Генна інженерія в тваринництві
Методи трансгенеза у тваринництві. Метод мікроін'єкції, пересадки ядер клітин, культивованих in vitrо. Використання ретровірусних векторів Ліпосоми як переносники ДНК. Підвищення експресії трансгенів в організмі тварин. Перспективи генно-інженерних робіт.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | реферат |
| Язык | украинский |
| Дата добавления | 07.04.2013 |
| Размер файла | 36,7 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Зміст
- Вступ
- 1. Методи трансгенеза у тваринництві
- 1.1 Метод мікроін'єкції
- 1.2 Використання ретровірусних векторів
- 1.3 Метод пересадки ядер клітин, культивованих in vitro
- 1.4 Ліпосоми як переносники ДНК
- 2. Фактори підвищення експресія трансгенів в організмі тварин
- 3. Перспективи генно-інженерних робіт у тваринництві
Вступ
В даний час використовуються кілька підходів в отриманні трансгенних тварин. Найбільш широко поширений метод мікроін'єкцій чужорідної ДНК (чДНК) у пронуклеус зигот. Оптимальні умови для проведення мікроін'єкцій в пронуклеус зигот мишей описані в роботі Брінстера і співавторів (1994).
Розмір такого ДНК може досягати 30 Mb. Інтеграція декількох копій (від 1 до кількох сотень) екзогенної ДНК в геном відбувається, як правило, в одному сайті в орієнтації "голова до хвоста" або "голова до голови". При ін'єкції декількох рекомбінантних конструкцій, їх вбудовування в геном, також відбувається в одному сайті.
Інший підхід в отриманні трансгенних тварин полягає в інфікуванні ранніх ембріонів ссавців рекомбінантів-ниміретровірусамі. Недоліком цього методу є отримання трансгенних тварин з мультісайтовой інтеграцією трансгена і його нестабільною успадкованого в поколіннях.
Ще одним підходом в отриманні трансгенних тварин є використання трансформованих чужорідної ДНК, ембріональних стовбурових клітин, шляхом ін'єкції останніх у порожнину бластоцисти. Основною перевагою даного методу є можливість проводити спрямований мутагенез на рівні цілого організму, за допомогою гомологічною рекомбінації чужорідної ДНК з ДНК геному.
Для отримання трансгенних тварин використовувалися й інші методи, до яких відносяться: застосування сперматозоїдів, оброблених екзогенної ДНК, для запліднення яйцеклітин в умовах in vitro; використання ліпосом як вектор чужорідної ДНК. Однак, ці методи мають значно менш широке поширення, у порівнянні з методом мікроін'єкції чужорідної ДНК в пронуклеус зиготи.
генна інженерія тваринництво ліпосома
1. Методи трансгенеза у тваринництві
Трансгенні тварини - це індивідууми, в геном яких штучно введена додаткова генетична інформація (Трансген). Така інформація представляє собою або окрему ділянку ДНК з власними (гомологічними) регуляторними послідовностями (еукаріотична транскрипційних одиниця), або сконструйований з різних молекул ДНК гібридний (рекомбінантний) ген. Таким чином, трансгени - це штучно введений та інтегруватися в ДНК тварин чужорідний ген. Під трансгенезом розуміють процес перенесення та інтеграції чужорідної генетичної інформації в геном тварин.
1.1 Метод мікроін'єкції
Вперше про отримання трансгенних сільськогосподарських тварин повідомили дві лабораторії в США та Німеччині [Hammer et al, 1985; Brem et al., 1985]. В обох випадках для переносу генних конструкцій у ембріональні лінії був використаний метод мікроін'єкції. Цей метод і сьогодні залишається найбільш широко використовуваним для трансгенеза у тваринництві.
Суть методу мікроін'єкції полягає у введенні розчину генних конструкцій в чоловічій пронуклеус зигот. Зазвичай ін'єцирують 1-2 ПКЛ розчину ДНК в концентрації, що відповідає 1000 копій в 1 ПКЛ мікроін'єкціонного розчину. При цьому виходять з того, що кількість 1000 копій / ПКЛ приблизно відповідає концентрації X нг / мкл, де X - довжина генної конструкції в тисячах парах нуклеотидів (т.п. н). Наприклад, якщо довжина генної конструкції дорівнює 10 т.п. н., то кількість 1000 копій в 1 ПКЛ буде досягатися при концентрації рівної 10 нг / мкл.
Для більш точного розрахунку концентрації генних конструкцій використовують наступну формулу:
Кількість копій (копій ПЛК) = 6,023 * 10 23 * З * 10 - 9/Mr, де 6,023 * 10 23 - число копій в 1 М розчині;
С - концентрація ДНК [мкг / мл];
Mr - молекулярна маса [мг / моль].
Для розрахунку концентрації вимірюють оптичну щільність розчину генної конструкції на спектрофотометрі при довжині хвилі 260 нм. 1 OD відповідає концентрації двуточечною ДНК дорівнює 50 мкг / мл. При розрахунку молекулярної маси виходять з того, що молекулярна маса 1 пар основ дорівнює 6,6 * 108 мг / моль.
Про успішне виконання мікроін'єкції судять по збільшенню обсягу пронуклеусів в 1,5-2 рази [Брем та ін, 1995]. У ембріонах мишей кроликів, овець і кіз пронуклеус досить добре візуалізуються під мікроскопом при збільшенні Х400 без виконання будь-яких додаткових маніпуляцій. Що стосується ембріонів свиней і великої рогатої худоби, то внаслідок наявності в цитоплазмі темних ліпідосодержащіх гранул визначення місця розташування пронуклеусов в них утруднено. Для усунення цих гранул до країв ембріона і полегшення тим самим локалізації пронуклеусов виконують центрифугування ембріонів свиней та ВРХ при 15000 об / хв протягом 3 хв. [Wall et ai, 1985]. По завершенні мікроін'єкції ембріони культивують кілька годин до моменту їх пересадки в яйцепровід синхронізованих реципієнтів. Ембріони ВРХ культивують in vitro протягом 6-7 днів до досягнення ними стадій морули або бластоцисти і потім виконують пересадку в матку синхронізованих реципієнтів. Після народження від всіх тварин відбирають проби тканини для аналізу на інтеграцію трансгена. Ступінь інтеграції, тобто число трансгенних тварин від загального числа народжених тварин, при використанні методу мікроін'єкції в залежності від виду тварин коливається в незначних межах. Так, у мишей цей показник у середньому становить 15%, у свиней - 10-15%, у кроликів - 10%, у овець, кіз і ВРХ - 5-10% [Брем ??та ін, 1995]. Найбільш важливим, з точки зору витрат, потрібних для отримання одного трансгенної тварини, є показник загальної ефективності трансгенеза, який розраховується як відношення числа отриманих трансгенних тварин до загальної кількості пересаджених ембріонів, виражене у відсотках. Величина цього показника також щодо постійна і становить у мишей - 2%, у кроликів 1%, у овець і кіз - 0,5 - 1%, у свиней та ВРХ - 0,5%. На частоту інтеграції впливає ступінь очищення ін'єкційного розчину, форма і концентрація ДНК, склад буферного розчину, якість ембріонів, спосіб пересадки ембріонів реципієнтам (не хірургічний, хірургічний, лапароскопічний). При використанні розчину MSOF (синтетична середу ембріонів) для мікроін'єкції зигот великої рогатої худоби (Hageman [1995]) було показано, що ін'єкція розчину MSOF не чинила впливу на життєздатність ембріонів великої рогатої худоби, отриманих in vitro. Так, частки ембріонів, що розвинулися до стадії бластоцисти, в групах MSOF та контрольної становили, відповідно, 27,6% і 27,5%. У групі ТІ до стадії бластоцисти розвинулися лише 13,9% ін'єктовані зигот. Зіставляючи результати двох наведених вище досліджень, можна припустити, що буфер MSOF виявиться більш ефективним у порівнянні зі стандартним розчином ТІ для отримання трансгенного великої рогатої cкота та інших видів сільськогосподарських тварин.
