Размещено на http://www.allbest.ru/

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ КЛЕТОК ГЕМОЛИМФЫ ЗЕМЛЯНОГО ШМЕЛЯ BOMBUS TERRESTRIS ( L.)

Для проведения исследования были взяты личинки 1-IV возрастов, белые куколки и имаго земляного шмеля. Гемолимфу личинок получали путем укола иглой в ложноножку, у куколок и имаго - путем прокалывания спинного кровеносного сосуда в области брюшка. У личинок срезали кутикулу на спинной стороне тела, в области перикардия и прижимали поверхность предметного стекла к срезу, в результате этого на мазок попадали клетки, находящиеся в прикрепленном виде. Полученные мазки гемолимфы и мазки-отпечатки фиксировали смесью Карнуа, метиловым спиртом и нейтральным формалином, затем окрашивали по Романовскому-Гимза и кислым гемалауном по Майеру. Для выявления ДНК использовали реакцию Фельгена, а также метиловый зеленый-пиронин для выявления ДНК и РНК. Белки окрашивали бромфеноловым синим, полисахариды определяли с помощью реакции ШИК, для выявления гликогена использовали раствор Люголя. Для выявления липидов и нейтральных жиров использовали судан черный В и судан красный III. Цитохимический анализ проводили с ферментативным контролем.

В гемолимфе земляного шмеля B. terrestris в соответствии с классификацией Сиротиной М.И. и Черной Г.С. (1965) нами были выделены следующие типы гемоцитов: прогемоциты, макронуклеоциты, фагоциты, сферулоциты и эноцитоиды. Исследования показали, что в ходе онтогенеза количественное соотношение данных типов гемоцитов изменяется в зависимости от стадии развития насекомого и определяется процессами гемоцитопоэза. Полученные нами мазки - отпечатки перикардиальной полости личинок земляного шмеля, позволили определить наличие участков, представляющих скопление довольно крупных клеток (до 9мкм), с относительно слабо конденсированным хроматином в ядре. По морфологическим особенностям они сходны с фрагментами гемоцитотворной ткани тополевого пилильщика (Запольских, 1979). Такие клетки способны к активному митотическому делению и, по-видимому, являются предшественниками прогемоцитов. Клетки, обнаруженных фрагментов кроветворной ткани морфологически однородны и могут быть определены как гемоцитобласты. При дальнейшем их развитии образуются прогемоциты, которые отличаются меньшими размерами (6.5-7.5 мкм) и более высокой степенью базофильности цитоплазмы. Клетки имеют довольно крупное ядро. У прогемоцитов личинок хроматин ядра мелкозернистый, у куколок и имаго хроматин выявляется иногда в виде плотного клубка. В цитоплазме прогемоцитов шмелей обнаружено высокое содержание РНК и белка, жировые капли и включения гликогена не встречаются.

Прогемоциты циркулирующие в гемолимфе, сохраняют способность к митозу и дальнейшей дифференциации. Число делящихся прогемоцитов составляет у личинок 1 возраста 5-6%, затем наблюдается снижение митотической активности до 3-4% у личинок 3 возраста и до 2% у белых куколок. На стадии имаго митотический индекс равен 1%. В гемолимфе шмеля, особенно у личинок ранних возрастов, можно наблюдать образование скоплений молодых гемоцитов, содержащих делящиеся прогемоциты и клетки, находящиеся на разных стадиях дифференциации. Наличие большого количества промежуточных форм между прогемоцитами и другими группами дифференцированных гемоцитов, позволяет считать их источником развития всех специализированных клеток гемолимфы. Наши наблюдения вполне согласуются с предположением о происхождении всех типов гемоцитов от единой первоначальной клетки (Price and Ratcliffe, 1974). Исследование процессов формирования зрелых клеток гемолимфы у личинок шмеля показало, что дифференциация гемоцитов происходит в двух направлениях с развитием нескольких линий клеток. Схема дифференциации гемоцитов личинок и белых куколок представлена на рисунке 1.

Первое направление связано с образованием двух линий клеток: микрофагоцитов и сферулоцитов (рис. 1, в, г). Микрофагоциты представляют собой наиболее мелкие фагоциты личинок и белых куколок шмеля, длина их клетки не превышает 10.5 мкм. Для дифференциации микрофагоцитов характерно изменение конденсации хроматина в ядре, который представлен относительно крупными хроматиновыми глыбками, и изменение формы клетки, она становится овальной или веретеновидной. В цитоплазме появляются вакуоли, их содержимое дает положительную реакцию на белки и полисахариды, иногда обнаруживаются жировые включения.

