Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

на тему: «Биосенсоры для детекции сульфоароматических и фенольных соединений на основе бактерий родов Comamonas и Pseudomonas деструкторов п-толуолсульфоната и фенола»

Макаренко Александр Александрович

Саратов - 2007

Работа выполнена в лаборатории биосенсоров Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) учебного центра биохимии и физиологии микроорганизмов Пущинского государственного университета

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

А.Н. Решетилов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

О.В. Игнатов

доктор биологических наук, профессор

А.А. Щербаков

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха,

г. Москва

Защита состоится «__» 2007 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН.

Автореферат диссертации размещен на сайте

http://www.ibppm.saratov.ru/obyav_dis.html « » 2007 г.

Автореферат разослан «__»______________2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук В.Е. Никитина

Содержание

Введение

1. Исследование способности микроорганизмов к деградации толуолсульфоната (ТС)

2. Разработка микробного сенсора для определения ТС

3. Разработка микробного сенсора для детекции фенола

4. Разработка микробного биосенсора для детекции фенола

5. Возможные пути решения практических задач с применением биосенсорного подхода

Выводы

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Введение

биосенсер детекция бактерия деструктор фенол

Актуальность проблемы. В условиях современного интенсивного промышленного производства значительно возросла нагрузка на объекты окружающей среды, что выразилось ее значительным загрязнением токсичными соединениями. Фенольные и сульфоароматические соединения, которые широко применяются в химической промышленности и в ряде случаев в значительных количествах попадают в водные экосистемы, относятся к классам поллютантов, наносящих существенный ущерб окружающей среде. Так, в мире, согласно литературным данным, ежегодно производится более 50000 тонн фенолов и пентахлорфенолов, 40000 тонн монохлорфенолов, более 2 млн. тонн сульфонатов. Соответственно, высок и уровень загрязнения окружающей среды в процессе производства. В частности, по Российской Федерации в 1999 году в поверхностные водные источники поступило 60 тонн фенолов; только по Архангельской области в 2002 году сброс фенола в поверхностные водные источники составил 5,5 тонн. Выраженная во всем мире тенденция к уменьшению антропогенного воздействия на окружающую среду приводит к ужесточению требований экологического законодательства. На многих предприятиях, в частности, на нефтеперерабатывающих заводах, принадлежащих корпорации Тюменская Нефтяная Компания & British Petroleum(ТНК-BP), вводятся в действие корпоративные стандарты по охране окружающей среды, соблюдение которых относится к приоритетным направлениям работы корпорации. В связи с этим задача обнаружения токсичных веществ, в частности, фенолов и сульфоароматических соединений, в объектах окружающей среды, относится к разряду актуальных. В арсенале аналитических методик обнаружения ксенобиотиков предпочтение отдается простым, надежным и оперативным методам и приборам на их основе. Одним из важных условий является снижение стоимости анализа. Применяемые в настоящее время физико-химические методы (масс-спектрометрия, хроматография, спектральный анализ) достаточно сложны и дорогостоящи. Исследования последних лет показали, что в качестве нового эффективного подхода к определению широкого спектра органических соединений, в том числе - токсичных, в образцах окружающей среды может быть использован метод биосенсорной детекции. В этой связи интенсивно разрабатываются новые виды биосенсоров для решения задач экологического контроля. Важную роль в решении задач экологического мониторинга отводится микробным биосенсорам, которые перспективны как анализаторы в силу простоты и надежности конструкции, низкой стоимости биологического материала. Уникальной характеристикой микроорганизмов является их способность окислять широкий спектр органических соединений. Это дает возможность относительно простыми способами, используя принцип регистрации клеточного дыхания, формировать биосенсоры для детекции различных органических соединений. Вместе с тем, несмотря на актуальность задачи обнаружения фенолов и сульфоароматических соединений, до настоящего времени не были описаны биосенсоры микробного или другого типов для анализа сульфоароматики, и имеется незначительное число публикаций, посвященных разработке ферментных и микробных биосенсоров для детекции фенола и его производных. Существующее положение в данной области и общая актуальность задачи определили постановку цели и задач исследования.

Цель исследования. Целью работы являлось создание биосенсоров электрохимического типа для детекции сульфоароматических и фенольных соединений на основе бактерий родов Comamonas и Pseudomonas, являющихся деструкторами п-толуолсульфоната, как представителя сульфоароматических соединений, и фенола, соответственно.

Были поставлены следующие задачи:

1. На основании имеющихся литературных данных произвести выбор штаммов, обладающих характеристиками, требуемыми для формирования биорецепторного элемента сенсоров для детекции п-толуолсульфоната и фенола и определить вид преобразования сигнала.

2. Оценить характеристики процесса деградации п-толуолсульфоната свободными и иммобилизованными клетками Comamonas testosteroni BS1310 (pBS1010) в периодических и непрерывных условиях. Разработать лабораторные макеты биосенсоров на основе бактерий Comamonas testosteroni BS1310 (pBS1010) и бактерий рода Pseudomonas с использованием амперометрической детекции (кислородного электрода типа Кларка). Оценить возможность использования колоночного и мембранного сенсоров.

3. Выполнить сравнительную оценку характеристик биосенсоров для детекции п-толуолсульфоната на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов C. testosteroni BS1310 (pBS1010) и для детекции фенола на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов Pseudomonas.

4. Используя активный ил водоочистных сооружений в качестве биологического материала в реакторе с непрерывной подачей субстрата, оценить параметры процесса очистки промышленных стоков от фенола. На основании полученных данных представить предложения по оптимизации процесса очистки сточных вод нефтеперерабатывающего производства.