Не дивлячись на досягнуті в області трансгенеза успіхи, ефективність одержання трансгенних сільськогосподарських тварин залишається дуже низькою [Wall et al., 1992; Wall et al. 1997] що спонукає дослідників шукати нові підходи. Одним із шляхів підвищення ефективності трансгенеза є розробка методів оцінки ембріонів на трансгенність перед їх пересадкою реципієнтам. До них відноситься використання в конструкціях репортерний генів, таких як в-галактозидаза, лужна фосфотаза та інші, а також визначення трансгенів в ембріонах методом ПЛР і флюоресцентної гібридизації.
Не дивлячись на використання великого числа маркерів, не було розроблено системи, що дозволяє підвищити ефективність трансгенеза у сільськогосподарських тварин. Основні підходи, що використовуються в даний час:
1.2 Використання ретровірусних векторів
Результативним способом перенесення ДНК в ембріональні лінії тварин є застосування ретровірусних векторів.
Ретровіруси - сімейство еукаріотичних вірусів, генетичний матеріал яких представлений одноланцюжковою РНК.
Віруси складаються покритих липопротеїдною оболонкою вірусних частинок діаметром 70-120 нм і внутрішньої капсули ікосаедричної форми, яка містить дві копії геномної РНК довжиною 5-10 тисяч пар нуклеотидів у формі рибонуклеопротеїни. Зовнішня оболонка вірусу є частиною цитоплазматичної мембрани клітини господаря і представлена короткими гликопротеїдами. Ендогенні ретровіруси є хромосомними елементами і складають до 1% ДНК в геномі людини [Tarusio Mantovani, 1998]. Ендогенні ретровіруси є одним з різновидів ретроелементов, що складають до 10% геному ссавців.
За своїй здатності інфікувати клітини господаря ретровіруси поділяються на екотропні і амфотропні. Екотропние віруси здатні реплиціюроваться в клітинах тільки одного або декількох близько споріднених видів тварин. Так, наприклад, вірус лейкемії миші (MLV) розмножується тільки в клітинах миші та щури. Амфотропние віруси, навпаки, мають широкий спектр господарів і здатні до розмноження в клітинах різних видів ссавців.
Геном всіх здатних до реплікації ретровірусів влаштований аналогічним чином і складається з трьох кодують регіонів, які, не дивлячись на те, що мова йде про послідовності РНК, отримали назву генів. Ген gag кодує білки капсиду і вірусного кора. Ген кодує pol вірусну реверсивну транскриптазу й інші пов'язані з вірусом нуклеази. Ген кодує env глікопротеїди у вірусній ліпідної оболонці.
Геноми РНК ретровірусів містять на своїх кінцях повторюваних послідовностей, які залежно від типу вірусу мають довжину від 10 до 80 нуклеотидів. Вони отримали назву R-сегментів. На 3-кінці геномної РНК R-сегмента розташований регіон U3 довжиною 170-1250 нуклеотидів, а на 5 'кінці r-сегмента регіон u5 довжиною 80-100 нуклеотидів. При формуванні ДНК-копії вірусного РНК-геному на кінцях молекули відбуваються зміни: на 5 'кінці розташовується сегмент U3, а на 5' - U5. Такіе характерні для ДНК-форми ретровірусоа ділянки отримали назву LTR - довгих кінцевих повторів. LTR, розташований на 5 'кінці несе дуже сильний промотер, тоді як LTR на 3' кінці містить сигнали Поліаденілювання РНК.
Інфекція починається з взаємодії ретровірусу з клітинною мембраною і зв'язування поверхневого білка ретровірусу (env) зі специфічним білком-рецептором. Проникнення ретровірусу в клітину відбувається за допомогою мікропіноцітоза. В одних вірусів кор, що складається з білка gag, РНК-залежної ДНК-полімерази (реверсивної транскриптази), інтегрази і двох копій ретровірусної РНК, переноситься в ядро, де і відбувається транскрипція, а в інших вірусів транскрипція здійснюється безпосередньо в цитоплазмі. Зворотня транскрипція вірусної РНК в двухцепочечну ДНК здійснюється за допомогою ферменту реверсивної транскриптази, що є частиною комплексу ферментів кора. У ході транскрипції відбувається дуплікація послідовностей на 5 'і 3' кінцях ретровірусу. Якщо транскрипція має місце в цитоплазмі клітини, то дволанцюжкова ДНК вірусу транспортується в ядро, де відбувається її циркуляція з подальшою інтеграцією однієї або декількох копій в геном клітини. Така інтегрована ДНК клітини хазяїна форма існування вірусного геному отримала назву провірусу. Кроки життєвого циклу ретровірусів.
Для інтеграції необхідна наявність на обох кінцях ДНК 9 пар підстав, які пізнаються і відщеплюються закодованої у вірусі специфічної інтегрази, що є частиною комплексу ферментів кора. Процесу інтеграції завжди передує відщеплення двох пар основ на обох кінцях провірусу і подвоєння 3-6 пар основ (залежно від типу вірусу) послідовності ДНК клітини хазяїна. Хоча інтеграція в геном клітини господаря не є специфічною, слід відзначити, що місця інтеграції часто розташовуються в транскрипційно активних ділянках ДНК. Якщо відбувається інтеграція в геном генеративних клітин, то ретровіруси передаються у спадок нащадкам. У цьому випадку мова ведуть про ендогенних ретровірусів.
Інтегрована вірусна ДНК транскрибується з допомогою РНК-полімерази клітини-хазяїна та трансляцірується як і інші клітинні гени.
Утворені в ході процесу транскрипції продукти є ідентичними вірусної РНК. Всі транскрипти містять на 5 кінці кеп-сайт, а на 3 кінці ділянку Поліаденілювання. Такі РНК служать матеріалом для синтезу білків капсиду і вірусного кора, а також білків зворотної транскриптази. Ці білки утворюють з геномної РНК вірусу комлекс-кори, після чого вірусні частинки залишають клітину через цитоплазматичну мембрану. При цьому кор бере з собою частину мембрани клітини господаря, з якої утворює оболонку. Інтеграція вірусних частинок в геном клітини господаря відбувається тільки в мітотично активні клітини.
Інфікування клітин ретровірусами найчастіше за все не позначається на їхній життєдіяльності. Однак якщо інтеграція провірусу сталася поблизу клітинних протоонкогенів, то можлива їх активація і, як наслідок, загибель клітин. Порушення життєздатності клітин. Може мати місце і в тому випадку інтегріраціі провірусу в діючий клітинний ген (наприклад, пухлинні гени-супресори).
Найбільш часто використовуваними ретровірусними векторами являються вектори на основі ретровірусів миші типу С (вірус лейкемії миші) Такі векторні системи складаються з двох компонентів: векторної конструкції та лінії клітин-пакувальниці.
