Молекулярно-генетичний поліморфізм російського осетра Азовського моря за RAPD-маркерами

Размещено на http://www.allbest.ru/

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНИЙ ПОЛІМОРФІЗМ РОСІЙСЬКОГО ОСЕТРА АЗОВСЬКОГО МОРЯ ЗА RAPD-МАРКЕРАМИ

Л.В. Шостак

Т.М. Димань

Вступ

Російський осетер (Acipenser gueldenstaedtii Brandt, 1833) - один із найцінніших промислових видів риб Азовського моря. Нині цей унікальний вид перебуває на межі повного зникнення головним чином внаслідок браконьєрського вилову та зарегулювання водних систем Дону та Кубані.

Нині раціональне використання водних живих ресурсів, їх відтворення та збереження неможливе без застосування сучасних методів аналізу генетичного поліморфізму, таких як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). З великої кількості існуючих модифікацій цього методу на особливу увагу заслуговують методи мультилокусного ДНК-профілювання завдяки своїй простоті, високій чутливості та швидкості проведення досліджень. Існує декілька модифікацій цього підходу, які різняться кількістю одержуваних продуктів ампліфікації, довжиною праймерів, умовами проведення ПЛР і методами електрофоретичного розподілення продуктів ампліфікації: RAPD-PCR [1], ISSR-PCR [2] та ін. Зазначені методи можуть слугувати експрес-методами виявляння генетичного 2 поліморфізму, що особливо актуально для мало вивчених таксономічних груп. Варто також відмітити важливі переваги ПЛР-аналізу перед іншими підходами дослідження генетичної мінливості: одночасний аналіз багатьох геномних локусів, можливість зажиттєвого проведення експертизи, швидкість реакції ампліфікації та ін.

Метою роботи було дослідження інформативності маркерів RAPD-PCR для вивчення молекулярно-генетичного поліморфізму російського осетра Азовського моря.

Методика досліджень. Матеріалом для досліджень служили зафіксовані у етанолі плавці російського осетра. 46 зразків цього біологічного матеріалу було відібрано зажиттєво співробітниками ДП АзПівденШРО впродовж 2007-2008 pp. у акваторії Азовського моря. Виділення геномної ДНК проводили за методикою сорбції ДНК на силіцій оксиді [3] з власними модифікаціями.

ПЛР проводили на ампліфікаторі “Терцик” за таким температурним режимом: початкова денатурація - 4 хв. за температури 94°С; 34-38 циклів: 45 с за 94 °С, 45 с за 36 °С, 2 хв. За 72 °С; термінальна елонгація - 5 хв. за 72°С.

Реакційна суміш об'ємом 20 мкл містила: 67 мМ Tris-HCl (pH 8,8), 17 мМ (NH4)2S0 , 0,01% Tween-20, 0,2 мМ dNTP, 1 од. Tag-полімерази, 30-70 нг геномної ДНК, 1,5-2,0 мМ MgCl та 0,2-0,4 мкМ відповідного праймера. У роботі було використано 20 RAPD-праймерів (Орегоп, США).

Електрофоретичне розділення продуктів ампліфікації проводили у 2%-ному агарозному гелі за використання ІхТВЕбуферу. Після закінчення електрофорезу гель обробляли бромистим етидієм (0,5 мкг/мл) і фотографували за допомогою відеосистеми GelDoc XR System (BioRad). Молекулярну масу ПЛР-продуктів визначали за маркером GeneRuler 100 bp (Fermentas). Визначення генетичних дистанцій проводили за використання комп'ютерної програми MEGA 4 [4].

осетр маркер генетичний поліморфізм

Результати досліджень

На першому етапі роботи було проведено скрінінг 20 декануклеотидних RAPD-праймерів довільної послідовності. Задовільні первинні спектри ампліфікації було одержано лише для п'яти праймерів - ОРА-05, ОРА-07, ОРА-10, ОРА-11 та ОРН-07, які й було використано у подальшій роботі. Спектри ампліфікації з іншими олігонуклеотидами характеризувалися значною переампліфікацією (відсутність дискретних смуг за електрофоретичного розподілення у агарозному гелі), недостатньою кількістю ПЛР-смуг або слабкими за інтенсивністю світіння бендами. Оптимізація умов проведення ПЛР для цих праймерів (підвищення температури відпалу, зміна концентрації компонентів реакційної суміші) не сприяла поліпшенню якості спектрів.