Научная новизна работы. Выбраны штаммы, обладающие характеристиками, требуемыми для формирования биорецепторного элемента сенсоров для детекции п-толуолсульфоната и фенола и экспериментально показано, что эффективным типом преобразователя является кислородный электрохимический электрод для регистрации содержания кислорода в среде. Оценены характеристики процесса деградации п-толуолсульфоната свободными и иммобилизованными клетками Comamonas testosteroni BS1310 (pBS1010) в периодических и непрерывных условиях. Разработаны лабораторные макеты биосенсоров на основе бактерий Comamonas testosteroni BS1310 (pBS1010) и бактерий рода Pseudomonas с использованием амперометрической детекции (кислородного электрода типа Кларка). Выполнена сравнительная оценка характеристик биосенсоров для детекции п-толуолсульфоната на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов C. testosteroni BS1310 (pBS1010) и для детекции фенола на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов Pseudomonas. Показано, что сенсоры, основанные на плазмидсодержащих бактериях, обладают высокой селективностью в отношении целевых соединений. Полученные сравнительные оценки субстратной специфичности плазмидного и бесплазмдного штаммов носят характер фундаментальных результатов и могут быть эффективно использованы для развития научных основ и практического применения биосенсоров.

Практическая значимость. Метод, основанный на биосенсорной детекции п-толуолсульфоната и фенола, может быть использован в научных исследованиях для определения концентрации указанных соединений в пробах, не содержащих других компонентов; так, метод может быть полезен при решении задач, связанных с оценкой каталитической активности in vivo ферментных систем микроорганизмов-деструктров п-толуолсульфоната и фенола в процессе их утилизации.

Разработанные модели биосенсоров могут составить основу аналитических приборов для проведения экологического мониторинга, основанных на одновременном измерении проб двумя сенсорами, включающими плазмидный и бесплазмидный штаммы, соответственно. Такие системы могут явиться высокоэффективными не только для определения абсолютных значений концентрации поллютантов в образцах, но, в первую очередь, для оценки эффективности процессов, связанных с относительным изменением содержания целевого соединения в образце, например, в процессе очистки сточных вод химических предприятий.

Результаты, полученные при изучении разложения п-толуолсульфоната в лабораторных условиях, могут быть использованы при проектировании промышленных реакторов для разложения ТС и фенола, содержащегося в сточных водах, а также для разработки биосенсора колоночного типа.

Качественная оценка процесса деградации фенола иммобилизованным активным илом позволила представить рекомендации по оптимизации очистки сточных вод нефтехимического предприятия, в результате которых была увеличена на 17% эффективность очистки. Предложен метод оценки окислительной активности микроорганизмов активного ила с помощью аналога колоночного сенсора.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

Аэробные микроорганизмы-деструкторы при разложении целевого вещества потребляют кислород. Этот процесс можно использовать при создании микробных сенсоров для детекции целевого соединения. Поэтому поиск штаммов, пригодных для использования в биорецепторах сенсоров целесообразно проводить среди штаммов-деструкторов соответствующих соединений.

Плазмидная детерминированность катаболизма целевого соединения позволяет создавать пару на основе двух вариантов одного штамма, один из которых содержит плазмиду биодеградации, а второй не содержит. В этом случае спектр деградируемых веществ у этих двух вариантов будет отличаться только целевым соединением. Сигнал на целевое соединение в этом случае можно будет отделить от сигналов на мешающие вещества.

Биосенсорный подход применим для решения практических задач с помощью аналога колоночного сенсора на основе бактерий активного ила. Этот сенсор позволяет произвести качественную оценку состояния активного ила аэрируемых биологических очистных сооружений. Кислородный электрод Кларка применим для оптимизации работы аэрируемых биохимических очистных сооружений промышленных предприятий.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, экспериментальной части и обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 148 страницах, содержит 15 таблиц и 22 рисунка. Библиографический указатель содержит 207 источников литературы.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были доложены на международных и российских конференциях: "Биокатализ-98" (Пущино, 1998), "Проблемы, способы и средства защиты окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (3-я Научно-техническая конференция, Москва, 1999), Всероссийская конференция с международным участием "Сенсор - 2000" (Санкт-Петербург, 2000), "Проблемы медицинской и экологической биотехнологии" (Оболенск, 2000), "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино, 2001). Всего по материалам диссертации опубликовано 13 работ - 8 публикаций материалов конференций, 3 статьи в журнале «Прикладная биохимия и микробиология», 1 статья в журнале «Известия ТулГУ», 1 статья в журнале «Экологические системы и приборы».

1. Исследование способности микроорганизмов к деградации толуолсульфоната (ТС)

В работе использован бактериальный штамм Comamonas testosteroni BS1310, содержащий плазмиду катаболизма бензолсульфоната и ТС (pBS1010), размером 130 тпн. Штамм выделен из активного ила аэрируемых биологических очистных сооружений ПО “Новомосковскбытхим”, г. Новомосковск Тульской области, и предоставлен для исследования лабораторией биологии плазмид ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН. Культуру выращивали на минеральной среде E с ТС в качестве единственного источника углерода и энергии. Полученные клетки отделяли центрифугированием, после чего промывали калий-фосфатным буфером. Осадок суспендировали в том же буфере и использовали в работе. Клетки иммобилизовали в 2%-ный агаровый гель при температуре 45^оС. Полученный блок геля с иммобилизованными клетками гранулировали, продавливая через сито с размером ячеек 500 мкм. Гранулы агара с иммобилизованными клетками промывали буфером декантацией 3 - 5 раз в цилиндре объемом 250 мл, отбирая 1-минутную фракцию.

1 Трансформация ТС свободными клетками

Процесс осуществляли свободными отмытыми клетками в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл буфера. ТС вносили в виде водного раствора в конечной концентрации 1.25 мМ. Концентрация (по массе сухих клеток) в реакционной среде составляла 0.4 мг/мл. Для контроля динамики процесса через определенные промежутки времени из реакционной среды отбирали пробы объемом 2 мл. Концентрацию ТС измеряли после удаления клеток центрифугированием в течение 15мин при 5000 g. Концентрацию ТС определяли двумя способами: спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность ОП₂₆₁, и обращенно-фазовой жидкостной хроматографией высокого давления, измеряя ОП₂₅₄. Значение скорости деградации рассчитывали по максимальному наклону касательной к квазилинейному участку рабочей кинетической кривой. Скорость деградации выражали в единицах удельной активности (нмоль * мин^{- 1}* мг^-1 клеток (сухой вес)).