При образовании сферулоцитов в околоядерной области цитоплазмы, формируются две или три сферические вакуоли с белковым содержимым или белковыми гранулами. Накопление массы цитоплазмы сферулоцитов идет постепенно, одновременно с процессами дифференциации, поэтому у молодых сферулоцитов, имеющих небольшую величину, уже появляются сферические вакуоли, размеры которых увеличиваются пропорционально размерам клетки. Хроматин ядра принимает нитевидную структуру, хроматиновые глыбки четко не просматриваются. У зрелых сферулоцитов ядро смещается и, обычно, расположено эксцентрично. В конце развития личинки сферулоциты исчезают и в гемолимфе предкуколок не обнаруживаются.

При другом направлении развития прогемоцитов личинок и белых куколок происходит формирование макронуклеоцитов (рис. 1,б), которые в гемолимфе личинок составляют довольно многочисленную группу клеток. Макронуклеоциты представляют собой клетки с крупным ядром и относительно небольшим объемом цитоплазмы. Появление в гемолимфе макронуклеоцитов связано с интенсивностью процессов дифференциации клеток. Существует предположение о том, что у разных насекомых длительность процессов развития прогемоцитов различна, например, у пчел и муравьев развитие прогемоцитов идет быстрыми темпами и молодые формы специализированных гемоцитов уже имеют заметные характерные особенности, позволяющие выделять их как определенный тип клеток. У личинок земляного шмеля, прогемоциты, вступившие на путь дифференцировки, сохраняя малую степень дифференциации, заметно увеличиваются в размерах и переходят в следующую стадию развития - макронуклеоциты, которые в дальнейшем образуют ряд специализированных клеток гемолимфы. Такая поздняя дифференциация характерна для тех гемоцитов, которые должны иметь к началу дифференциации значительный объем цитоплазмы (Запольских, 1987).

Рис. 1. Схема дифференциации гемоцитов личинок и белых куколок шмеля B.terestris ( увел. об.40, ок.15)

гемолимфа клеточный шмель постэмбриональный

Прогемоциты (а), макронуклеоциты (б), микрофагоциты (в), сферулоциты (г), веретеновидные фагоциты (д), амебоидные фагоциты (е), эноцитоиды (ж), макрофагоциты (з).

Изучение морфологии макронуклеоцитов личинок и белых куколок земляного шмеля показало, что они сохраняют признаки малой дифференциации: ядерно-цитоплазматическое соотношение, характерное для прогемоцитов, плотно-зернистую структуру хроматина, интенсивную базофилию клетки, свидетельствующую о высокой концентрации РНК, способность к митотическому делению. Митотический индекс макронуклеоцитов равен 1-2%. Эти особенности морфологии макронуклеоцитов, общие для всей системы малодифференцированных гемоцитов, позволяют отнести их в группу пролиферирующих клеток. Но по сравнению с прогемоцитами, макронуклеоциты имеют более высокую степень дифференциации, на это указывает появление в цитоплазме вакуолей, содержащих полисахариды и липиды, а также наличие способности к образованию цитоплазматических отростков, определяющих фагоцитарные функции. Дальнейшая дифференциация макронуклеоцитов личинок приводит к образованию двух типов гемоцитов: фагоцитов и эноцитоидов (рис. 1, в,д,ж). Макронуклеоциты образуют при дифференциации веретеновидные и амебоидные фагоциты.

Для дифференцирующихся фагоцитов личинок и белых куколок характерно изменение формы и размеров клеток. Веретеновидные фагоциты приобретают удлиненную форму, с двумя цитоплазматическими отростками, длина и форма которых может быть различна. Длина клетки достигает 16 мкм. Форма амебоидных фагоцитов более разнообразна и определяется количеством и формой многочисленных цитоплазматических отростков. Зрелые клетки крупные, около 18 мкм в диаметре.

