Культивування бактерій: поняття про чисту культуру, живильні середовища

Ці середовища забезпечують переважний розвиток одного виду або групи споріднених мікроорганізмів і менш придатні або зовсім не придатні для розвитку інших. Знаючи фізіологічні особливості відповідної групи мікробів, можна підібрати такі умови культивування (склад середовища, її активну кислотність, умови аерації, температуру тощо), при яких будуть розвиватися лише мікроорганізми цієї групи. Це дозволяє вести різні біологічні процеси в лабораторії й у виробництві без попередньої стерилізації середовища. Такі середовища застосовуються головним чином для виділення мікроорганізмів з місць їх природного проживання, для отримання накопичувальних культур.[6]

Природні середовища для вирощування бактерій

Природні поживні середовища можуть містити компоненти тваринного (наприклад, кров, сироватка, жовч) або рослинного (наприклад, шматочки овочів і фруктів) походження. За призначенням виділяють консервуючі середовища (для первинного посіву та транспортування), середовища збагачення (для нагромадження певної групи бактерій), середовища для культивування (універсальні прості, складні спеціальні та для токсінообразованія), середовища дм виділення та накопичення (консервуючі, збагачення та елективні) і середовища для ідентифікації (диференціальні й елективні-диференціальні).[6]

Напівсинтетичне середовище

Поряд з натуральними і синтетичними середовищами виділяють так звані напівсинтетичні середовища. Головними компонентами складу - вуглеводи, солі амонію або нітрати, фосфати і т.д. Проте в їх склад завжди включаються речовини невизначеного складу, такі як дріжджовий автолізат, грунтовий екстрат або гідролізат казеїну. Ці середовища знаходять широке застосування в промисловій мікробіології для отримання амінокислот, вітамінів, антибіотиків та ін. важливих продуктів життєдіяльності мікроорганізмів.[13]

Слід мати на увазі, що середовища, що забезпечують хороший розвиток мікроорганізмів, не завжди підходять для вирішення інших дослідницьких і практичних завдань, так як далеко не у всіх випадках накопичення якого продукту життєдіяльності - ферменту, вітаміну, антибіотика і т.д. - йде паралельно накопиченню біомаси. Нерідко при рясному зростанні мікроорганізмів бажаний продукт метаболізму майже не утворюється або утворюється в недостатній кількості. [13]

Класифікація поживних середовищ по забрудненості матеріалу

Якщо матеріал слабо забруднене сторонньої мікрофлорою, то для виділення чистих культур застосовують прості (за складом) середовища. При рясної контамінації сапрофіти використовують спеціальні або елективні (для окремих видів), селективні (тільки для окремих бактерій), диференційно-діагностичні (для полегшень ідентифікації) середовища.[13]

Характеристики поживних середовищ для культивування бактерій. Консервуючі середовища для бактерій. Середовища збагачення для бактерій. Елективні і селективні живильні середовища для вирощування бактерій. [13]

Консервуючі поживні середовища попереджають відмирання патогенів і пригнічують ріст сапрофітів. Найбільше застосування знайшли гліцеринова суміш (середа Тойга), гіпертонічний розчин, гліцериновий консервант з LiCl2, розчин цитрату натрію і дезоксихолат натрію (середа Бенгсанга-Еліота). [13]

Середовища збагачення бактерій

Середовища збагачення (наприклад, середу китта-тароцці, селенітовий бульйон, тіогліколятная середу) застосовують для накопичення певної групи бактерій за рахунок створення умов, оптимальних для одних видів і несприятливих для інших. Найбільш часто в якості подібних агентів використовують різні фарбники і хімічні речовини - солі жовчних кислот, тетратионат Na +, телурит К, антибіотики, фуксин, гендіановий фіолетовий, діамантовий зелений та ін.[8]

4.2 Елективні, селективні та диференційно- діагностичні поживні середовища елективні та салективні

Елективні і селективні середовища (наприклад, середовища Уїлсона-Блера, Ендо, Плоскірєва, Мак-Конки) призначені для первинного посіву матеріалу або для пересіву з консервуючих середовищ або середовищ збагачення з метою одержання чистої культури. Середовища готують з урахуванням біохімічних і енергетичних потреб мікроорганізмів. Відповідно, виділяють кров'яні і сироваткові середовища (наприклад, Леффлера, Борде-Жангу), яєчні середовища (наприклад, Левенштайна-Йенсена) та ін.[9]