2 Деградация ТС иммобилизованными клетками

Трансформацию ТС клетками, включенными в агаровый гель, осуществляли в условиях, аналогичных для свободных клеток.

3 Оценка стехиометрии процесса окисления ТС клетками

Потребление кислорода свободными и иммобилизованными клетками измеряли в закрытой ячейке с помощью электрода Кларка. В качестве среды использовали калий-фосфатный буфер, рН 7.6. Измерения выполняли при 22^оС в ячейке объемом 2 мл.

4 Деградация ТС в непрерывных условиях

Процесс осуществляли иммобилизованными клетками в стеклянной термостатированной колонке (реактор идеального вытеснения). Рабочий объем колонки составлял 5.7 мл, диаметр 1.7 см, высота колонки 2.5 см, концентрация клеток - 5 мг/мл геля. Скорость подачи раствора в колонку варьировали от 72 до 353 мл/ч, что соответствовало удельной скорости от 12 до 62 ч ^-1. Степень трансформации субстрата, выраженная в процентах от исходной концентрации, и производительность колонки (нмоль*мин^-1*мг^-1*клеток (по сухому весу)) оценивали, измеряя концентрацию ТС в элюате.

2. Разработка микробного сенсора для определения ТС

Иммобилизацию микроорганизмов C. testosteroni BS1310 производили их включением в 2%-ный агаровый гель в соответствии с методикой, примененной при исследовании процесса биодеградации п-толуолсульфоната. Из геля формировали мембрану толщиной 0.3 - 0.5 мм и площадью 20 мм² , которую фиксировали на измерительной поверхности электрода Кларка. Измерения проводили в кювете объемом 5 мл при температуре 20?С и постоянном перемешивании. Измеряемым параметром (ответом сенсора) являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала (dI/dt, нА/с) при введении исследуемого вещества.

3. Разработка микробного сенсора для детекции фенола

1. Объектом исследования являлись бактериальные штаммы, выделенные из почв месторождений нефти Западной Сибири и хранящиеся в коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН. Штаммы выделялись методом накопительных культур с использованием в качестве субстрата нефти и дизельного топлива. Накопительные культуры инкубировали в жидкой среде Эванса, содержащей нефть в качестве единственного источника углерода и энергии, в течение 3-5 дней. Разведения высевали на агаризованную среду Е с нефтью. Отдельные колонии, выросшие на нефти, пересевали. Выделено свыше 100 штаммов - деструкторов нефти и нефтепродуктов. Отдельные штаммы проверялись на способность к росту на индивидуальных субстратах - компонентах нефти: нафталине, 2- метил - нафталине, фенантрене, гексадекане, м-крезоле, феноле и ряде других. Двадцать восемь штаммов оказались способны к утилизации фенола.

Для культивирования утилизирующих фенол микроорганизмов использовали минеральную среду Е. Состав среды Эванса следующий (г/л или мл/л): K₂HPO₄ - 8.71 г, 5 M раствор NH₄CI - 1 мл, 0.1 M раствор Na₂SO₄ - 1 мл, 62 мM раствор MgCI₂ - 1 мл, 1 мM раствор CaCI₂ - 1мл, 0.005 мM раствор (NH₄)₆Mo₇O₂₄?4H₂O, микроэлементы - 1мл (состав микроэлементов в г/л): ZnO - 0.41 г, FeCI₃?6 H₂O - 5.4 г, MnCI₂?4H₂O - 2 г, CuCI₂?2H₂O - 0.17 г, CoCI₂?6H₂O - 0.48 г, H₃BO₃ - 0.06 г, (pH 7.0).

Для получения агаризованной среды того же состава в нее добавляли 1.5% агара. В качестве единственного источника углерода и энергии использовали пары фенола.

2. Штаммы-деструкторы фенола. В эксперименте были использованы 8 штаммов грамотрицательных бактерий, отобранные из 28 штаммов, способных к росту на моноциклических ароматических субстратах, в том числе на феноле, и характеризующиеся наибольшей скоростью роста, и 1 штамм-деструктор нафталина (P.putida BS394(p20)). Штаммы были предоставлены для исследований Лабораторией биологии плазмид ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН и исходно были выделены из почв нефтяных месторождений Западной Сибири.

Проводилась предварительная идентификация отобранных штаммов. Высев штаммов на среду KingB и дальнейший анализ под UV показал, что все 9 штаммов относятся к флуоресцирующим псевдомонадам. Далее видовую принадлежность штаммов флуоресцирующих псевдомонад определяли на основании ARDRA (amplified ribosomal DNA restriction analysis) продуктов амплификации гена 16S рРНК с использованием мелкощепящих эндонуклеаз рестрикции RsaI, MspII и HaeIII. Рестрикционные фрагменты 16S рДНК разделяли электрофоретически в 2%-м агарозном геле. В качестве контрольных штаммов использовали хорошо изученные и охарактеризованные штаммы P. putida mt-2 (Nelson et al., 2002), P. fluorescens 2-79 (Weller, 1983) и P. aeruginosa PAK NP1 (Delaney et al., 2001). Результаты ARDRA показали, что 7 из используемых штаммов принадлежат предположительно к P. putida mt-2 и только один из них, А-13 по- видимому, относится к P. fluorescens

Исследовалась способность выбранных штаммов к росту на различных субстратах. Ни один из штаммов не был способен к росту на полициклических ароматических углеводородах. Штаммы росли на бензоате. Штамм А-13 помимо способности к росту на феноле, мог использовать также гексадекан в качестве единственного источника углерода и энергии.