У векторної конструкції (провірусної ДНК) гени, кодіруюрущіе структурні білки ретровірусу (gag, pol, env), замішані іншими важливими генами (генами в-галактозидази і стійкості до неоміцину). Джерелом структурних білків є клітинна лінія, яка містить інтегрований у геном провірус.
Даний провірус модифікують таким чином, що у нього відсутній сигнал впізнавання ш, необхідний для упаковки вірусної РНК. Таким чином, транскрипційного вірусна РНК не може бути упакована у вірусні частинки.
РНК векторної конструкції, навпаки, містить сигнал впізнавання ш і тому може бути упакована в рибонуклеопротеїдними комплекс. Таким чином, відбувається формування інфекційних вірусних частинок, що містять інформацію ретровирусного вектора і переносять її в інфіковані клітини. Однак такі вірусні частки не здатні до утворення нових вірусів, тому що в інфіцируємої клітинної лінії відсутня генетична інформація про структурні білках, необхідних для формування вірусних частинок.
Необхідними складовими частинами векторної конструкції є 5 'і 3' LTR, а так само сигнал упаковки, розташований "вниз за течією" від 5 'UTR. Експресія трансгена направляється промоторів 5 'UTR або альтернативними вірусними або клітинними промотерамі (наприклад, вірус саркоми Рауса, тирозин, б-казеїн). Вперше присутність вірусної ДНК в клітинах дорослих мишей встановлено в 1974 році. Ретровірусних вектори можуть служити альтернативою для ефективного транспорту генів у сільськогосподарських тварин. Інфекція зигот або імплантаційних ембріонів у більшості випадків призводить до отримання трансгенних тварин-мозаїки. Поясненням цьому служити те, що інтеграція відбувається тільки в тому випадку, якщо клітина вступає в мітоз після попередньої реплікації ДНК. Усі нащадки, які народилися з інфікованих ооцитів, були трансгенними (табл.1). Не дивлячись на обмежене число отриманих трансгенних тварин, були доведені передача трансгена у спадок і експресія рекомбінантного продукту.
Ефективність отримання трансгенного ВРХ з використанням ретровірусної інфекції ооцитів у метафазі II другий мейотичного поділу.
|
Показники |
Число (n) |
% |
|
|
Інфіковані ооцити |
836 |
||
|
Ембріони, що розвинулися до бластоцисти |
174 |
21 |
|
|
Пересаджені ебріони |
10 |
||
|
Живі нащадки (% від пересаджених ембріонів) |
4 |
40 |
|
|
Трансгенні тварини (% від народжених нащадків) |
4 |
100 |
Перевагою використання ретровірусних векторів для отримання трансгенних тварин є те, що до 100% оброблених ембріонів можуть бути успішно інфіковані ретровірусами.
Недоліком застосування ретровірусних векторів є їх обмежена ємність (розмір вставки не повинен перевищувати 8 000 п. н. Крім того, в результаті сплайсингу з ретровірусів вирізаються інтронні послідовності, які як і інші дистальні або проксимальні послідовності грають важливу роль в ефективній експресії генів у трансгенних тварин [Palmiter et ai, 1991]. До недоліків лікування ретровірусними векторів слід так само віднести придушення експресії трансгенів in vivo внаслідок інактивації вірусних промоторів в клітинах, наприклад, за допомогою а-і у-інтерферонів, що діють на вірусні LTR [Ghazizadeh et ai, 1997]. Однак дана проблема може бути вирішена за допомогою включення в ретровірусну конструкцію внутрішніх промоторів або використанням нового покоління ретровірусів, що містять модифіковані ділянки контролю експресії, такі як внутрішній рибосомних сайт (IRES) [Salen, 1997] і тетрациклінова регуляторна система [lida et ai, 1996].
Ще одним обмеженням використання ретровірусних векторів для отримання трансгенних тварин є їх низький титр. Звичайні ретровірусних вектори мають титр 1 х 105-6 колонієутворюючих одиниць (cfu) у мл [Kim et ai, 1993; Archer et ai, 1994]. Низький титр ретровірусів обмежує способи їх введення в ембріони. Проблема низького титру була нещодавно вирішена за допомогою розробки нового вектора на основі вірусу везикулярного стоматиту (псевдотіп VSV-G) [Burns et ai, Yee et ai, 1994]. Відомо, що тропізм ретровірусу визначається геном env, тому його заміна у векторі на ген env іншого ретровірусу може розширити спектр господарів і змінити властивості ретровірусу. Дана технологія отримала назву псевдотіпірованія. Включення білка вірусу везикулярного стоматиту С у вектор на основі Мо - MLV (Burns et al, 1994) дозволило зробити його більш стабільним при ультрацентрифугування. Цей вектор може бути сконцентрований до титру 1x109-10 КУО / мл і має дуже широкий спектор клітин-господарів. З його використанням були отримані трансгенні лінії клітин комах, ссавців, амфібій, риб, а також створені трансгенні тварини. Високий титр ретровірусу зробив можливим отримання трансгенних тварин за допомогою ін'єкції містить віруси середовища в перівітеліновий простір [Chan et al, 1998) / У ооцитах великої рогатої худоби обсяг перівітелінового простору становить 200-300 ПКЛ. При використанні вірусу з титром 1 * 10 9-10 КУО / мл, ін'єкція 10 ПКЛ призводить до проникнення в перівітеліальний простір від 10 до 100 інфекційних вірусних частинок. Якщо титр вірусу дорівнює 1 * 105-6 КУО / мл, то для введення в ембріон однієї вірусної частинки знадобилося не менше 1 нл розчину.
До недоліків використання ретровірусів належить можливість клітинних онкогенів за допомогою вірусних транскрипційних послідовностей. Навіть при застосуванні ретровірусів, які не можуть існувати як інфекційні вірусні частинки, існує хоча й дуже невеликої, але ризик, що при рекомбінації з присутніми в ембріонах ендогенними ретровірусними послідовностями можуть утворюватися нові активні форми ретровірусів.
Не дивлячись на перераховані недоліки та обмеження, ретровіруси можуть бути широко використані для трансгенеза у тваринництві. Успішне введення генетичного матеріалу в ооцити робить можливим проведення генної терапії спадкових захворювань. Використання ретровірусних векторів дозволяє здійснювати трансформацію окремих органів. Так, Archer з співавторами [1994] ввели в молочну залозу кози шляхом інфузії через сосковий канал в період гормонально індукованого маммогенеза ретровірус, який кодує гормон росту людини (hGH). Лактація настала на 14-ий день гормональної обробки. Максимальний рівень hGH (60 нг / мл) спостерігався в перший день лактації і потім опускався до 12 нг / мл на 9-12 дні лактації.
Аналогічні експерименти з використанням експресійна вектора pLNS, отриманого на основі Mo-MLV проводяться у відділі біотехнології Всеросійського НДІ тваринництва.
LTR - довгий кінцевий повтор, ш + - сигнал упаковки, Н4 - промотер гистона людини, NEO - ген стійкості до неоміцину, ЕР - делеція в області промотера-енхансера, РА - сигнал Поліаденілювання Цей вектор містить тільки цис-діючі послідовності генома вірусу, необхідні для реплікації. Послідовності вірусу, що кодують білки, виключені з векторної конструкції. Вектор містить 5 'довгий кінцевий повтор LTR, з якого відбувається транскрипція, ш + область, відповідальну за упаковку вірусного генома в віріон, ген стійкості до неоміцину, під контролем промотера Н4 гістона людини для селективного введення конструкції в клітинну лінію і 3' LTR з делецій в області промотера-енхансера вірусу. Після одного циклу реплікації делеція в області ЕР LTR буде присутнім на обох кінцях провірусу, регуляторні елементи провірусу будуть повністю інактивованих і клоновані гени будуть експресуватися тільки під контролем власних промотеров.
