Фракционирование клеток

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Фракционирование клеток

клетка фракция гомогенизация

В цитологии широко применяют различные методы биохимии, как аналитические, так и препаративные. В последнем случае можно получить в виде отдельных фракций разнообразные компоненты и изучать их химический состав, ультраструктуру и свойства. Так, в настоящее время в виде чистых фракций получают практически любые клеточные органеллы и структуры: ядра, ядрышки, хроматин, ядерные оболочки, плазматическую мембрану, вакуоли эндоплазматического ретикулума, его рибосомы, рибосомы гиалоплазмы, аппарат Гольджи, митохондрии, их мембраны, пластиды, пероксисомы, микротрубочки и др. В последнее время получены чистые фракции центриолей и ядерных пор.

Получение клеточных фракций начинается с общего разрушения клетки, с ее гомогенизации. Затем из гомогенатов уже можно выделять фракции. Одним из основных способов выделения клеточных структyp является дифференциальное (разделительное) центрифугирование. Принцип его применения в том, что время осаждения частиц в гомогенате зависит от их размера и плотности: чем больше частица или чем она тяжелее, тем быстрее она осядет на дно пробирки. Для убыстрения процесса оседания варьируют ускорения, создаваемые центрифугой. При центрифугировании раньше всего и при небольших ускорениях осядут ядра и неразрушенные клетки, при 15-30 тыс. g осядут крупные частицы, макросомы, состоящие из митохондрий, мелких пластид, пероксисом, лизосом и др., при 50 тыс. g осядут микросомы, фрагменты вакуолярной системы клетки. При повторном дробном центрифугировании этих смешанных подфрак-ций можно получить чистые фракции. Так, при разделении макросомной подфракции получают отдельно митохондрии, лизосомы, пероксисомы. При разделении микросом можно получить фракцию мембран аппарата Гольджи, фрагментов плазматической мембраны, вакуолей, гранулярного ретикулума. В случаях более тонкого разделения фракций используют центрифугирование в градиенте плотности сахарозы, что позволяет хорошо разделить компоненты, даже незначительно отличающиеся друг от друга по удельной массе.

Прежде чем выделенные фракции анализировать биохимическими способами, необходимо проверить их на чистоту с помощью электронного микроскопа.

Получение отдельных клеточных компонентов дает возможность изучать их биохимию и функциональные особенности. Так можно создать бесклеточную систему для рибосом, которые будут синтезировать белок по заданной экспериментатором информационной РНК. Выделенные митохондрии в подобранных условиях могуг осуществлять синтез АТФ, на выделенном хроматине при участии соответствующих ферментов может происходить синтез РНК и т.д.

В последнее время применяются бесклеточные системы для воссоздания клеточных надмолекулярных структур. Так, используя очищенные от гранул желтка экстракты цитоплазмы яиц земноводных или яиц морских ежей, можно получить ядра с ядерной оболочкой из введенной в эту бесклеточную систему чужеродной ДНК (например, ДНК бактериофага). Такая ДНК связывается с белками-гастонами, которые есть в избытке в таком экстракте, образуется хроматин (дезоксирибонуклеопротеид), который покрывается двойной мембранной оболочкой, несущей даже ядерные поры. Такие модельные системы помогают изучать тонкие, интимные процессы, например транспорт макромолекул из цитоплазмы в ядро, и наоборот. В цито-плазматических экстрактах яиц земноводных и иглокожих такие ядра могут периодически делиться путем митоза. Эти модели внесли огромный вклад в расшифровку природы регуляции клеточного цикла.

Большой вклад в биологию клетки вносят методы клеточной инженерии. Найдено, что различные живые клетки могут сливаться друг с другом, если специальными способами обработать их плазматические мембраны. Так можно слить эритроцит курицы и лимфоцит человека. При этом получается двуядерная клетка - гетерокарион, в котором происходит активация ядра куриного эритроцита (рис. 14). Если гетерокарион образуется из близкородственных клеток (например, мыши и хомячки), то при вступлении их в митоз хромосомы могут объеди-

После разделения такой клетки получится истинно гибридная клетка. Другие приемы позволяют конструировать клетки из разных по происхождению ядер и цитоплазмы (рис. 15). Так, разрушив актиновый компонент цитоскелета и подвергнув клетки центрифугированию, клетку можно разделить на две части: ядро с узким ободком цитоплазмы - кариопласт и на оставшуюся часть цитоплазмы - цитопласт. Затем, используя разные кариопласты и цитопла-сты, можно создавать разные комбинации реконструированных клеток.