3. Иммобилизацию клеток проводили методом физической сорбции на хроматографической бумаге, для чего 10 мкл клеточной суспензии наносили на бумагу (5?5 мм²) и высушивали в течение 20 мин. Сформированный таким образом рецепторный элемент фиксировали на рабочей поверхности кислородного электрода Кларка. Измеряемым параметром являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала (dI/dt, нА/c). Измерения проводили в кювете открытого типа емкостью 5 мл при 20^оС и постоянном перемешивании раствора.

4. Деградация фенола в колоночном реакторе с иммобилизованным активным илом.

Иммобилизацию активного ила проводили физической сорбцией на активированном угле. Размер гранул активированного угля составлял 1-3 мм. Для иммобилизации применяли осадок ила, получаемый после 30 мин отстаивания иловой смеси в цилиндре объемом 1 л. Удельная скорость протока через колонку была постоянной и составляла 0.2 мин^-1. Объем стоков, пропускавшийся через колонку, был постоянным и составлял 300 мл (5 объемов колонки). Диаметр колонки составлял 30 мм, высота 90 мм. Конструкция колонки обеспечивала возможность применения аэрации среды. Концентрацию кислорода на выходе определяли титриметрически по методу Винклера.

Результаты и их обсуждение

1. Биодеградация ТС бактериями C. testosteroni BS1310(pBS1010).

Штамм C. testosteroni BS1310 (pBS1010) был использован как основа биореактора для деградации ТС в периодических и непрерывных условиях.

1.1. Деградация ТС свободными и иммобилизованными клетками в периодических условиях. На рис. 1 представлены кинетические кривые катаболизма ТС свободными и включенными в агаровый гель клетками C. testosteroni BS1310 (pBS1010) при начальной концентрации субстрата 1.25 мМ. Включение клеток в агаровый гель приводило к снижению их активности на 25% (оценка по начальной скорости деградации); так, скорость превращения ТС иммобилизованными и свободными клетками составляла 11.0 и 14.6 нмоль ^.мин^-1 мг^-1 клеток, соответственно. Снижение скорости процесса в случае применения иммобилизованных бактерий обусловлено, вероятно, диффузионными ограничениями для проникновения ТС и/или кислорода в гранулы геля. При изучении дыхательной активности свободных и иммобилизованных клеток было установлено, что деградация ТС сопряжена с потреблением 2 молей кислорода при окислении 1 моля ТС. Скорость потребления О₂ иммобилизованными клетками была также на 25% ниже, чем свободными, и составляла 22.0 нмоль*мин^-1*мг^-1. Как известно из литературных данных, для штамма C. testosteroni BS1310 (pBS1010) путь деградации ТС включает его десульфонирование с последующим окислением по мета-пути и окислением образовавшегося катехола до пировиноградной кислоты. Первые две реакции идут с потреблением кислорода. Аналогичные результаты были описаны в литературе при исследовании процессов деградации сульфоароматических соединений микроорганизмами. При сопоставлении имеющихся данных с полученными нами результатами можно сделать вывод о сходстве процессов деградации бензолсульфоната и его производных у бактерий-деструкторов.

1.2. Деградация ТС в непрерывных условиях. Были изучены параметры трансформации ТС включенными в агаровый гель клетками C. testosteroni BS1310 (pBS1010) на колонке (реактор идеального вытеснения, начальная концентрация ТС составляла 250 мкМ). Как показано на рис. 2, степень разложения субстрата (зависимость 1) составляла в среднем 35% при скоростях протока от 10 до 40 ч^-1, при повышении скорости протока происходило снижение степени разложения. Этот эффект обусловлен тем, что при высоких скоростях протока количество субстрата, которое не переработано клетками, увеличивается, чем и обусловлено происходящее снижение степени окисления. Производительность иммобилизованных клеток (зависимость 2) была максимальной при скорости протока 45 ч^-1 и составляла 10.4 нмоль*мин^-1*мг^-1, что соответствует производительности иммобилизованных клеток, полученной при трансформации ТС в периодических условиях при той же концентрации субстрата. Можно предполагать, что лимитирующей стадией процесса деградации в колонке является концентрация кислорода в среде, что и обусловливает невысокую степень превращения субстрата (35%). Лимитирование процесса деградации ТС по кислороду (на 1 моль ТС требуется 2 моля кислорода) вносит определенные коррективы в применении иммобилизованных клеток при создании биосенсора колоночного типа. Следует иметь в виду, что верхний теоретический предел обнаружения ТС, выполняемый с помощью биосенсора колоночного типа, не может превышать 125 мкМ, поскольку максимальная растворимость кислорода в воде составляет 250 мкМ при стандартных условиях. Для повышения степени превращения субстрата можно рекомендовать дополнительную аэрацию.

В оптимальных условиях (абсолютной скорости протока 170 мл*ч^-1 и относительной скорости протока 45 ч^-1) реактор функционировал без потери активности в течение 5 суток; через 8 суток активность снижалась в два раза.

Рис. 1. Деградация ТС свободными и иммобилизованными клетками C. testosteroni в периодических условиях



Рис. 2. Зависимости деградации ТС и продуктивности процесса от удельной скорости протока через колонку. Входная концентрация ТС составляла 250 мкМ.

2. Сенсор для детекции п-толуолсульфоната (ТС).

Штамм Comamonas testosteroni BS1310, использованный в биореакторе для разложения п-толуолсульфоната, был применен в качестве основы биосенсора мембранного типа для определения п-толуолсульфоната в водных средах.

2.1. Характеристика сенсоров на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штамма C. testosteroni BS1310.

На рис. 3 показана калибровочная зависимость биосенсора для детекции п-толуолсульфоната. Биосенсор характеризовался высокой чувствительностью, которая составила 0.17 нА/с. Нижний предел детекции (определяемый как концентрация субстрата, ответ на которую вдвое превосходит значение относительной ошибки) составил величину ~5 мкМ. Верхний предел детекции (определяемый как нижняя часть диапазона концентраций, в котором амплитуда ответов сенсора в зависимости от концентрации не превышает величину относительной ошибки более чем в два раза) равнялся 1 мМ; при более высоких концентрациях наблюдали насыщение зависимости. Сравнение верхнего предела детекции мембранного сенсора (1 мМ) и предельной концентрации ТС, разрушаемой в реакторе с вытеснением (125 мкМ), показывает, что указанные концентрации различаются почти в 10 раз. Поскольку реактор с вытеснением также может рассматриваться как элемент биосенсора колоночного типа, можно отметить, что для детекции п-толуолсульфоната более предпочтительно использовать сенсор мембранного типа в тех случаях, где ожидается его присутствие в более высоких концентрациях.