Доведено можливість успішної інфекції альвеолярних клітин молочної залози свиней і корів рекомбінантними ретровірусами.
Інфекція молочної залози не носить локального характеру. Послідовності провірусу крім досвідчених долей вимені були виявлені в контрольних частках молочної залози, в слинної залозі, селезінці, підшлунковій залозі, спинному мозку, надниркових. ІФА молока свиней виявив наявність рекобінантного продукту в кількості від 30 до 290 нг / мл.
Основними недоліками методу безпосередньої інфекції окремих органів тварин є необхідність використання великої дози ретровірусів з тим, щоб інфікувати достатнє число клітин, а так само неможливість передачі трансгена в спадщину наступному поколінню тварин. Однак на відміну від введення грансгенів в ембріональні лінії, даний підхід дозволить синтезувати рекомбінантні продукти в молоко вже через кілька місяців після початку експерименту. Для ВРХ у порівнянні з традиційним методом мікроін'єкції витрати часу від початку експерименту і до отримання перших результатів про рівень експресії в молоці скорочуються, відповідно, з 4-5 років до 4 5 місяців.
1.3 Метод пересадки ядер клітин, культивованих in vitro
Ще одним способом отримання трансгенних ссавців є використання трансформованих генними конструкціями клітинних ліній. З цією метою можуть бути використані як стовбурові клітинні лінії, так і соматичні клітини, культивовані in vitro. Вперше експресія генних конструкцій в соматичних тканинах химерних мишей, отриманих з використанням трансформованих клітин ембріональної карциноми, була доведена Stewart з співавторами [1985]. Частка химерних мишей була дуже високою, причому частина з них передавала Трансген у спадок. Проте в даний час найбільше поширення для отримання химерних тварин отримали ембріональні стовбурові клітини, ЕСК [Robertson et al., 1986]. Перевагою отримання трансгенних тварин за допомогою трансформованих стовбурових клітин є можливість тестування інтеграції трансгена в культурі клітин. Це означає, що кожен ембріон, який розвинувся в культурі після пересадки ядер, буде трансгенним і подальша селекція трансгенних ембріонів не потрібно. Крім того, пересадка таких ембріонів реципієнтам призведе до народження тільки трансгенного потомства. Використання для одержання трансгенних тварин трансформованих ЕСК робить можливим у ряді випадків проводити оцінку експресії трансгенів, що має важливе значення. При мікроін'єкції трансгени навмання інтегруються в будь-яку частину геному. Це означає, що вони можуть руйнувати досить істотні гени (но інсерційні мутації) або розміщатися в тих частинах хромосоми, які недоступні для транскрипції. Тестування експресії в культурі зробить можливим використання для пересадки ядер, а отже і для отримання трансгенних тварин тільки тих клітинних ліній, в яких трансгени є транскрипційно і трансляційної активними. Крім того, на відміну від методу пронуклеарної ін'єкції дослідження ЕСК дозволяє цілеспрямовано впливати на геном за допомогою генного ХХХХХХХХХХ Сенсаційне повідомлення було опубліковано в 1996 році в Nature. Була продемонстрована можливість отримання життєздатних овець за допомогою пересадки ядер соматичних клітин, культивованих in vitro. Пізніше повідомили про отримання трансгенних овець за допомогою пересадки ядер стабільно трансформованих первинних фетальних фібробластів (Schnieke et al., 1997). З шести отриманих трансгенних ягнят п'ять виявилося життєздатними. Ступінь трансгенність при використанні даної, методу становила 100%, в той час як застосування методу мікроін'єкції в тій же лабораторії дозволяло отримати лише 4,35% трансгенних нащадків від кількості народжених тварин. Для отримання одного трансгенного ягняти методом пересадки ядер потрібно 20,8 овець, у той час як при використанні методу пронуклеарної ін'єкції - 51,4 вівці [Schnieke et at., 1997]. Як і при використанні ЕСК, даний метод дозволяє проводити аналіз інтеграції в культурі клітин, а також здійснювати цілеспрямоване вбудовування генних конструкцій у бажані ділянки геному. Крім того, використовувані клітинні лінії можуть бути каріотіпізовані в культурі, що дозволить заздалегідь визначати стать трансгенних тварин. Після отримання трансгенних тварин з різних клітинних ліній та визначення рівня експресії може бути проведений відбір бажаних клонів для їх подальшого використання в пересадках ядер.
Схема отримання трансгенних тварин з використанням стабільно трансформованих клітин.
1.4 Ліпосоми як переносники ДНК
Векторами для перенесення генних конструкцій у ембріональні лінії ссавців можуть служити ліпосоми [Rottmann et al, 1985], однак опосередкований ними перенесення генів не отримали широкого розповсюдження 1.5 Використання статевих клітин сім'яників (спермії і сперматогонії) Сперматозоїди є природним вектором, що приносять ДНК у клітину. Використання сперміїв в якості переносників однієї ДНК розглядається як один з перспективних методів генетичної модифікації тварин. У дослідах Lavitrano (1989) 30% мишей отриманих після запліднення обробленої ДНК спермою, виявилися трансгенними і передавали Трансген у спадок.
Численні спроби в інших лабораторіях неуспішними. Аналіз 1300 мишей, народжених in vitro обробленої ДНК спермою, не виявив Трансген ні в жодній з досліджуваних особин [Brinster, 1989), Недавнє дослідження показали, що при застосуванні методу переносу ДНК за допомогою сперматозоїдів в одній і тій же лабораторії дае пра використанні однакової схеми досліджень можуть бути отримані суперечливі результати [Maiore et al, 1998]. Це дозволяє припустити, що вбудовування ДНК відбувається тільки на певній стадії клітинного циклу. Однак до теперішнього часу не встановлено механізм інтеграції екзогенної ДНК в геном сперматозоїдів.
Huguet і Esponda [1998] досліджували здатність сперматозоїдів поглинати лінійну ДНК in vitro і in vivo. У дослідах in vitro відмиті прідатковие сперматозоїди інкубували 2 години з лінійної ДНК. ДНК ін'єктувати в проксимальну область сім'яних канальців, після чого через 6 годин витягували сперматозоїди. Присутність чужорідної ДНК було показано у 60-70% сперматозоїдів. Сперматозоїди здатні поглинати ДНК, акумулювати її в ядрі. Секрети придатків і сім'яних канальців не блокують цей процес.
Для підвищення ефективності зв'язування ДНК із сперматозоїдами використовують різні методи: ДНК-ліпосомних комплекси [Bachiller et al. 1991], ін'єкцію в насінники [Sato et al. 1994], безпосередню ін'єкцію в сім'яні канальці [Kim et al. 1997] і придатки [Huguet і Esponda, 1998], ін'єкцію в сім'яні канальці з подальшою електропорація [Yamazaki et al. 1998], ко-ін'єкцію головок сперміїв і ДНК в ооцити [Perry et al. 1999]. Також було показано, що екзогенна ДНК може бути ефективно доставлена в ооцити мікроін'єкцированими сперматозоїдами.