Методы клеточной инженерии широко применяются не только в экспериментальной биологии, но и в биотехнологических целях. Например, при получении моноклональных антител используются клеточные гибриды между лимфоцитами иммунизированных животных и интенсивно размножающимися клетками миеломы. Полученные первичные дикарионы образуют истинные гибридные клетки, которые и нтенсивно размножаются за счет генома опухолевых миеломных клеток, и одновременно выделяют большое количество антител за счет работы генома иммунизированных лимфоцитов. Этот прием позволяет получать большое число гибридомных клеток, вырабатывающих большие количества необходимых антител.

Нет необходимости приводить описание всех методов и приемов, используемых в цитологии для изучения строения, химии и функций клеток или их компонентов. Этого краткого обзора достаточно для того, чтобы показать богатство арсенала методов в цитологии, позволяющих давать точный анализ, начиная от формы, общего вида и размера клетки и кончая молекулярной композицией ее отдельных частей.

Пероксисомы (микротельца)

Это небольшие вакуоли (0,3-1,5 мкм), одетые одинарной мсмбр| ной, отфаничивающей гранулярный матрикс, в центре которою рас полагается сердцевина, или нуклеоид (ничего не имеющий общего с нуклеоидом бактерий и вообще к ядерным структурам не относящийся)

В зоне сердцевины часто, особенно в пероксисомах печеночных клеток, видны кристаллоподобные структуры, состоящие из регулярно упакованных фибрилл, или трубочек. Изолированные сердцевины пероксисом содержат фермент уратоксидазу.

Пероксисомы обнаружены у простейших (амебы, тетрахимена), у низших грибов (дрожжи), у высших растений в некоторых эмбриональных

тканях (эндосперм) и в зеленых частях, способных к фотореспирации.

У высших позвоночных животных они найдены главным образом в печени и почках.

пероксисомы часто локализуются вблизи мембран ЭПР. У зеленых растений пероксисомы часто находятся в тесном контакте с митохондриями и пластидами.

Впервые пероксисомы были выделены из печени и почек. Во фракциях пероксисом обнаруживаются ферменты, связанные с метаболизмом перекиси водорода. Это ферменты (оксидазы, уратоксидаза, оксидаза D-аминокислот) окислительного дезаминирования аминокислот при работе которых образуется перекись водорода (Н₂О₂) и каталаза, разрушающая ее. В пероксисомах печени каталаза составляет до |40% белков и локализована в матриксе. Так как Н₂О₂ является токсическим веществом для клеток, то каталаза пероксисом может играть защитную роль.

В пероксиомах происходит накопление специфических белков, которые синтезируются в цитозоле и имеют свои сигнальные участки. В мембране пероксисом есть рецепторныи белок, который узнает транспортируемые белки. Белки мембран пероксисом, как и липиды, приходят из цитозоля. Такое накопление содержимого и рост мембраны приводят к общему росту пероксисомы, которая затем с помощью неизвестного пока механизма делится на две, т.е. самореплицируется.

Рецепторная роль плазмалеммы

Мы уже встречались с этой особенностью плазматической мембраны при ознакомлении с ее транспортными функциями. Белки-переносчики и насосы являются кроме всего также рецепторами, узнающими и взаимодействующими с определенными ионами. Рецепторные белки связываются с лигандами и участвуют в отборе молекул, поступающих в клетки.

В качестве таких рецепторов на поверхности клетки могут выступать белки мембраны или элементы гликокаликса - гликопротеиды. Такие чувствительные к отдельным веществам участки могут быть разбросаны по поверхности клетки или собраны в небольшие зоны.