C целью подбора оптимального режима измерений сенсором исследовали влияние внешних факторов на амплитуду сигналов сенсора. Максимальный ответ наблюдали при 35?С; при более высоких значениях температуры величина сигнала снижалась, по-видимому, в связи с частичной инактивацией ферментных систем бактерий. Оптимальным значением является рН 7.6, что совпадает с рН-оптимумом роста использованного штамма.

Изучение зависимости ответов сенсора от ионной силы раствора (обеспечивали путем изменения концентрации NaCl в буферном растворе) показало, что максимальные сигналы соответствовали содержанию NaCl в растворе, равному 30 мМ. Отметим, что сенсор на основе C. testosteroni BS1320 (бесплазмидный штамм, субстрат сенсора - этанол) был менее чувствителен к концентрации солей, чем сенсор на основе исходного штамма (субстрат - п-толуолсульфонат).

Возможное объяснение полученных зависимостей заключается в том, что у бактерий, содержащих плазмиду деградации, происходит ингибирование систем активного транспорта сульфоароматических соединений или ингибирование ферментативной активности высокими концентрациями солей, присутствующих во внешнем растворе. Для проверки этого предположения была получена зависимость ответа сенсора на основе плазмидсодержащего штамма для этанола в концентрации 10 мМ. Вид полученной кривой был аналогичен полученной для ионной зависимости штамма C. testosteroni BS1320.



Рис. 3. Калибровочная зависимость сенсора на основе иммобилизованных клеток C. testosteroni BS1310 (pBS1010). Исследуемое вещество - ТС

Зависимость сигналов сенсоров от концентрации клеток в биорецепторном элементе приведена на рис. 4. Для изученного штамма оптимальным объемным соотношением клетки/агар в рецепторе являлось значение 1:10 (концентрация клеток в агаре по сухому весу составляла 30 мг/мл). Снижение величины ответа при более высоких концентрациях биомассы, по-видимому, объясняется недостатком О₂ в области рецепторного элемента вследствие интенсивного фонового дыхания клеток, что подтверждается снижением базового уровня сигнала электрода с иммобилизованными клетками.

Стабильность сенсора изучали путем периодических измерений контрольных концентраций исследуемого вещества через определенные промежутки времени (4 раза/сут). Ответы сенсора сохраняли постоянный уровень в течение двух недель при хранении геля с иммобилизованными клетками C. testosteroni BS1310 при комнатной температуре. В случае хранения при 4?С чувствительность рецепторных элементов не снижалась в течение 24 сут.



Рис. 4. Зависимость величины сигналов микробных сенсоров на основе иммобилизованных клеток C. testosteroni BS1310 (pBS1010) и элиминанта С. testosteroni BS1320 от концентрации клеток в агаре. 1 - штамм C. testosteroni BS1310 (pBS1010), субстрат - ТС (25 мкМ), 2 - штамм C. testosteroni BS1320, субстрат - этанол (10 мМ). Приведены средние значения величин и их стандартные отклонения. Число измерений для каждой концентрации составляло 5

Сенсор на основе бактерий C. testosteroni BS1310 (pBS1010) обладал высокой специфичностью к п-толуолсульфонату, бензолсульфонату и катехолу (рис. 5). Высокая чувствительность сенсора к катехолу объясняется, по-видимому, тем, что это соединение является интермедиатом катаболизма сульфоароматических соединений (рис. 6).

Следует отметить, что биосенсор на основе штамма C. testosteroni BS1320 был практически нечувствителен к сульфоароматике, что объясняется отсутствием плазмиды pBS1010. Сигналы сенсора в ответ на введение катехола и других ароматических соединений были также невелики (что можно объяснить потреблением кислорода химическим путем при диссоциации исследуемых соединений), в то время как чувствительность к углеводам, спиртам и органическим кислотам была близка к чувствительности биосенсора на основе C. testosteroni BS1310 (pBS1010). Это обстоятельство позволяет сделать предположение о потенциальной эффективности дифференциальной системы детекции сульфоароматических соединений, включающей сенсоры на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов. В этом случае сигнал, обусловленный присутствием целевого соединения в пробе, может быть получен путем вычитания сигналов измерительного и вспомогательного сенсоров.

Рис. 5. Субстратная специфичность сенсоров на основе плазмидного (темные столбики) и бесплазмидного (светлые столбики) штаммов C. testosteroni. Все субстраты тестировали в концентрации 10 мМ. Обозначения: 1 - ТС, 2 - фенол, 3 - салицилат, 4 - бензоат, 5 - бензолсульфонат, 6 - сульфобензоат, 7- катехол, 8 - алкилбензолсульфонат, 9 - арабиноза, 10 - арабит, 11 - глицерин, 12 - этанол, 13 - глюкоза, 14 - ксилоза, 15 - ксилит, 16 - метанол, 17 - сорбит, 18 - цитрат-ион, 19 - ацетат-ион, 20 - сорбоза, 21 - додецилсульфат Na



Рис. 6. Схема катаболизма ТС

В рамках данной работы была произведена сравнительная оценка субстратной чувствительности сенсора на основе бактерий C. testosteroni BS1310 (pBS1010), выращенных на бензолсульфонате и ТС. Чувствительность двух модифицированных моделей биосенсора к указанным веществам достоверно не различалась, что может служить косвенным подтверждением того, что деградация бензолсульфоната и ТС осуществляется одним ферментом.