Велика увага останнім часом привертають маніпуляції із стовбуровими клітинами сім'яників-сперматогонії [Brinster, Nagano. 1998]. Була продемонстрована можливість перенесення сперматогонії від одного самця іншого як у тварин одного виду (Avarbock, 1994; Brinster і Zimmermann. 1994), так і між двома видами.
Після пересадки статевих клітин з сім'яників самця миші в насінники іншого самця, до 80% потомства відбувалося з сперматозоїдів самця-донора. Була доведена можливість успішного перебігу сперматогенезу після пересадки кріоконсервованих клітин семенника і після їх тривалого консервування, пересадки в насінники мишей клітин з сім'яників пізніх стадій сперматогенезу статевих клітин донорів виявлено не було / Dobnnski et al., 1999].
Успішне тривалий культивування статевих клітин тварин in uru робить можливим проведення трансформації сперматогонії екзогенної ДНК з подальшою селекцією. Nagano з співавторами / 2000] повідомили про успішне запровадження екзогенної ДНК в сперматогонії т vitro та in vivo за допомогою ретровірусної системи доставки. Експресія ретровірусної генної конструкції, що включає lacZ, спостерігалася в сім'яниках більше 6 місяців. Аналіз показав, що принаймні 1 з 300 стовбурових клітин сім'яників містять трансгени.
У поєднанні з пересадкою трансформованих статевих клітин у насінники реципієнтів і успішним протіканням сперматогенезу підхід може бути використаний для отримання трансгенного потомства.
Не дивлячись на хороші результати у використанні сперматозоїдів для отримання трансгенних мишей, а також окремі успішні спроби отримання трансгенних свиней та ВРХ [Gandolfl et al, 1989, Schelander et al, 1995, Sperandio et al, 1996], яких-небудь значних успіхів у отриманні трансгенних сільськогосподарських тварин за допомогою трансформованих сперматогонії і сперміїв до теперішнього часу досягнуто не було. Досягнення у використанні трансгенних технологій.
|
Рік |
Подія |
Автор |
|
|
1971 |
Доставка чужорідної ДНК в ооцити кролика сперматозоїдами |
Bracket |
|
|
1974 |
Отримання трансгенних мишей за допомогою вірусних векторів |
Jaenish, Mintz |
|
|
1976 |
Передача трансгена у спадок |
Jaenish |
|
|
1980 |
Отримання трансгенних мишей мікроін'єкцій |
Gordon |
|
|
1981 |
Отримання стовбурових клітин |
Ewans, Kaufman, Martin |
|
|
1984 |
Ембріональні химери з клітин тератокарциномах |
Bradley |
|
|
1985 |
Отримання трансгенних сільськогосподарських тварин |
Brem, Hammer |
|
|
1986 |
Ембріональні химери з використанням ЕСК Отримання овець за допомогою пересадки ядер |
Gossler, Willadsen |
|
|
1987 |
Гомологичная рекомбінація в ЕСК Отримання ВРХ методом пересадки ядер |
Thomas, Capeccha Brather |
|
|
1988 |
Отримання кроликів методом пересадки ядер |
Slice і Robl |
|
|
1989 |
Генний таргетинг у мишей Отримання трансгенних мишей і свиней з допомогою сперміїв в якості векторів Отримання трансгенного ВРХ методом мікроін'єкції Отримання свиней методом пересадки ядер |
Thompson el al., Lavitrano el at., Gandolfi et al. Roschlau el al., Prather et al., |
|
|
1995 |
Отримання трансгенного ВРХ за допомогою сперміїв |
Schelander et al |
|
|
1996 |
Отримання овець методом пересадки ядер культивованих ембріональних клітин Отримання ЕСК приматів |
Campbell Thomson |
|
|
1997 |
Отримання овець методом пересадки ядер фетальних клітин і соматичних клітин дорослої тварини Отримання трансгенних овець методом пересадки ядер трансформованих культивованих клітин Отримання химерних трансгенних свиней, з використанням ЗЗК |
Wilmutetal, Schnieke Piedrahita |
|
|
1998 |
Отримання трансгенного ВРХ методом пересадки ядер трансформованих фетальних фібробластів Отримання трансгенного ВРХ з використанням псевдотіпних ретровірусних векторів Отримання ЕСК з бластоцист людини Отримання мишей методом ін'єкції в цитоплазму ядер кумулюсних клітин Отримання ВРХ методом пересадки ядер диференційованих клітин |
Cibelli Chan Thomson Wakayama Kato |
|
|
1999 |
Отримання трансгенних мишей методом коін'екціі ооцитів спермиями і екзогенної ДНК |
Perry |
|
|
2000 |
Отримання свиней методом пересадки ядер соматичних клітин (клітини гранульози) |
Polejaeva |
2. Фактори підвищення експресія трансгенів в організмі тварин
Поряд з низькою ефективністю більшості методів трансгенеза основним лімітуючим чинником отримання трансгенних є випадковий характер інтеграції трансгена в геном. На експресію трансгена в організмі тварин впливають послідовності, прилеглі кв ділянці інтеграції, що є причиною великої варіабельності рівня експресії. Рівень синтезу трангенного продукту може варіювати у різних тварин від ектопного до слабкого або навіть знаходиться нижче порога детекції.
Вплив ділянки інтеграції на рівень і характер експресії пояснюється так званим позиційним ефектом [Wilson era /., 1990, Sippel et al., 1997). Крім того, обмежені знання регуляторних послідовностей більшості генів призводять до використання часто повністю не охарактеризованих геномних фрагментів, що і є причиною низької ефективності експресії в експериментах з перенесення генів [Palmlter, Brinster, 1986].
Для того щоб подолати позиційний ефект і таким чином збільшити ймовірність оптимальної експресії трансгенів, інтегрованих у випадковій локалізації, був застосований цілий ряд різних стратегій.
Першим таким підходом, що дозволив збільшити рівень експресії, було введення в генні конструкції гомологічних інтрони послідовностей.
Позитивний вплив на рівень експресії трансгенів справляло введення в генні конструкції S / MAR-елементів Найбільш вдалим рішенням проблеми подолання позиційного ефекту стало інтеграція в певну ділянку геному за допомогою гомологічною рекомбінації в ембріональних стовбурових клітинах, оскільки це забезпечує контроль трансгенної конструкції всіма регуляторними послідовностями, присутніми в обраному ендогенному локусі. Оптимальна локалізація трансгенів у геномі клітини господаря може бути обрана виходячи з рівня та характеру експресії експериментального трансгена. Ще одним підходом, що дозволив дайної інтеграції трансгена в геном господаря є включення в генні конструкції всіх регуляторних елементів, відповідальних за його експресію. Стандартні плазмідні, космідні або фагових вектори в більшості випадків не можуть бути використані, внаслідок їх обмеженої місткості. Дана стратегія може бути використана із застосуванням векторів типу штучних хромосом, які мають підвищену клонуючої здатністю.
Найбільш широке застосування для отримання трансгенних тварин знайшли векторні системи на основі YAC (огляди Montoliuetal. 1993, Jakobovits, 1994, Peterson, 1997, Peterson etal 1997) YAC-еукаріотичні клонуючі вектори, здатні до стабільного збереження геномних фрагментів ДНК довжиною більше 1 мільйона п. о. [Burke., 1987]. Вони являють собою лінійні фрагменти ДНК, що містить всі необхідні елементи для їх збереження в клітинах дріжджів у вигляді штучних хромосом. Перші результати успішного використання YACs в експериментах з трансгенезу на мишах були отримані в 1993 році [Jakobovits et a /., 1993, Schedl et a /., 1993, Strauss etal., 1993].