В ходе дифференциации фагоцитов ядро приобретает зернистую структуру, с немногочисленными хроматиновыми глыбками и тремя ядрышками. В цитоплазме формируется система вакуолей, особенно хорошо развитая у амебоидных фагоцитов. Большая часть мелких вакуолей расположена в периферической области клетки, где они собраны в группы. Содержимое вакуолей дает положительную реакцию на белки, иногда обнаруживаются полисахариды. В зрелых фагоцитах наблюдается появление гранул гликогена. Постоянными компонентами цитоплазмы являются жировые капли, более крупные у амебоидных фагоцитов, они обнаруживаются, в основном, в периферических частях цитоплазмы, где также сконцентрированы сложные белковые комплексы в виде липопротеидов и гликопротеидов. В гемолимфе белых куколок земляного шмеля в результате дифференциации макронуклеоцитов образуется особый класс фагоцитов - макрофагоциты (рис. 1, е), которые не встречаются в гемолимфе личинок. Макрофагоциты были обнаружены у ряда насекомых и определены как клетки участвующие в гистолизе личиночных тканей (Запольских, 1979). Молодые макрофагоциты имеют округлую или овальную форму, зрелые клетки приобретают амебоидную форму, с короткими и мощными цитоплазматическими отростками. У зрелых клеток небольшое мелкозернистое ядро часто располагается эксцентрично и не всегда хорошо просматривается в интенсивно окрашенной цитоплазме. В процессе дифференциации и роста клетки происходит накопление в цитоплазме большого количества белково-углеводных и жировых включений. В ходе роста макрофагоциты могут достигать 40 мкм в диаметре.

В процессе дифференциации эноцитоидов (рис. 1,з), которые встречаются только в гемолимфе личинок шмеля B. terrestris, наблюдается довольно характерное изменение структуры ядра. У молодых эноцитоидов ядро занимает центральную часть клетки, хроматин конденсируется в глыбки овальной формы, расположенные в ядре равномерно. У зрелых клеток глыбки четко выражены, их число не менее 14. В цитоплазме молодых эноцитоидов обнаруживается высокое содержание РНК, которое снижается в процессе дифференциации клетки и остается высоким лишь в периферической области. Перинуклеарное пространство эноцитоидов слабо окрашивается азур-эозином, вероятно здесь, как и у большинства перепончатокрылых насекомых, сконцентрированы органоиды: митохондрии и аппарат Гольджи. (Devauchelle, 1971). В периферической зоне цитоплазмы эноцитоидов начинают накапливаться мелкие вакуоли, которые постепенно заполняют всю цитоплазму, в их содержимом выявляются белки. Жировые включения в цитоплазме эноцитоидов отсутствуют. Встречаются мелкие зерна гликогена, изредка белковые гранулы.

Изучение состава гемоцитов куколок и имаго земляного шмеля показало, что в гемолимфе темной куколки происходит полная смена личиночных гемоцитов на имагинальные. Дифференциация гемоцитов имаго шмеля представлена на рисунке 2.

Рис. 2. Схема дифференциации гемоцитов имаго B. terrestris ( увел. об.40, ок.15): прогемоциты (а), нейтрофильные фагоциты (б), сферулоциты (в).

На схеме видно, что у имаго земляного шмеля прогемоциты (рис 2,а) являются источником развития двух типов клеток гемолимфы: фагоцитов и сферулоцитов. Макронуклеоциты, выявленные в гемолимфе личинок, у имаго не обнаруживаются, что связано с более высокой скоростью процессов дифференциации прогемоцитов и образования специализированных клеток у имаго, по сравнению с личинками. С быстро протекающими процессами диференциации прогемоцитов возможно связано уменьшение митотического индекса у имаго до 1%. Вероятно, у имаго регенерация прогемоцитов обеспечивается в большей степени клетками кроветворной ткани. Для дифференцирующихся фагоцитов и сферулоцитов имаго шмеля по существу характерны те же изменения структуры, какие мы наблюдали у соответствующих типов гемоцитов личинок.

Таким образом, изменение количественного соотношения форменных элементов крови связано с процессами их образования и дифференциации. Общим источником развития специализированных клеток гемолимфы у шмелей является система малодифференцированных клеток, что характерно и для других групп животных. Увеличение числа клеток гемолимфы может происходить как за счет образования новых клеток в кроветворных органах, так и путем митотического деления малодифференцированных гемоцитов в циркулирующей гемолимфе. Данные процессы способствуют сохранению постоянного состава гемоцитов на уровне, необходимом для нормальной жизнедеятельности организма и адаптации его к изменению условий окружающей среды.