Суммируя результаты, полученные при разработке модели микробного сенсора на основе бактерий C. testosteroni BS1310 (pBS1010), можно отметить следующее. Биосенсор обладает высокой чувствительностью к целевому соединению и позволяет производить его детекцию в модельных условиях с нижним пределом определения 5 мкМ. Это обстоятельство в сочетании с высокой селективностью анализа делает возможным рассматривать созданный биосенсор в качестве прототипа промышленного анализатора арилсульфонатов. Относительно оценки степени селективности в данном случае уместно привести сравнение параметров селективности для биосенсора на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов. Они составляют 11 к 1, (оценка получена как отношение сигналов сенсоров на основе плазмидного и бесплазмидного штаммов в ответ на целевое соединение). Таким образом, селективность сенсора на основе плазмидсодержащего штамма в 11 раз превышает селективность сенсора на основе бесплазмидного. Чувствительность сенсора к ацетату, этанолу и глюкозе не следует рассматривать в качестве существенной помехи для анализа, поскольку данные вещества не встречаются в промышленных сточных водах, а, кроме того, как указывалось ранее, для снижения мешающего влияния можно использовать специальные методы измерения, например, дифференциальную детекцию. Кроме того, имеются и другие варианты повышения селективности. Так, способ повышения селективности анализа может быть основан на свойстве клеток, состоящем в том, что одной из первых стадий деградации арилсульфонатов данной культурой является их десульфонирование с высвобождением сульфита. Таким образом, принципиально возможной схемой может быть формирование гибридного анализатора, включающего колоночный реактор с иммобилизованными клетками C. testosteroni BS1310 и биосенсор для детекции сульфита (аналоги описаны в литературе). Такой подход, хотя и связанный с некоторым усложнением конструкции анализатора, позволил бы ограничить спектр детектируемых субстратов только сульфоароматическими соединениями.

Важно отметить, что в литературе отсутствуют сведения о разработках микробных сенсоров для определения сульфоароматических соединений. Имеются данные по исследованию специфичности к широкому спектру субстратов сенсоров на основе штаммов Pseudomonas rathonis T, Pseudomonas sp. 2T/1, P. aeruginosa 1S, P. putida K, Achromobacter eurydice TK, тем не менее, чувствительность к сульфоароматическим соединениям не была обнаружена. Таким образом, показанная в данном исследовании высокая чувствительность и специфичность биосенсора на основе штамма C. testosteroni BS1310 (pBS1010) является важной как с теоретической, так и с практической точки зрения, и позволяет рассматривать созданную модель как основу аналитического прибора для детекции сульфоароматических соединений в реальных образцах.

4. Разработка микробного биосенсора для детекции фенола

1. Штаммы-деструкторы фенола.

Результаты оценки субстратной специфичности сенсоров на основе исследованных штаммов приведены на рис. 7. У штамма 32-I величины ответов на фенол и катехол превышали величины ответов на углеводы в 5-7 раз. Следует отметить, что катехол вызывал у всех исследованных штаммов, кроме штамма 32-I, более высокий, по сравнению с фенолом, уровень сигнала. Для всех штаммов была характерна широкая субстратная специфичность. Величина сигналов, наблюдавшихся при введении моносахаров (кроме глюкозы и ксилозы), была в 2-3 раза ниже сигналов, вызванных низкомолекулярными спиртами с неразветвленной цепью.

Изучение генетического контроля утилизации фенола показало, что, по крайней мере, у двух штаммов, 32-I и 83-IV, деградация этого соединения детерминирована генами, локализованными на плазмидах размером около 100 тпн. Штамм 32-I, проявивший высокую избирательность по отношению к фенолу, был исследован более детально.

Рис. 7. Субстратная специфичность исследованных штаммов. Все субстраты использовались в концентрации 10 мМ: 1-фенол, 2-этанол, 3-глицерин, 4-сорбит, 5-сорбоза, 6-ксилоза, 7-бутанол, 8-изопропанол, 9-глюкоза, 10-катехол, 11-нафталин, 12-арабит, 13-ксилит, 14-метанол, 15-пропанол, 16-изобутанол, 17-ацетат-ион, 18-п-толуолсульфонат, 19-бензолсульфонат, 20-арсенит-ион, 21-динитроортокрезол, 22-гранозан

Рабочие названия исследованных штаммов:

1-394(р20), 2-А-13, 3-45-1, 4-32-I, 5-50-III, 6-81-I, 7-89-I, 8-74-III, 9-74-I.

2. Характеристика сенсора на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного вариантов штамма 32-I.

Субстратная специфичность плазмидсодержащего и бесплазмидного вариантов штамма 32-I представлена на рис. 8. Сенсор на основе бесплазмидного варианта (32-I-1) был слабочувствителен к фенолу; чувствительность к остальным субстратам была сравнима с таковой для сенсора на основе плазмидсодержащего штамма 32-I.

Калибровочная зависимость штамма 32-I, построенная для фенола, представлена на рис. 9. Детекция фенола была возможна в диапазоне концентраций от 5 до 300 мкМ. Более высокие концентрации фенола вызывали ингибирование клеточного дыхания. Эффект ингибирования хорошо известен для микроорганизмов-деструкторов; в данном же случае применения бактериальных клеток в качестве основы биосенсора его количественная оценка необходима для того, чтобы избегать недостоверных результатов анализа. Область ингибирования продолжается до концентрации 10 мМ (когда отклик сенсора менее чем вдвое превосходит величину ошибки). При определении концентраций сенсором необходимо после проведения анализа произвести разбавление образца и провести повторное исследование для точного определения концентрации. Такой способ позволит детектировать образцы в концентрации от 5 до 10000 мкМ. Нижние пределы детекции для микробных сенсоров, описанных в литературе, сопоставимы с нижним пределом для сенсора на основе штамма 32-I. Полученные оптимальные значения для рН (7.4) и температуры (35^оС) для штамма 32-I позволяют произвести сравнение с аналогичными параметрами для ферментов, проявляющих фенолоксидазную активность Так, известно, что для ?-тирозиназы оптимальными является рН 9.0 и температура 30^оС, для фенол-2-монооксигеназы - рН 7.6 и температура 22^оС, для полифенолоксидазы - рН 7.0 и температура 25^оС, для лакказы - рН 7.0 и температура 37^оС. Значение температурного оптимума для биосенсора на основе клеток, по-видимому, отражает не столько оптимум функционирования фермента, сколько общие закономерности работы клеточных систем.