Для введення YACs в ембріони мишей знайшли застосування три різних підходи: пронуклеарная мікроін'єкція очищеної в гелі YAC-ДНК [Schedl et a /., 1993], ліпофекція YAC-ДНК в ембріональні стовбурові клітини [Strauss et a /., 1993] і злиття дріжджового сферобласта з ембріональними стволовими клітинами [AtoboWte ef a /., 1993). Дослідження експресії YACs у різних ліній трансгенних мишей виявило залежність рівня експресії від числа копії трансгена. З іншого боку, рівень експресії не залежав від позиційного ефекту У той час, як YAC-технології широко використовуються для отримання трансгенних мишей [огляди Peterson et al., 1997, Giraldo and Montoliu, 2001) Кілька досліджувачів повідомили про успішне створення YAC-трансгенних сільськогосподарських тварин.
Результати отримання трансгенних тварин з використанням YAC.
|
Вид тварин |
Трансген |
Розмір |
Мета |
Автори |
|
|
кролик |
Тирозиназа миші |
250 |
Ідентифікація регуляторних послідовностей |
Montoliu, 1996 Brem, 1996 |
|
|
Кролик |
Аполіпопротеїн людини |
108 |
Аналіз структури |
Rouy, 1998 |
|
|
Свиня |
MCP, CD59, CD46 людини |
420 |
Ксенотрансплантація |
Yanoutsos, Langford, 1996 |
Були отримані свині і щури допомогою ксенотрансплатаціі і спрямованої експресією рекомбінантних генів в молоко трансгенних тварин, що число молекул YAC, мікроін'еціруемих в пронуклеус зигот значно менше, ніж при використанні плазмідних конструкцій (це обумовлено великим розміром YAC), загальна ефективність одержання трансгенних сільськогосподарських тварин з використанням векторів на основі УАС практично не відрізняється від результатів, отриманих з використанням стандартних генних конструкцій. Так, Brem з співавторами [1996 \, використовуючи концентрації YAC-ДНК 1-4 нг / мкл, отримали 7,4% трансгенних кроликів, що відповідало загальній ефективності 0,74%. Roue з співавторами ін'єктувати в пронуклеус зигот кроликів розчин YAC в концентрації 1 нг / мкл і досягли ступеня інтеграції 11,8% при загальній ефективності 0,71%. Таким чином, розмір ін'еціруемой ДНК суттєво не впливав на ефективність одержання трансгенних тварин.
Було встановлено, що при мікроін'єкції YAC в пронуклеос зигот тварин часто відбувається інтеграція в геном тільки частини молекули. Причиною може бути механічне пошкодження молекул ДНК великої довжини в ході приготування розчину ДНК і мікроін'єкції в пронуклеос. Щоб припинити пошкодження додають поліаміни, які формують комплекси з ДНК і стабілізують її допомогою утворення компактних структур.
Не дивлячись на величезні переваги векторів на основі YAC, вони мають ряд недоліків, що виражаються в певних труднощах лри створенні і підготовці YAC-конструкцій. До них відносяться химеризмом інсерцій (більше 50% клонів в YAC бібліотеці), нестабільність інсерцій, перебудови і потенційна контамінація ендогенними дріжджовими хромосомами, що ускладнює їх ефективне очищення. З метою виключення таких проблем були створені інші типи векторів на основі штучних хромосом, такі як клони Р1-фага, BAC - "bacterial artificial chromosome", PAC - "P1 bakteriophage-derived artificial chromosome".
Клонуються система бактеріофага Р1 може ефективно зберігати інсерцій гетерологічних ДНК розміром 70-100 т.п. о. [Stemberg, 1999].
Поряд з YACs BACs використовуються для виконання широкого спектру фундаментальних досліджень, що включає вивчення мутацій, дослідження функції і дії генів in vivo, ідентифікація та аналіз регулярних послідовностей, що знаходяться на значній відстані від структурного гена. Потенційні можливості BACs знайшли також застосування для підвищеної експресії рекомбінантних білків у молочній залозі трансгенних тварин [Stinnakre et al., 1999, Zuelke, 1998].
3. Перспективи генно-інженерних робіт у тваринництві
Розвиток біотехнології сільськогосподарських тварин, у тому числі генна інженерія, відкриває нові можливості розвитку тваринництва. Вже наявні результати з отримання трансгенних тварин говорять про можливість зміни ряду найважливіших господарсько-цінних ознак. Наприклад, трансгенні тварини (свині, кури, кролики) з геном гормону росту при рівних умовах характеризуються підвищеними темпами зростання.
Іншим важливим напрямом генної інженерії є одержання трансгенних особин з інтегрованими в геном генними конструкціями, пов'язаними з посиленням імунітету тварин до інфекційних захворювань.
Третім актуальним напрямком генної інженерії тварин є отримання тварин продуцентів біологічно активних речовин, необхідних у медицині, ветеринарії та технології переробки продуктів тваринництва. Багато біологічно активні речовини не можуть проводитися традиційними методами в достатніх кількостях і з бажаною якістю. Існує величезний комерційний інтерес до виробництва цих білків. У сироваріння існує значний дефіцит молокозсідальної ензимів, в зокрема, химозина, необхідного для отримання високоякісних твердих сортів сиру. Першим примірником трангенного тваринного стала миша, розмірами вдвічі перевершує звичайну особина в неї був введений ген, що синтезує гормон росту пацюка. І вчених відразу зацікавила можливість трансгенеза у сільськогосподарських тварин. Напрямок, пов'язаний з отриманням з трансгенних сільських тварин людських білків вже наближається до стадії комерціалізації. Вчені небезуспішно намагаються синтезувати людські білки в бактеріях і дріжджах. Але це дорого і технічно складно: з бактеріальних культур не завжди вдається виділити чистий білок. До того ж деякі білки неможливо отримати в бактеріях чинності громіздкість генів, що визначають їх синтез. Біореактор у вигляді корови або вівці позбавлений цих недоліків, і він набагато продуктивніше, а кінцевий продукт (білок) виходить в десятки разів дешевше. Але почалося все знову-таки з миші. У 1987 році в США вивели трансгенних мишей, в молоці яких містився тканинний плазміну-генний активатор, сприяє розсмоктуванню тромбів в людських судинах. Після цього успіху напрямок зацікавило великий капітал (ринок лікарських білків оцінюється приблизно в 10 млрд. доларів), і в надії на ефективність нової технології на майбутньому ринку почали впроваджуватися біотехнологічні гіганти, активно інвестуючи в НДДКР. За неповні десять років, що минули з американського досягнення, від трансгенних кіз, овець, свиней, кролів і навіть корів було отримано сімнадцять лікарських білків. Причому десять з цих білків виділялися з молоком в пристойній концентрації - близько одного грама на літр молока. Це велика кількість, оскільки для курсу лікування деяких хвороб потрібно всього кілька міліграмів. А зараз таким способом навчилися синтезувати набагато більше білків. Як мінімум три препарати, отриманих від трансгенних тварин, проходять сьогодні останні клінічні випробування.