Диференційно - діагностичні живильні середовища

Диференційно-діагностичні середовища (рис. 6) (наприклад, середовища Хісса, Кларка) застосовують для вивчення та ідентифікації окремих типів, видів і груп бактерій. В якості основи застосовують різні органічні і неорганічні сполуки, гідролізати казеїну, пептонну воду, бульйон Хоттінгера-Мартена, доповнені вуглеводами, спиртами, сечовиною та іншими речовинами; при їх розщепленні відбувається зсув рН в кислу (вуглеводи, спирти, ліпіди) або лужну (білки ) сторону. Відповідно, виділяють середовища з вуглеводами і спиртами, середовища з сечовиною, середовища для визначення індолообразування, середовища для визначення протеолітичної активності і комбіновані (Політропний) середовища.[4]

Рис. 6 Диференційно-діагностичні середовища

У такі середовища також часто вносять різні індикатори (наприклад, бромтимоловий синій, індикатор Андраде, бромкрезоловий пурпурний і крезоловий червоний), що допомагають візуально визначити зміну рН, характерне для різних мікроорганізмів. Зокрема, зрушення в кислу сторону викликає почервоніння середовища з реактивом Андраде або пожовтіння при використанні середовища з бромтимоловим синім, тоді як при защелачивании реактив Андраде і індикатор бром-Тимолова синій не змінюють колір середовища. Всі диференційно-діагностичні середовища поділяють на чотири основні групи. [4]

Середовища, що містять білки

Середовища, що містять білки, що дають характерні зміни під дією бактеріальних ферментів (кров, желатину, молоко та ін.), застосовують для визначення гемолітичних або протеолітичних властивостей. Найбільш поширені м'ясопептонний желатину (МПЖ), згорнулася кінська сироватка, молоко і кров'яний агар (ка).[5], [4]

Середовища, що містять вуглеводи або багатоатомні спирти

Ферментативне розщеплення субстратів приводить до зрушення рН і зміні забарвлення середовища, а іноді і утворення газу. Найбільш поширені кольорові середовища з різними вуглеводами (наприклад, з бромтимоловим синім, індикатором ВР), лакмусовое молоко (середа Мінкевича) і середовища Хісса. З вуглеводів найбільш часто використовують моносахариди (ксилозу, Арабіноза, глюкозу, фруктозу, манозу, галактозу), дисахариди (лактозу, мальтозу, сахарозу), полісахариди (крохмаль, глікоген, інулін, декстрин), спирти (дульцит, маніт, сорбіт, гліцерин) і глікозиди (Адонія, інозит, саліцин, амігдалин).

Середовища для визначення редукуючої здібності

У цю групу входять середовища з фарбами, знебарвлюються при відновленні (наприклад, метиленовий блакитний, нейтральний червоний, індігокармін), а також середовища з нітратами для визначення денітрифікуючі активності бактерій (при позитивному результаті середовища забарвлюються в синій колір).[7]

Середовища, що включають речовини

Середовища, що включають речовини, асимільовані тільки певною групою бактерій. Найбільш відомі нітратний агар Сіммонса і цитратна середу Козера. [5]

За фізичним станом розрізняють рідкі, сипучі і щільні.

Рідкі середовища

Рідкі середовища широко застосовуються для накопичення біомаси або продуктів обміну, для дослідження фізіології і біохімії мікроорганізмів, а також для підтримки та збереження в колекції культур мікроорганізмів. [6]

Сипучі середовища

Сипучі середовища застосовуються головним чином у промисловій мікробіології для культивування деяких продуцентів фізіологічно активних сполук, а також у колекціях для збереження культур мікроорганізмів. До таких середовищ відносяться, наприклад, розварене пшоно, висівки, кварцовий пісок, просочений живильним розчином. [13]

Щільні середовища

Щільні середовища(рис. 7) використовують для виділення чистих культур, в діагностичних цілях для опису колоній, для визначення кількості мікроорганізмів, їх антибіотичної активності, для зберігання культур в колекціях і в ряді інших випадків.