Рис. 8. Диаграмма субстратной специфичности сенсоров на основе плазмидного и бесплазмидного вариантов штамма 32-I. Субстраты вводились в концентрации 10 мМ. Обозначение субстратов: фенол -фн. катехол - кх, салицилат - сл, гентизат - гт, бензоат - бз, динитрофенол - ДНФ, динитроортокрезол - ДНОК, глюкоза - гл, сорбоза - сб, ксилоза - кс, галактоза - гал, манноза - ман, изопропанол - ип, этанол - эт, бутанол - бт, метанол - мт



Рис. 9. Калибровочная зависимость сенсора на основе иммобилизованных клеток плазмидсодержащего варианта штамма 32-I. Исследуемое вещество - фенол

Время непрерывных измерений сенсором, при котором сигналы снижались на 50% от исходной величины, составляло 30 часов. Стабильные ответы (неизменные по амплитуде) наблюдали на протяжении 8 часов. С целью проверки предположения о том, что причиной снижения сигналов сенсора является вымывание клеток из рецепторного элемента, исследовали стабильность сенсора при иммобилизации клеток в агаровый гель. Нашли, что при включении бактерий в гель принципиально характер стабильности не изменился. Следовательно, причиной малого времени жизни сенсора является снижение активности в результате гибели клеток, а не потеря активности ферментов, окисляющих фенол; данное заключение основано на том, что сигналы сенсора снижались пропорционально в отношении всех измеряемых соединений. Это позволило сделать вывод о снижении клеточной активности в целом, а не активности отдельных ферментных систем. Для решения проблемы стабильности представляется целесообразным исследовать другие методы и носители для иммобилизации.

Поскольку ко всем остальным веществам, кроме фенола и катехола, чувствительность сенсоров на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного варианта штамма 32-I была сопоставима, можно сделать предположение о возможности использования сенсоров на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штамма в системе дифференциальной детекции фенола в средах сложного состава.

5. Возможные пути решения практических задач с применением биосенсорного подхода

1. Практическая апробация колоночного реактора.

Применение созданных лабораторных макетов биосенсоров на основе штамма-деструктора ТС и штамма 32-I для анализа сточных вод нефтеперерабатывающего производства (г. Лисичанск, предприятие Лисичанскнефтеоргсинтез) показало, что основным эффектом при контакте сенсора со стоками является ингибирование клеточного дыхания. Наблюдаемый эффект объяснили присутствием токсичных компонентов стоков. На основе лабораторных анализов по основным компонентам стоков можно предположить, что ингибирование было обусловлено присутствием значительного количества токсичной органики (химическое потребление кислорода -ХПК - 300 мг/л и более) и сульфидов (более 20 мг/л). Это послужило основанием для выполнения серии тестов, основанных на полученном ранее опыте по изучению деградации ТС в колоночном реакторе, содержащем C. testosteroni BS1310 (pBS1010) и направленном на исследование возможности использования для определения токсичных соединений в сточных водах микроорганизмов активного ила, применяемых при их очистке. В данном случае в колоночном реакторе вместо бактериальных клеток применили активный ил водоочистных сооружений нефтеперерабатывающего производства, который, по сути, является более адаптированным биоматериалом для подобных анализов.

Для работы с реальными стоками иммобилизацию микроорганизмов активного ила производили на активированном угле. Объемное соотношение отстоявшегося активного ила и носителя составляло 1:5. Реактор использовался в двух вариантах - без аэрации и с принудительной аэрацией. Были рассмотрены три варианта заполнения колонки иммобилизованным илом - 30, 60, 90 мм (высота колонки составляла 90 мм). Контролем служил реактор, заполненный активированным углем без микроорганизмов. Постановка такого контроля представлялась необходимой, поскольку активированный уголь обладает высокой сорбционной способностью и часть веществ поглощается носителем. Измеряемым параметром являлась концентрация фенола в стоке до и после его пропускания через колонку. Полученные результаты по уменьшению концентрации фенола в пропускавшемся через колонку стоке представлены на рис. 10. На колонках без аэрации степень деструкции не изменялась в зависимости от высоты колонки и в целом была низкой. На колонках с аэрацией получена пропорциональная зависимость. На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что для мониторинга реальных сточных вод необходимо использовать микроорганизмы активного ила, адаптированные к жизнедеятельности в присутствии токсичных соединений. Лабораторные микроорганизмы, специфически разлагающие целевое вещество, не справляются с токсичными соединениями сточных вод, и их использование в таких условиях невозможно. Но при этом необходимо учитывать высокое потребление кислорода, для работы подбирать невысокие концентрации биомассы и производить соответствующее разбавление сточных вод. Другим путем может быть использование сенсора в мембранном варианте вместо колоночного.

Можно предположить, что в экспериментах с колонкой без аэрации (зависимость 1) имеет место лимитирование процесса окисления целевых веществ по кислороду, поскольку на колонках различной высоты получены практически одинаковые результаты по степени снижения концентрации фенола и степень деструкции в целом была низкой. В колонках с принудительной аэрацией (зависимость 2) получена пропорциональная от высоты колонки степень снижения концентрации фенола, что означает необходимость применения гипераэрации при работе в таких условиях.