Найбільш цікавим є використання молочної залози як продукуючого органу, тому що в цьому випадку рідину, що містить рекомбінантні протеїни, можна легко витягнути. Крім того, молочна залоза фізіологічно володіє величезним потенціалом синтезу протеїнів. Принципова можливість специфічної експресії трансгенів протеїну молока і чужорідних протеїнів у молочній залозі була продемонстрована в експериментах на мишах, кроликах, свинях, вівцях, кіз. Серед сільськогосподарських тварин отримання і використання трансгенних дрібних жуйних значно дешевше (на одиницю біологічної продукції), ніж корів, тому що вівці та кози мають коротку репродуктивним періодом і в разі інтенсивної експресії відповідного гена відразу ж відкривається можливість швидкого розмноження трансгенних тварин, створення промислового стада продуцентів і перманентних ліній трансгенних тварин, експресуючий бажані протеїни. При отриманні трансгенних тварин дослідники прагнуть до того, щоб всі соматичні клітини (повна трансгенність) і, особливо, генеративні клітини, містили генну конструкцію. У цих випадках інтеграція рекомбінантної ДНК призводить до повної трансгенів і за умови достатньої експресії обумовлює зміну фенотипу тварин і передачу цієї ознаки потомству. Основним способом одержання трансгенних тварин на сьогоднішній день залишається мікроін'єкція рекомбінантної ДНК в чоловічій пронуклеус ранніх зигот. Тому мікроін'єкцій генів здійснюють на максимально ранніх етапах розвитку тварини: в більшості випадків на стадії заплідненої яйцеклітини або двуклеточний ембріонів. Вже є трансгенні по гену химозина кролики з промотором казеїну великої рогатої худоби, в молоці яких відзначений високий рівень химозина і доведена його висока активність. У деяких кроликів в 1л молока міститься до 1500 мг химозина, а за лактацію від одного кролика можна одержати таку кількість химозина, яке здатне переробити до 10000 кг коров'ячого молока. Якщо врахувати, що для згортання 1 тонни молока при виробництві сиру потрібно 1 г химозина, то для виробництва сиру в Росії буде потрібно лише 300 кг химозина. Для цього необхідно мати "біотехнологічну" або "генну" ферму на 5 - 6 корів або 300 овець. Слід підкреслити, що головним критерієм при виборі відповідного виду тварин для "генних" ферм у більшості випадків повинен бути необхідний обсяг виробництва. Для виробництва протеїнів у молочній залозі в масштабах тонн доцільно використовувати корів, в сотнях кілограмів - овець і кіз, а в кілограмах - кроликів (Brinster Е.А., 1985).
В даний час розробляються і апробуються системи організації та функціонування біологічних підприємств на племінних фермах, що використовують трансгенних овець або кіз. Основна і найбільш трудомістка робота-створення первинних трансгенів з гарною продукцією (експресією) білка інтересу або т. зв. "Генних ферм". Для досягнення цієї мети, особливо в молочному козівництві, витрачені великі матеріальні та інтелектуальні ресурси, проте говорити про розвинену та діючої біоіндустрії на основі трансгенних овець і кіз, особливо в нашій країні, передчасно. Пов'язано це в першу чергу з тим, що метод мікроін'єкцій в пронуклеус не стовідсотковий. Часто трапляється, що генна конструкція може взагалі не вбудуватися в геном тварини, а якщо і вбудується, то може виявитися не у всіх клітинах. З трансплантованих яйцеклітин з генної конструкцією прижитися може лише п'ята частина, а вбудуватися в потрібну ділянку геному - 1-2%. Великого мистецтва вимагає і трансплантація зиготи в статеві шляхи самки. Інша проблема - пошук і виділення найбільш ефективних генних конструкції. Проводяться інтенсивні досліди з різними тваринами, з метою отримання такої експресії білка, яка була б найбільш економічно вигідною. Зараз біотехнологи Інституту біології гена і МГУ створюють конструкцію, яка буде містити ген, що визначає синтез лактоферину (білка, що відповідає у жіночому молоці за імунітет новонародженого). Складність полягає в тому, щоб підібрати до цього гену такий промотор, який не просто змусить його працювати в тканині молочної залози, а працювати ефективно, тобто викликати найбільший рівень експресії потрібного білка. Як правило, перші досліди зазвичай проводяться з мишами. На відміну від великих тварин їх простіше і дешевше утримувати, вони швидко доходять до статевозрілого віку, тому менше часу йде на отримання і розмноження трансгенних особин для подальшого їх вивчення. Далі спостерігають, які яйцеклітини прижилися, в яких тварин генна конструкція вбудувалася в активну частину генома. У кращому випадку зі ста яйцеклітин може вийти один-два трансгена (Ернст Л.К., 1993, Clark AJ Е.А., 1989, Pursel VG Е.А., 1990, Wilmut Iea, 1991). Як тільки в мишачому молоці з'явиться бажаний рівень лактоферину, можна буде переходити на продуктивних сільськогосподарських тварин, зокрема, кіз. Коза не так плодовита, як миші, і може народити двох, у кращому випадку трьох ягнят, тому кіз в експерименті повинно бути багато.
У той же час у кози, як біологічного об'єкта для генно-інженерних робіт, є чимало переваг. На кілограм живої маси коза дає в 2-3 рази більше молока, ніж корова, її репродуктивний цикл практично вдвічі коротше, і, нарешті, вона менш вибаглива і більш стійка. І все ж найбільш важлива проблема - доставка генної конструкції не просто в ядро яйцеклітини, а в потрібну хромосому. На думку багатьох фахівців, вимагають тонкої і точної роботи мікроін'єкції генів у зиготу можуть бути замінені в недалекому майбутньому більш ефективної і тиражованою технологією. І, судячи з публікацій, вчені наближаються до вирішення цього завдання. Поки ж більш ефективним методом, ніж мікроін'єкції гена в зиготу, представляється метод клонування тієї клітини, яка була відібрана в результаті численних дослідів в лабораторних умовах. Потомство, яке народилося з застосуванням такої технології, буде стовідсотково трансгенним. Втім, ця технологія тільки розробляється, її механізм ще не відпрацьований. Можна тільки з достатньою впевненістю припустити, що вже в найближче десятиліття технологія клонування може стати превалюючою На закінчення хотілося б підкреслити, що, розробка теорії трансгенеза сільськогосподарських тварин і пошуки шляхів практичного використання цього методу йдуть паралельно, у зв'язку з чим одержання як позитивних так і негативних результатів цілком можливо. Останнє десятиріччя XX століття знаменно глибоким інтегруванням біотехнології та молекулярної генетики в сучасну зоотехнії і в практику селекційно-племінної роботи. Ця взаємодія починається з планування генних конструкцій, яке базується на фундаментальних даних про обмінні процеси, що відбуваються в організмі тварин і знанні основних генетичних закономірностей, які керують формуванням їх продуктивності і закінчується об'єктивною оцінкою ефекту інтеграції в геном тварин чужорідного гена. Очевидно також, що можливість отримання трансгенних сільськогосподарських тварин реалізувалася в результаті розвитку методу трансплантації ембріонів, що саме по собі є серйозним досягненням зоотехнічної науки. Як і слід було очікувати, інтеграція в геном тварин чужорідних генів, незалежно від того, аналогічні вони вже наявних, або є новими, що зачіпають життєво важливі функції організму, викликає за активної їх експресії порушення фізіологічного гомеостазу як на клітинному так і на організмовому рівнях. При переході порога внутрішніх можливостей корекції посиленого генно-інженерним шляхом ознаки метаболічними системами тварин наставало розвиток різних патологічних змін, у тому числі і прогресуючих, що призводять до скорочення тривалості життя трансгенних тварин, порушення їх відтворної функції (Ернст Л.К. і співавт., 1993). Для вирішення завдання генно-інженерного зміни кількісних ознак тварин, що мають полігенну природу, очевидно, буде потрібно одержання політрансгенних сільськогосподарських тварин тільки внаслідок технічних причин (оскільки для цього, можливо, буде потрібно здійснення багатоступеневого трансгенеза), а й з-за неможливості клонувати ще невідомі гени. У зв'язку з цим основний інтерес більшості дослідників пов'язаний зараз з генами, робота яких визначає відносно незалежні морфофункціональні ознаки тваринного (інформаційний генетичний імунітет, продукція білків тварин і людини). Не виключено, однак, що на цьому шляху може бути отримано позитивну зміну будь-яких інших господарсько-корисних ознак тварин, визначених одиничними генами тварин.