Щільні середовища представляють собою волокнистий матеріал, який добувають з морських водоростей. Складається він з полісахаридів (70-75 %), білків (2-3 %), основними складниками є високомолекулярні агароза та агаропептин. Агар розчиняється у воді при підвищеній температурі, а, застигаючи, надає середовищу драглеподібної консистенції та стійкості до ферментних систем бактерій. Саме за ці властивості він набув широкого розповсюдження у мікробіологічній практиці. Для створення щільних середовищ використовують також желатин (10-15 %), згорнуту сироватку крові.Щільною основою можуть служити пластинки силікагелю, що насичують живильним середовищем.[13]

Рис. 7. Щільні живильні середовища в чашках Петрі.

5. Способи культивування мікроорганізмів

5.1 Поверхневе культивування

В цьому випадку мікроорганізми вирощують на поверхні щільного середовища або в тонкому шарі рідкого середовища, і кисень надходить до них безпосередньо з повітря. При поверхневому культивуванні важливо збільшити площу зіткнення середовища з повітрям. Для цього середовища наливають тонким шаром у посуд з широким дном - чашки Петрі, колби Виноградського, матраци (рис. 7). У рідких середовищах аеробні мікроорганізми часто ростуть, утворюючи на поверхні плівку. Факультативні анаероби розвиваються не тільки на поверхні, але і в товщі рідкого середовища, викликаючи більш-менш рівномірний її помутніння. Поверхневе культивування мікроорганізмів застосовується як в лабораторних умовах, так і в промисловості. [13]

5.2 Глибинне культивування

Всі способи глибинного культивування аеробних мікроорганізмів зводяться до збільшення поверхні зіткнення живильного середовища з киснем повітря. Слід мати на увазі, що при глибинному культивуванні в рідких середовищах мікроорганізми використовують розчинений кисень. Разом з тим розчинність кисню у воді невелика, тому, щоб забезпечити зростання аеробних мікроорганізмів у товщі середовища, її необхідно постійно аерувати. При аеріруванні середовища враховують два показники: інтенсивність аерації та ступінь аерації. Інтенсивність аерації характеризується швидкістю розчинення кисню в одиниці об'єму культурального середовища за одиницю часу. Ступінь аерації - це об'єм повітря, що продувається через певний об'єм середовища за одиницю часу. [13],[4]

Найбільш простий і широко поширений в лабораторній практиці спосіб глибинного культивування - вирощування на гойдалках, які забезпечують струшування або обертання колб або пробірок зі швидкістю 100-200 і більше оборотів в хвилину. Чим більше швидкість обертання, тим більше зіткнення середовища з повітрям і вище насичення її киснем. Збільшити аерацію середовища при роботі на одній і тій же гойдалці можна зменшенням об'єму середовища або застосуванням колб з відбійниками - вдавлення всередину у вигляді 4-8 відростків 2-3 см. довжиною. (рис8) При обертанні колб з відбійниками поверхню зіткнення середовища з повітрям помітно збільшується завдяки розбризкуванню рідини.[13], [14]

Рис.8. Посуд для культивування мікроорганізмів: 1- качалочка колба; 2 - качалочка колба з відбійниками; 3 - конічна колба; 4 - чашка Петрі; 5 - пробірка; 6 - матрац

Аерувати культуру мікроорганізмів можна продуванням через товщу середовища стерильного повітря. Цей спосіб часто використовують в лабораторних дослідженнях, але особливо широке застосування він знайшов у промисловій мікробіології при отриманні біомаси та різних продуктів життєдіяльності мікроорганізмів - антибіотиків, ферментів, кислот.[10,9]

5.3 Періодичне культивування

Існує дві пренціпіально різні системи вирощування микрорганизмов в рідкому середовищі. В одному випадку після інокуляції середовища не відбувається ні додати до неї, ні видалення будь-яких компонентів, крім газової фази. Така закрита система культивування носить назву періодичної і може підтримувати розмноження клітин тільки протягом обмеженого часу, протягом якого змінюється склад вихідної середовища і навколишні умови.[9]

Безперервне культивування

Указаних змін, які мають місце при періодичному культивуванні, можна уникнути, використовуючи метод безперервного культивування. При цьому в інокулятор (ферментер) певними порціями надходить стерильне повноцінне живильне середовище, а з нього з певною швидкістю відбивається культуральна рідина (середовище з мікробними клітинами та продуктами їх метаболізму). Тим самим створюється можливість культурі тривалий час пребувати у фазі експоненційного росту за постійної концентрації субстрату і незмінних інших умов.[14]