Рис. 10. Уменьшение содержания фенола в стоках, пропущенных через колоночный реактор с активным илом. Число измерений по каждому опыту составляло 5. Погрешность измерений 6%

Тесты с применением колоночного реактора с активным илом позволили сделать следующие выводы:

- использованный реактор колоночного типа без аэрации представляет собой модель биосенсора, с помощью которого можно выполнять оценку индекса БПК стоков

- использованный реактор колоночного типа с аэрацией представляет собой модель аэротенка, из чего следует, что существенным параметром в работе аэротенка является содержание кислорода в среде, поскольку его недостаток может снижать эффективность очистки стоков. Из полученных данных следует, что для оценки общего состояния сооружений биохимической очистки необходимо в первую очередь провести анализ концентрации кислорода по всему профилю аэротенков.

Относительно биосенсорного мониторинга стоков можно предположить, что для оценки общего количества органических примесей в стоках целесообразно применение низкоселективных микробных сенсоров, например, на основе активного ила данного водоочистного предприятия, адаптированных к химическому составу тестируемых сточных вод, которые позволят производить оценку индекса БПК. Биосенсоры с высокой селективностью не являются инструментом, пригодным для проведения такого анализа; как правило, его выполнению в таких случаях должна предшествовать стадия определенной пробоподготовки или специфической калибровки биосенсора. В данном исследовании активный ил был использован как основа колоночного реактора - модели биосенсора. На основе исследования параметров реактора был предложен метод качественной оценки окислительной активности микроорганизмов биоценоза активного ила и их общего состояния. Этот способ предполагает измерение концентрации кислорода на входе и выходе колонки с иммобилизованным активным илом. По разнице концентраций можно оценить общее состояние активного ила и его окислительную способность.

Поскольку колоночный реактор с аэрацией является моделью аэротенка, на основе полученных результатов было сделано предположение о целесообразности проверки эффективности функционирования реальных аэротенков водоочистных сооружений.

2. Использование полученных данных для оценки эффективности процесса очистки стоков в аэротенках установки биохимической очистки.

В экспериментах на колонке с иммобилизованным активным илом без аэрации, как показали тесты, возникало ограничение убыли фенола, обусловленное лимитированием процесса по кислороду. На колонке с аэрацией ограничения не возникало и убыль фенола была пропорциональна высоте колонки, что позволяет прийти к заключению о том, что эффективность деградации в значительной степени определяется уровнем аэрации реактора.

В связи с наблюдаемым эффектом нам представлялось важным применить полученные данные к контролю условий, в которых происходит очистка стоков нефтехимического предприятия на установках биохимической очистки, являющихся, по сути, реакторами с принудительной аэрацией, прототипом которого (но без принудительной аэрации) является разработанный нами колоночный сенсор.

Цели данного раздела работы заключались в оценке состояния аэротенков очистных сооружений нефтеперерабатывающего производства и оптимизации их работы, при необходимости. Было решено проверить степень насыщения кислородом водной фазы по профилю аэротенка. Для данных измерений применили кислородный электрод Кларка, т.е. датчик, который в первой части исследования был использован как преобразователь биосенсоров для детекции ТС и фенола. Результаты, полученные по исходному состоянию всех аэротенков первого и второго блоков, показали, что распределение кислорода, как по аэротенкам, так и в пределах каждого аэротенка, неравномерное. Обнаружили, что зоны гипераэрации чередовались с анаэробными зонами. В результате проведенной работы удалось добиться равномерного распределения кислорода как в пределах каждого аэротенка, так и по сооружениям в целом.

Достигнутый результат можно выразить следующим образом. Снижение ХПК в среднем по сооружениям составляло 200 мг/л. До начала мероприятий по оптимизации работы сооружений снижение ХПК в среднем составляло 170 мг/л. Проведенные мероприятия позволили увеличить степень очистки по ХПК на аэротенках на 17%.

Выводы

1. Создана модель микробного биосенсора, обладающего высокой чувствительностью и селективностью в отношении сульфоароматических соединений. В основе биорецептора использован штамм C. testosteroni BS1310 (pBS1010) несущий плазмиду биодеградации сульфоароматических соединений pBS1010. Показано, что биосенсор мембранного типа позволяет производить экспресс-анализ п-толуолсульфоната в модельных средах в диапазоне детекции 5 - 1000 мкМ. Чувствительность сенсора по отношению к толуолсульфонату составляет 0.17 нА/с(мМ^-1). Использование плазмидсодержащих бактерий в сенсоре позволяет в 11 раз повысить селективность в отношении п-толуолсульфоната по сравнению с сенсором на основе бесплазмидного штамма.

2. Для упрощенной модели дифференциальной детекции произведена оценка возможной ошибки измерения целевых соединений - толуолсульфоната и фенола на фоне исследованных мешающих примесей. Погрешность детекции составит 24% при определении п-толуолсульфоната, 11% при определении общего содержания сульфоароматических соединений, 35% при определении фенола и 12% при определении общего содержания ароматических соединений в случае равной концентрации как мешающих, так и целевых соединений. При анализе реальных сточных вод, содержащих преимущественно целевые соединения, погрешность должна существенно снизиться.

3. Впервые экспериментально показали, что окисление п-толуолсульфоната бактериальными клетками Comamonas testosteroni BS1310 как в свободном, так и в иммобилизованном состоянии происходит в стехиометрическом соотношении 2:1 (кислород: п-толуолсульфонат). Полученные данные составили основу для выбора типа биорецептора - мембранного или колоночного - при создании биосенсора для детекции данного соединения.

4. Бактериальный штамм, принадлежащий к роду Pseudomonas (рабочая маркировка "32-I"), использовали как основу биосенсора для детекции фенола. Измерение концентрации фенола было возможно в диапазоне 5 - 300 мкМ. Нашли, что в отношении фенола селективность сенсора, основанного на плазмидсодержащих бактериях, в 17 раз превышает селективность сенсора на основе бесплазмидного штамма. Изучили параметры биосенсора и их зависимость от внешних условий.

5. На основании выполненных тестов с активным илом водоочистных сооружений нефтеперерабатывающего производства представили рекомендации по оптимизации работы очистных сооружений, заключающиеся в проведении контроля степени оксигенации стоков. Реализация критерия на практике позволила на 17% увеличить очистку стоков (оценка по индексу ХПК).

...