Таким чином, успіхи в галузі молекулярної генетики та біології гена повинні забезпечити подальший прогрес у проблемі трансгенеза сільськогосподарських тварин, а, отже, у підвищенні ефективності і рентабельності виробництва різноманітної тваринницької продукції.
Размещено на Allbest.ru
...Подобные документы
Сутність та завдання генної інженерії. Використання ферментів рестрикції у методі рекомбінантних ДНК. Механізми клонування генів і трансформації еукаріот. Методи гібридизації соматичних клітин. Структура та функції гена. Протиріччя критеріїв алелізму.
презентация [3,1 M], добавлен 04.10.2013Методы трансгенеза в животноводстве. Использование половых клеток семенников. Факторы повышения экспрессии трансгенов в организме животных. Особенности пересадки ядер клеток, культивируемых in vitro. Перспективы генно-инженерных работ в животноводстве.
реферат [38,6 K], добавлен 26.09.2009Розгляд загальних положень механізму трансформації бактерій, рослин та тварин. Дослідження трансформації листових дисків тютюну шляхом мікроін’єкцій. Методика отримання трансформованих пагонів, їх підтримання і розмноження за допомогою брунькових пазух.
курсовая работа [349,3 K], добавлен 15.10.2014Класифікація біотехнологічних виробництв, їх різновиди, відмінні ознаки та функціональні особливості. Сутність конформації та класифікація білків в залежності від даного параметру. Поняття та зміст генної інженерії, її значення на сьогодні, принципи.
контрольная работа [14,5 K], добавлен 24.11.2011Стовбурові клітини як прародительки всіх без винятку типів клітин в організмі, знайомство з функціями. Загальна характеристика методу виділення клітин, вирощування органів на поживних середовищах. Аналіз найвідоміших прикладів наукових досягнень.
презентация [871,2 K], добавлен 02.02.2014Взаємодія барвників із структурами бактеріальної клітини. Ріст і розмноження бактерій. Культивування вірусів в організмі тварин. Фізичні методи дезінфекції. Гетерогенність популяцій мікроорганізмів. Бактеріостатичний, бактерицидний ефект дії антибіотиків.
контрольная работа [60,4 K], добавлен 24.02.2012Зміст поняття "клон". Вдале клонування соматичних клітин. Реагрегація бластерометрів, трансплантація ядер ембріонів. Перенесення ядра соматичної клітини в яйцеклітину. Відхилення, порушення розвитку клонованих тварин різних видів. Трансгенні риби.
лекция [2,4 M], добавлен 28.12.2013Поняття про популяцію. Нові методи у функційній геноміці. Імуно-генетичні маркери, їх класифікація. Властивості набутого імунітету. Методи аналізу поліморфізму білків. Функційна геноміка сільськогосподарських тварин. Метод мікрочіпів, нутрігеноміка.
курс лекций [1,8 M], добавлен 28.12.2013Участь марганцю в фізіологічних процесах. Наслідки нестачі марганцю в організмі. Токсична дія сполук марганцю на живі організми. Роль металотіонеїнів в детоксикації іонів марганцю в організмі прісноводних риб і молюсків, вплив низьких доз сполук марганцю.
курсовая работа [37,0 K], добавлен 21.09.2010Кальцій як біологічний елемент, його роль для здоров'я людини. Функції та фізіологічні перетворення кальцію в організмі. Клінічні прояви і вплив на структури вмісту кальцію в організмі, гіпокальціємічні стани: лікування і профілактика. Препарати кальцію.
курсовая работа [47,4 K], добавлен 21.09.2010Визначення терміну життя білків в організмі. Будова протеасоми як спеціального білкового утворення. Роль убіквіну в процесі утилізації білків. Методи виявлення злоякісних утворень або ослаблення імунної системи клітин. Функціональне призначення лізосоми.
презентация [111,1 K], добавлен 24.09.2014Історія розвитку та застосування біотехнології - комплексу наук, технічних засобів, спрямованих на одержання і використання клітин мікроорганізмів, тварин і рослин, а також продуктів їх життєдіяльності: ферментів, амінокислот, вітамінів, антибіотиків.
реферат [27,9 K], добавлен 07.12.2010Поняття і рівні регуляції експресії генів. Їх склад і будова, механізм формування і трансформування. Транскрипційний рівень регуляції. Приклад індукції і репресії. Регуляція експресії генів прокаріот, будова оперону. Огляд цього процесу у еукаріот.
презентация [1,7 M], добавлен 28.12.2013Основні процеси, за допомогою якого окремі клітини прокаріотів і еукаріотів штучно вирощуються в контрольованих умовах. Здатність перещеплених клітин до нескінченного розмноженню. Культивування клітин поза організмом. Основні види культур клітин.
презентация [1,3 M], добавлен 16.10.2015Об'єкти і методи онтогенетики. Загальні закономірності і стадії індивідуального розвитку. Генетична детермінація і диференціація клітин. Диференційна активність генів і її регуляція в процесі розвитку. Летальна диференціація клітин за розвитку еукаріотів.
презентация [631,0 K], добавлен 04.10.2013Фундаментальні принципи, методи, перспективи розвитку і застосування нанотехнологій з використанням мікроорганізмів та продуктів їх життєдіяльності. Виробництво наноматеріалів за допомогою мікроорганізмів, використання їх специфічних властивостей.
курсовая работа [1,2 M], добавлен 21.01.2016Особливості та основні способи іммобілізації. Характеристика носіїв іммобілізованих ферментів та клітин мікроорганізмів, сфери їх застосування. Принципи роботи ферментних і клітинних біосенсорів, їх використання для визначення концентрації різних сполук.
реферат [398,4 K], добавлен 02.10.2013Работы по клонированию позвоночных. Разработка микрохирургического метода пересадки ядер клеток. Первое клонированное животное. Работы шотландского эмбриолога Яна Уилмута. Преимущества и предполагаемые отрицательные последствия клонирования человека.
презентация [164,8 K], добавлен 18.12.2014Основна структурно-функціональна одиниця всіх живих організмів. Основні типи клітин. Будова, розмноження клітин та утворення білка. Колоніальні та багатоклітинні організми. Заміщення відмерлих та пошкоджених тканин організму. Способи поділу клітин.
презентация [5,6 M], добавлен 18.12.2011Роль магнію як найважливішого внутрішньоклітинного елементу в процесах, що відбуваються в організмі людини. Основні ознаки дефіциту магнію, його наслідки та методи попередження. Лікування дефіциту (недостачі) магнію. Продукти, які містять магній.
презентация [2,3 M], добавлен 05.09.2015
