Использование методов биотестирования в пищевой промышленности

Размещено на http://www.allbest.ru

Использование методов биотестирования в пищевой промышленности

Введение

Если зачерпнуть воды из пруда у берега и посмотреть на нее под микроскопом, то откроется удивительная картина. Циклопы и дафнии, нематоды и коловратки поражают фантастичностью и разнообразием форм. Эти организмы и более мелкие - бактерии, грибы, одноклеточные водоросли, инфузории и другие многочисленные простейшие - необходимое звено круговорота жизни. Особенно важную работу они выполняют сегодня, когда в окружающую среду поступают огромные количества техногенных отходов. Главная роль в переработке и обезвреживании разнообразных искусственных соединений принадлежит именно микроскопическим организмам.

Удивительно: с одной стороны, простейшие очень хорошо приспосабливаются к изменениям, иначе они не смогли бы выжить в меняющемся мире. С другой стороны, каждый отдельный организм очень тонко чувствует изменения среды, поэтому их можно использовать в биологических исследованиях безопасности почвы, природных и сточных вод. Такие исследования называют биотестами.

О биотесте подробнее

Биотестирование - это оценка реакции тест-организмов на ту или иную субстанцию. В качестве тест-организмов в экологии обычно используют низшие организмы, в том числе и одноклеточные, поскольку проводить опыты с ними гораздо удобнее, чем с высшими животными. Лучше всего подходят инфузории. Их легко выращивать, и оценить результат несложно - достаточно сосчитать их до начала опыта и в конце.

В экологических целях биотесты применяют и как отдельные методы, и в комплексных исследованиях. Биотесты также используют для оценки токсичности кормов, лекарств, полимерных материалов и питьевой воды. А вот безопасность пищевых продуктов и пищевых добавок с помощью биотестирования не определяют. Но если б определяли, была бы от этого польза? Прежде чем ответить на этот вопрос, рассмотрим состав современных продуктов.

Что мы едим

Допустим, мелким шрифтом на упаковке написано, что пищевой продукт содержит загадочные Е102, Е214, Е342, Е621. Технолог знает, что Е с номерами от 100 до 182 - красители, от 200 до 299 - консерванты, от 300 до 399 - антиоксиданты и регуляторы кислотности, от 600 до 699 - ароматизаторы и усилители вкуса. В частности, Е102 - краситель тартразин, Е214 - этиловый эфир парагидроксибензойной кислоты, Е342 - фосфаты аммония, Е621 - глутамат натрия. Все эти добавки разрешены в РФ, но, если говорить о мире в целом, на каждое из этих веществ имеется «компромат»: тартразин запрещен в ряде стран, глутамат (о котором мы еще поговорим подробнее) не рекомендован к применению в детском питании. С химической точки зрения (рис. 1) это самые разные соединения.

Рисунок 1 - Формулы некоторых распространенных пищевых добавок

Поскольку один продукт обычно содержит множество добавок, он может оказаться более вредным для здоровья, чем каждый компонент в отдельности.

Возможно, именно поэтому список нежелательных соединений постоянно растет; в него попадают и те, которые первоначально разрешили. Медики уже обнаружили канцерогенное, гепатотоксическое, неиротоксическое и аллергическое действие некоторых пищевых красителей, консервантов, антиокислителей, усилителей вкуса и подсластителей. Один из любимых аргументов у сторонников искусственных химических компонентов - их незначительные концентрации в пище при значительной эффективности. Однако, несмотря на малые количества каждой добавки, совокупное их действие в одном продукте может быть опасным для человека.

Патологические изменения метаболизма начинаются уже с пищеварения. Некоторые из этих веществ блокируют пищеварительные ферменты, из-за чего организм человека не может эффективно использовать питательные компоненты пищи. В результате начинает бурно размножаться гнилостная микрофлора толстого кишечника. Это происходит еще и потому, что пищевые добавки из группы консервантов угнетают полезные бифидум- и лактобактерии. А метаболиты гнилостных микроорганизмов (триптамин, спермидин, индол и скатол), попадая в кровь, отравляют организм.

Сами низкомолекулярные пищевые добавки тоже хорошо всасываются в желудочно-кишечном тракте и с кровью попадают в клетки тканей и органов. Их биохимические эффекты так же разнообразны, как и химическое строение. Так, например, пищевые азокрасители провоцируют свободно-радикальное окисление липидов, которое, в свою очередь, нарушает структуру и проницаемость мембран клеток. Свободные радикалы, участвуя в лавинообразном процессе пероксидного окисления, могут быть причиной опухолей и преждевременного старения.

