох справжніх листків. Аналогічну ситуацію ми спостерігали і у фазу цвітіння, коли досліджувані показники зростали на 63, 22 та 47 % відповідно. У фазу бутонізації виявлено підвищення лише показників АФА на 15 %, кількість і маса кореневих бульбочок залишалися на рівні контрольних рослин (табл. 2).

Концентрація 24-ЕБЛ 5 * 10--⁴ г/л приводила до збільшення кількості бульбочок відносно контролю у фазу трьох справжніх листків на 61 %, бутонізації -- на 19 %, цвітіння -- на 23 %. При цьому їхня маса була на рівні контрольних рослин у фази трьох справжніх листків і цвітіння, лише у фазу бутонізації перевищувала його на 29 %. АФА бульбочок, сформованих на коренях рослин цього варіанта, підвищувалась у процесі вегетації сої, починаючи з показника 1,56 мкмоль С₂Н₄/(рослину * год) у фазу трьох справжніх листків, який на 38 % був нижчим від показника контрольних рослин, до 9,23 мкмоль С₂Н₄/(рослину * год) у фазу цвітіння, що на 73 % перевищував контрольні рослини.

Виявлено, що ефект від застосування епібрасиноліду для обробки насіння значною мірою залежав від фази розвитку рослин і концентрації препарату (табл. 2). Так, 24-ЕБЛ у концентрації 1 * 10--⁵ г/л не впливав на АФА симбіотичних систем у рослин цього варіанта. Показник був на рівні контрольних рослин, за винятком фази бутонізації, коли зафіксовано його збільшення на 14 %. Аналіз нодуляційної активності ризобій показав істотне зростання кількості та маси бульбочок (90 і 115 % відповідно) на коренях рослин цього варіанта у фазу трьох справжніх листків. У фази бутонізації та цвітіння зміни виявлено лише у кількості бульбочок, яка збільшувалася відносно контролю на 30 і 108 % відповідно.

Обробка насіння 24-ЕБЛ у концентрації 5 * 10--⁴ г/л, як і у випадку з концентрацією 1 * 10--⁵ г/л, сприяла зростанню кількості кореневих бульбочок відносно контрольних рослин у всі досліджувані нами фази розвитку сої, а саме: на 51 % -- фаза трьох справжніх листків, на 52 % -- фаза бутонізації, на 47 % -- фаза цвітіння. За АФА симбіотичні системи цього варіанта перевищували контрольні у фазу трьох справжніх листків на 52 %, тоді як у фазу бутонізації на 25 % були нижчими від нього (див. табл. 2).

Чітке розуміння впливу брасиностероїдів на процеси формування і функціонування симбіотичних структур на сьогодні відсутнє. Це пов'язано з тим, що більшість ранніх досліджень ролі цих сполук у формуванні бульбочок ґрунтувались на застосуванні синтетичних БС та інгібіторів біосинтезу БС, тому дали неоднозначні результати, включаючи як позитивні, так і негативні ефекти цих сполук на утворення бульбочок у деяких бобових культур [18].

ТАБЛИЦЯ 2. Формування та функціонування симбіотичної системи соя--Bradyrhizobium japonicum Т21-2 за впливу 24-епібрасиноліду (кількість (шт/рослину), маса (г/рослину), АФА (мкмоль С2Н4/(рослину * год)) кореневих бульбочок) (x±SE, п = 12)