Варто зазначити, що отримання чітких, інформативних спектрів вимагало індивідуальної роботи з кожним окремим праймером. Проведені дослідження уможливили виявлення чинників, які найбільшою мірою впливали на якість спектрів продуктів ампліфікації: концентрація хлориду магнію, концентрація препарату ДНК, концентрація праймера у реакційній суміші та кількість циклів ампліфікації. Враховуючи їх, для кожного з використаних праймерів було визначено оптимальні умови проведення ПЛР (табл.1).

Таблиця 1

Результати експериментального підбору умов проведення ПЛР для праймерів ОРА-05, ОРА-07, ОРА-10, ОРА-11 та ОРН-07

З огляду на те, що RAPD-метод є чутливим до змін реакційної суміші та алгоритму її приготування, було застосовано “жорсткі” умови ампліфікації. Насамперед це стосувалось концентрації хлориду магнію та олігонуклеотидних праймерів. Зміни концентрації ДНК-матриці та кількості циклів ампліфікації виявилися менш принциповими для відтворення продуктів ампліфікації, але поліпшували як загальну якість спектрів, так і окремих смуг.

Сумарно за використання 5 RAPD-праймерів було отримано 90 продуктів ампліфікації, 41 (45,55%) з яких виявилися поліморфними у досліджених генотипів (табл.2). Найвищій рівень поліморфізму спостерігали за використання праймера ОРН-07 - 62%. Найбільшу кількість локусів для цього типу маркерів було також отримано за ампліфікації ДНК російського осетра з праймером ОРН-07 (26 продуктів ампліфікації) (рис.), найменшу - з праймером ОРА-11 (14 ампліконів). Значення середньої кількості локусів на особину у досліджених осетрів Азовського моря для всіх праймерів склало 13,3.

Таблиця 2

Характеристика RAPD-спектрів російського осетра

Розподіл RAPD-ампліконів досліджених особин російського осетра за молекулярною масою мав певні особливості. Загалом молекулярна маса продуктів ПЛР склала 3600-300 п.о. У досліджених зразках переважали амплікони з малою молекулярною масою. Зокрема, амплікони розміром до 1000 п.о. склали близько 57% від загальної кількості, а продукти ПЛР розміром 1000-2000 п.о. - 25%. Менше інших у спектрах зустрічалися амплікони розміром більш як 2000 п.о., їх частка склала 18%.

Отримані поліморфні спектри було використано для визначення генетичних дистанцій між дослідженими осетрами за використання комп'ютерної програми MEGA 4. Загалом генетичні дистанції були порівняно невеликими (dm=0,0346±0,0012), але достатніми для дискримінації досліджених генотипів.

Рис. Електрофоретичне розділення продуктів ампліфікації RAPD-PCR з праймером ОР -07: М - маркер молекулярної маси, 1-20 - зразки російського осетра.

Таким чином, нами було визначено поліморфні молекулярно-генетичні RAPD-маркери і досліджено інформативність спектрів ампліфікації за генетичного аналізу російського осетра Азовського моря. Отримані результати буде використано для комплексної оцінки генетичної різноманітності азовської популяції з метою збереження і відтворення цінних аборигених генотипів російського осетра.

Література

1. Williams J.G. DNA polymorphisms amplied by arbitrary primers are useful as genetic markers / J. G. Williams, A. R. Kubelik, K. J. Livak [et al.] // Nucleic Acid Res. -- 1990. -- V. 18. -- P. 6531--6535.

2. Godwin I.D. Application of inter simple sequence repeat (ISSR) markers to plant genetics / I.D. Godwin, E.A. Aitken, L.W. Smith // Electrophoresis. -- 1997. -- V.18. -- P. 1524--1528.

3. Дубін О.В. Інформативність маркерів ISSR-PCR у дослідженні геномів рослин і тварин / О.В. Дубін, Т.М. Димань // Аграрні вісті. -- 2008. -- № 2. -- С. 7--9.

4. Tamura K. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. / K. Tamura, J. Dudley, M. Nei // Мої. Biol. Evol. -- 2007. --Vol. 24. -- P. 1596--1599.

Размещено на Allbest.ru