Доказано, что пищевые добавки гетероциклического строения метаболизируют ферменты системы цитохрома Р450. Организм откликается тем, что начинает производить больше таких ферментов. От их активности зависит скорость образования канцерогенных веществ из проканцерогенов, то есть чем больше таких ферментов, тем быстрее происходит это нежелательное превращение. Например, при метаболизме бенз(а)пирена, который есть во всех копченых продуктах, образуется канцерогенный дигидроксиэпоксид.

Поскольку метаболизм любых чужеродных веществ сложен и неоднозначен, существующая система санитарно-гигиенической оценки пищи не справляется со своей задачей. Сегодня определение отдельных чужеродных веществ и ограниченные испытания на крысах уже не гарантируют безопасность продукта.

Получается парадоксальная ситуация: экологи, имеющие разнообразный и надежный инструментарии для контроля окружающей среды, стараются обеспечить безопасность пищевого сырья, а технологи добавляют в это сырье ксенобиотики и представляют результат как улучшенный продукт.

Пора менять систему санитарно-гигиенической оценки, причем и для вновь вводимых пищевых добавок, и для уже существующих. Здесь пригодились бы разнообразные цитотоксикологические методы, среди которых могут быть и биотесты на инфузориях.

Инфузории как тест-объекты

Аргументирование последнего утверждения начнем издалека - с описания биологических особенностей этих тест-организмов.

Инфузории - это одноклеточные эукариотические организмы, то есть у них есть ядро (а у многих видов инфузорий даже два ядра). Почти все клетки человека и других высших животных имеют ядра, а бактерии - прокариоты (безъядерные). Инфузории были одним из любимых объектов биологов еще лет сто назад, но и сейчас они остаются в центре внимания. Совсем недавно расшифровали геном инфузорий из рода Tetrahymena (рис. 2), состоящий из 27 тысяч генов. Кстати, геном человека содержит примерно столько же генов - 25 тысяч.

Рисунок 2 - Инфузория Tetrahymena thermophila, геном которой полностью расшифрован

Эти одноклеточные - в основном свободноживущие организмы, которые в воде и почве поедают бактерии и водоросли. Они - необходимое звено в трансформации органики, их вклад в биологический круговорот веществ не менее важен, чем у бактерий. Живут инфузории практически везде: в пресных и соленых водах, почве, и число их видов, по разным источникам от 7 до 10 тысяч.

Характерная особенность инфузорий - относительно быстрая изменчивость, которая позволяет им адаптироваться к самым разным условиям. Инфузории живут и в тундровых озерах, и в тропиках, и даже в горячих источниках с температурой до 50°С. Они приспосабливаются и к разному минеральному и органическому составу среды, а также к присутствию растворенных газов. Например, Paramecium caudatum может жить как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Эту высокую адаптивную способность обеспечивает колоссальное количество генов, большинство которых в повседневной жизни инфузориям не нужны, но включаются, когда условия меняются.

По мере того как простейшие адаптируются к условиям среды, перестраиваются все их жизненные функции, изменяются скорость движения, темп размножения и способность поглощать пищу, а также форма и размеры тела. Но если среда не меняется, то свойства инфузорий остаются стабильными, это и позволяет использовать их как тесты. Конечно, это относится только к инфузориям, культивируемым в лабораторных условиях.

В биотестах на инфузориях проще всего фиксировать изменение подвижности, гибель и скорость размножения. Например, можно смотреть изменение подвижности за 15-30 мин; гибель отдельных клеток за 1-4 часа; снижение скорости размножения за 1-3 суток; гибель популяции за 4-30 суток. Зачем так много параметров? Дело в том, что наблюдать за изменением подвижности недостаточно для оценки токсичности. Поскольку на движение у простейших расходуется всего 1% энергии общего обмена, то подвижность только незначительно отражает те изменения, которые происходят при отравлении токсичными агентами. Гибель отдельных клеток - достаточно надежный показатель, но с его помощью невозможно выявить низкие концентрации токсикантов. Оценка скорости размножения - биотест с большей чувствительностью, по нему можно определять и небольшие концентрации вредных веществ. Если сочетать все тесты, то результат получается надежный.

В большинстве методик биотестирования просто подсчитывают клетки до начала и в конце опыта. Как правило, это делают визуально под микроскопом, что весьма утомительно. Естественно, такая технология не нашла широкого применения.