Разные клетки животных организмов могут обладать разными наборами рецепторов или же разной чувствительностью одного и того же рецептора.

Роль многих клеточных рецепторов заключается не только в связывании специфических веществ или способности реагировать на физические факторы, но и в передаче межклеточных сигналов с поверхности внутрь клетки. В настоящее время хорошо изучена система передачи сигнала клеткам с помощью некоторых гормонов, в состав которых входят пептидные цепочки. Эти гормоны связываются со специфическими рецепторами на поверхности плазматической мембраны клетки. Рецепторы после связи с гормоном активируют другой белок, лежащий уже в цитоплазматической части плазматической мембраны, - аденилатциклазу. Этот фермент синтезирует молекулу циклического АМФ из АТФ. Роль циклического АМФ (цАМФ) заключается в том, что он является вторичным мессенджером - активатором ферментов киназ, вызывающих модификации других белков-ферментов. Так, при действии на печеночную клетку гормона поджелудочной железы глю-кагона, вырабатываемого А-клетками островков Лангерганса, он связывается со специфическим рецептором, что стимулирует активацию аденилатциклазы. Синтезированный цАМФ активирует протеинкина-зу А, которая в свою очередь активирует каскад ферментов, в конечном счете расщепляющих гликоген (запасной полисахарид животных) до глюкозы. Действие инсулина заключается в обратном: он стимулирует вхождение глюкозы в печеночные клетки и отложение ее в виде гликогена.

В целом цепь событий развертывается следующим образом: гормон взаимодействует специфически с рецепторной частью этой системы и, не проникая внутрь клетки, активирует аденилатциклазу, которая синтезирует цАМФ. Последний активирует или ингибирует внутриклеточный фермент или группу ферментов. Таким образом, команда (сигнал от плазматической мембраны) передается внутрь клетки. Эффективность этой аденилатциклазной системы очень высока. Так, взаимодействие одной или нескольких молекул гормона может привести за счет синтеза множества молекул цАМФ к усилению сигнала в тысячи раз. В данном случае аденилатциклазная система служит преобразователем внешних сигналов.

Существует и другой путь, при котором используются другие вторичные мессенджеры, - это так называемый фосфатидилинозитольный путь. Под действием соответствующего сигнала (некоторые нервные медиаторы и белки) активируется фермент фосфолипаза С, которая расщепляет фосфолипид фосфатидилинозитолдифосфат, который входит в состав плазматической мембраны. Продукты гидролиза этого липида, с одной стороны, активируют протеинкиназу С, которая вызывает активацию каскада киназ, что приводит к определенным клеточным реакциям, а с другой - приводит к освобождению ионов кальция, который регулирует целый ряд клеточных процессов.

Другой пример рецепторной активности - рецепторы ацетилхолина, важного нейромедиатора. Ацетилхолин, освобождаясь из нервного окончания, связывается с рецептором на мышечном волокне, что вызывает импульсное поступление Na⁺ в клетку (деполяризация мембраны), открывая сразу около 2000 ионных каналов в зоне нервно-мышечного окончания.

Разнообразие и специфичность наборов рецепторов на поверхности клеток приводят к созданию очень сложной системы маркеров, позволяющих отличать свои клетки (той же особи или того же вида) от чужих. Сходные клетки вступают друг с другом во взаимодействия, приводящие к слипанию поверхностей (конъюгация у простейших и бактерий, образование тканевых клеточных комплексов). При этом клетки, отличающиеся набором детерминантных маркеров или не воспринимающие их, либо исключаются из такого взаимодействия, либо (у высших животных) уничтожаются в результате иммунологических реакций.

С плазматической мембраной связана локализация специфических рецепторов, реагирующих на физические факторы. Так, в плазматической мембране или в ее производных у фотосинтетических бактерий и синезеленых водорослей локализованы белки-рецепторы (хлорофиллы), взаимодействующие с квантами света. В плазматической мембране светочувствительных клеток животных расположена специальная система фоторецепторных белков (родопсин), с помощью которых световой сигнал превращается в химический, что в свою очередь приводит к генерации электрического импульса.

Размещено на Allbest.ru