Для безперервного культивування характерна постійна подача свіжих поживних компонентів із швидкістю ,що дорівнює швидкості видалення культуральної рідини. Якщо культура добре перемішується, то проби, які відбираються частини ферментера, будуть однакові за біомасою і концентрацією субстрату.[11]

При безперервному культивуванні теоретично бактерії ростуть експоненційно , а тому обґєм культури з часом не змінюється. Такий принцип покладений в основу безперервного культивування в хемостатах і турбідостатах. [11]

Хемостат (рис. 9) має культиватор , в який із спеціального резервуара з постійною швидкістю надходить поживне середовище. Завдяки аерації та постійному перемішуванню в культиваторі створюються оптимальні умови для забезпечення киснем і рівномірного розподілу поживних речовин, що надходять з новими порціями розчину. У міру надходження в культиватор поживного розчину з нього витікає культуральна рідина, що можна забезпечити системою подвійного насоса (для введення свіжого середовища і вилученні культуральної рідини).[2],[1]

Подвійний насос і система регулювання рівня та стану середовища забезпечують практично постійні умови для розвитку культури.

Ріст бактеріальної культури в хемостаті контролюється концентрацією субстрату. На такому обмеженні швидкості росту концентрацією одного з необхідних субстратів (джерело азоту, сірки чи фосфору, донор водню) базується стабільність системи.[1],[3]

Безперервному культивуванню завжди передує періодичне культивування, у процесі якого за рахунок надлишку субстрату накопичується біомаса. Безперервне культивування необхідно розпочинати в той момент, коли в періодичному режимі культура досягає експоненційної фази. Це забезпечує зменшення коливань, спричинених подачею середовища, і виключається вимивання культури, пов'язане з наявністю laq-фази.

Ріст культури у ферментері відбувається за експоненційним законом.

Швидкість приросту біомаси визначається рівнянням: X= , тобто щільність бактеріальної суспензії росте експоненційно : X= Xo?e??.

Швидкість зміни щільності бактеріальної суспензії визначається як

Де D - швидкість розбавлення культури, год ??: , де F - швидкість протікання середовища, мл/хв.; V - обґєм культиватора.

Якщо м =D, то втрати внаслідок вимивання клітин і приріст біомаси врівноважують одне одного, тобто зміни дорівнюють нулю, а щільність бактеріальної суспензії Х залишається постійною. Культура при цьому перебуває в стані «динамічної рівноваги». Експоненційне збільшення кількості клітин компенсується експоненційним його зменшенням.[10]

Стабільність динамічної рівноваги культури в хемомтаті базується на обмеженні швидкості росту кількістю субстрату. Хемостат є саморегулюючою, простою в роботі системою. Якщо швидкість протікання середовища протягом тривалого часу залишається постійною, то регуляція роботи хемостату здійснюється автоматично. [10]

Турбідостат (рис.9) - це найпростіша з усіх систем безперервного культивування . Принцип роботи турбідостату базується на підтриманні постійної щільності бактеріальної суспензії або постійної мутності. На відміну від хемостату концентрацію біомаси в турбідостаті обирає оператор, а швидкість розведення і відповідно, концентрація субстратів підтримується таким чином, щоб зберігався заданий рівень біомаси. Звидси витікає, що за відсутності потреби в лімітуванні кількості субстрату він додається з надлишком. [10]

Щільність біомаси контролюється фотоелементом, зґєднаним з реле, що регулює подачу середовища. Якщо щільність біомаси досягає заданого рівня, спрацьовує реле, у культиватор надходить свіжа порція поживного середовища, що супроводжується зменшенням концентрації клітин до певного рівня, і автоматично відключається подача середовища. [12]

Термін «турбідостат» відноситься до будь-якого методу, в якому щільність клітин підтримується на одному рівні. Він об'єднує методи, засновані на змінах метаболізму, які вимірюються за допомогою «рН - стану» чи «СО? стану». Оскільки основні метаболічні функції (поглинання кисню, виділення СО?, зміни рН та ін.) повґязані зі швидкістю росту клітин і кінцевому результаті - з питомою швидкістю росту культури, їх можна використовувати як показникові перемінні при регулюванні потоку середовища.[12]

Заключення

Завдяки культивуванню можливості дослідження й діагностики розширюються практично безмежно, тому що є можливість оцінки не тільки морфологічних і біохімічних змін, але також змін у поводженні кліток, їхніх реакцій на різні агенти, у тому числі на лікарські впливи.