На кафедре биохимии МГУ Прикладной биотехнологии мы разработали прибор (рис. 3), в котором клетки подсчитывает специальная компьютерная программа. Такая автоматизация существенно облегчает биотестирование, тем более что прибор позволяет использовать два вида инфузорий - Tetrahymena pyriformis и Paramecium caudatum (их размеры 0,03 Ч 0,05 мм и 0,06 Ч 0,35 мм). Тест проводят в два этапа: Paramecium caudatum, также известную как инфузория-туфелька, используют для предварительного выбора концентраций, а по динамике роста тетрахимен судят о воздействии на клетку какого-то вещества или пищевого продукта.

Рисунок 3 - Внешний вид прибора БиоЛаТ и изображение лунки с инфузориями, которые подсчитывает компьютерная программа

Двухэтапный биотест (рис. 4 и 5) подсластителей показал, что если добавлять ацесульфам калия, цикламат натрия и сахарин в концентрации 2%, то уже через 20 минут инфузории-туфельки погибают.

Если уменьшить концентрацию вдвое, то все инфузории выживают во всех подсластителях. В 2%-ных растворах трех других подсластителей - глюкозы, сорбита и сукралозы выживают все инфузории в течение двух часов.

Рисунок 4 - Выживаемость инфузорий Purumecium cuudutum в 2%-ных растворах подсластителей

На втором этапе биотестирования, с инфузориями Tetrahymena pyriformis, использовали 1%-ные растворы.

Оказалось, что самое плохое действие на тетрахимен оказывают ацесульфам калия и сахарин. Сукралоза и цикламат менее вредны, а сорбит вызывает даже больший прирост клеток, чем глюкоза. С учетом первого этапа, где цикламат действовал на клетку так же, как сахарин, этот подсластитель относим к группе добавок, негативно влияющих на клетки.

биотестирование пищевой инфузория

Рисунок 5 - Рост инфузорий Tetrahymena pyriformis за 20 суток в средах с 1%-ным содержанием подсластителей. Контроль - среда с глюкозой

Мы попробовали исследовать также натуральные пряности. Добавление экстрактов кардамона и перца душистого стимулирует рост культуры, а экстракт мускатного ореха инфузориям не очень понравился.

Что же с усилителями вкуса? Среди них самый опасный - глутамат натрия (рис. 6): во всех пробах с этой добавкой прирост культуры клеток значительно меньше, чем в контроле.

Рисунок 6 - Рост клеток Tetrahymena pyriformis в средах с добавлением усилителей вкуса

Ранее мы говорили, что современный подход к определению безопасности пищи не позволяет точно узнать, насколько опасны смеси химических веществ. Поэтому мы предлагали инфузориям не только отдельные вещества, но и продукты (рис. 7).

Мы посмотрели, как растут тетрахимены на четырех видах мясных продуктов: колбаса вареная, буженина, ветчина варено-копченая и вареное мясо. Интересно, что буженина с таким же содержанием белка, как в вареном мясе, дала такой же маленький прирост клеток, как колбаса. Это говорит о том, что в ее состав входили пищевые добавки (скорее всего, консерванты), которые ингибируют рост и размножение клеток. В дополнение к результатам биотестирования мы посмотрели, как меняется активность пищеварительных ферментов пепсина и химотрипсина в присутствии этих мясных продуктов. Тут тоже оказалось, что активность ферментов при «переваривании» буженины меньше, чем в ветчине и вареном мясе. Получается, что качественная коптильная жидкость, которую добавляют в ветчину, да и традиционное копчение менее опасны, чем консерванты в буженине.

Рисунок 7 - Результаты биотеста на инфузориях мясных продуктов

На инфузориях мы проверили консерванты, красители и загустители. Одновременно мы оценили активность пищеварительных ферментов в пробах, содержащих эти добавки. Результаты всех опытов хорошо соотносились друг с другом. Мы показали, что те добавки, которые вызывали уменьшение прироста культуры, как правило, действовали угнетающе на ферменты человека.

Конечно, одноклеточные тест-организмы имеют гораздо меньше ферментных систем, чем человек, и в целом устроены проще. Но без сомнения, инфузорию можно рассматривать как интегральный биологический датчик с определенными параметрами, подходящими для пищевых биотестов. Например, кислые пептидазы есть и у человека, и у инфузории. Это известно давно, а мы доказали, что различные пищевые добавки ингибируют и пепсин, и рост культуры. Системы, общие для инфузории и человека, как правило, дают схожие ответы на компоненты пищи, поэтому оценка с помощью инфузорий довольно достоверна. Выявить всю совокупность ферментных систем инфузорий, соответствующих системам человека в токсикологическом плане, - задача, которую мы сейчас решаем.

Размещено на Allbest.ru