Стерилізація потрібна для знищення усіх форм життя як на поверхні: так і усередині стерилізованих об'єктів. Стерилізують живильні середовища, посуд , інструменти. Проводять підготовку середовищ до стерилізації; тиндалізацію; Також проводять стерилізацію газоподібними речовинами та опроміненням.

Культивування для виділення мікроорганізмів: це методи одержання чистих культур; виділення чистої культури на чашки Петрі; метод накопичувальних культур.

Середовища класифікують по консистенції, складу, походженням, призначенням та забрудненості матеріалу.При класифікації поживних середовищ по консистенції поживні середовища поділяють на щільні (тверді), напіврідкі і рідкі.При класифікації поживних середовищ за складом виділяють білкові, безбілкові і мінеральні середовища.

Середовища поділяються на природні й штучні. Як природні використовують згорнуту сироватку, молоко, яйця, мґязову тканину. Штучні середовища створюють шляхом комбінування різноманітних субстратів, що забезпечують ті чи інші потреби мікроорганізмів.

Залежно від потреб бактеріологів існуючі живильні середовища поділяються на 4 основні групи.

Перша група - універсальні (прості) середовища. До них належать прості середовища: мґясо-пептонний бульйон (МПБ) та мґясо-пептонний агар (МПА). За своїм складом, наявністю живильних речовин вони придатні для культивування багатьох видів бактерій.

Друга група - спеціальні середовища. Вони використовуються в тих випадках, коли мікроорганізми не ростуть на простих. До них належить кровґяний, сироватковий агари, сироватковий бульйон, асцитичний бульйон та асцит-агар.

Третя група - елективні середовища. Їх використовують для цілеспрямованого виділення та накопичення бактерій з матеріалу, який містить багато сторонніх мікробів. Створюючи такі середовища, враховують біологічні особливості бактерій певного виду, які відрізняють їх від інших. Додавання антибіотиків до складу живильних середовищ робить їх елективними відносно антибіотикостійких штамів.

Четверта група - диференціально-діагностичні середовища. Це велика група середовищ, які дозволяють визначити певні біохімічні властивості мікроорганізмів і проводити їх первинну диференціацію. Вони поділяються на середовища для визначення протеолітичних, пептолітичних, цукролітичних, гемолітичних, ліполітичних, редукуючих властивостей тощо.

На поверхні щільного поживного середовища мікрорганізми можуть утворювати суцільний, густий ріст або ізольовані колонії. Як правило, кожна колонія формується з нащадків однієї мікробної клітини (клон), тому їх склад досить однорідний. Утворення її є проявом культуральних властивостей бактерій.

Перелік посилань

1.Воробьев А. А. Микробиология и иммунология. М., 1999. - 131с.

2.За ред. Вікерчук Мікробіологія з основами вірусології - К., 2003. - 213с.

3. Герхардт Ф. Методы общей бактериологии. Т. 1,2,3. М., 2001. - 146с.

4. Г. Шлегель «Загальна мікробіологія» М. «Мир» 2005. - 111с.

5.Е.З. Теппер та ін «Практикум з мікробіології «М.» Колос «2004. - 99с.

6. Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология. Т.1,2,3. М., 1982.

201с.

7. Загальна біологія. Підручник. - К., 2002. - 303с.

8. Лурия С. Общая вирусология. М., 2006. Кочемасова 3. Н.

Микробиология. М., 1984. - 184с.

9. ЛабинскаяА. С. Микробиология с техникой микробиологических

исследований. М., 1999. -67-76с.

10. Мельников И. К. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции.

Методические указания, М., 2005. - 195с.

11. Руководство до практичних занять по мікробіології Н.С.Єгорова

1995р.- 29-55с., 58-65с.

12. Мікробіологія.: Підручник. - К.: Видавничо-поліграфічний центр

«Київський університет», 2005. 142- 144с.

13. Санітарна мікробіологія: Навч. Посібник/ А.І. Вінников; Н.В.Черевач;

Т.М. Полішко; О.В.Крисенко; Т.В.Скляр.- Д.: Вид-во ДНУ 2006р.

134с.

14. Биотехнология: Фундаментальные и промышленные аспекты/ А.И.

Божков г. Харьков /2008 - 113-125с.

Размещено на Allbest.ru