Вплив катіонів лужноземельних і перехідних металів на функціонування мітохондрій печінки щурів

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата бiологiчних наук

ВПЛИВ КАТІОНІВ ЛУЖНОЗЕМЕЛЬНИХ І ПЕРЕХІДНИХ МЕТАЛІВ НА ФУНКЦІОНУВАННЯ МІТОХОНДРІЙ ПЕЧІНКИ ЩУРІВ

03.00.02 - біофізика

ВОВКАНИЧ ЛЮБОМИР СТЕПАНОВИЧ

УДК 612.014.46:577.352.4

Київ-1999

Дисертацiєю є рукопис.

Робота виконана у Львiвському державному унiверситетi

iменi Івана Франка Мiнiстерства Освiти України.

Науковий керiвник: кандидат бiологiчних наук, доцент

ДУБИЦЬКИЙ Леонiд Олександрович

Львiвський державний унiверситет iменi Івана Франка,

доцент кафедри фiзiологiї людини i тварин

Офiцiйнi опоненти: доктор біологічних наук, ст. наук. співробітник

КОСТЕРІН Сергій Олексійович

зав. відділу Інституту біохімії

ім. О.В.Палладіна НАН України

доктор біологічних наук, професор

БЕРЕЗОВСЬКИЙ Вадим Якимович

зав. відділу Інституту фізіології

ім. О.О.Богомольця НАН України

Провiдна установа: Національний медичний університет імені О.О.Богомольця МОЗ України, м. Київ

Захист вiдбудеться "22" версня 1999 р. о 16 год. на засiданнi спецiалiзованої вченої ради Д 26.001.38 при Київському університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 252033, м. Київ, вул. Володимирська 64, біологічний факультет Київського університету імені Тараса Шевченка, кімната 215.

З дисертацiєю можна ознайомитись у бiблiотецi Київського університету імені Тараса Шевченка за адресою: 252033, м. Київ, вул Володимирська, 58.

Автореферат розiсланий "21" серпня 1999 р.

Вчений секретар спецiалiзованої

вченої ради, кандидат біологічних наук Т.Л.Давидовська

АНОТАЦІЯ

ВОВКАНИЧ Л.С. Вплив катiонiв лужноземельних i перехiдних металiв на функцiонування мiтохондрiй печiнки щурiв. - Рукопис.

Дисертацiя на здобуття наукового ступеня кандидата бiологiчних наук за спецiальнiстю 03.00.02 - біофізика. - Київський університет імені Тараса Шевченка, Київ, 1999.

Дисертацію присвячено вивченню механізмів дії катіонів металів (КМ), зокрема Ca2+, Sr2+, Mn2+, Cd2+ і La3+, на дихання, ADP-фосфорилюючу і Са2+-акумулюючу функції мітохондрій (МХ) печінки, та на стан неспецифічної проникності їх внутрішньої мембрани. Встановлено, що МХ здатні до енергозалежної акумуляції КМ, швидкість якої визначається ентальпією гідратації КМ та їх спорідненістю до СОО- груп Са2+-уніпортера МХ. Пригнічення КМ процесів окислення субстратів та окисного фосфорилювання у МХ корелює з константами стійкості комплексів цих металів з SH- групами цистеїну. КМ інгібують транспорт Са2+ у МХ за конкурентним (Sr2+, Mn2+, La3+) та змішаним типом (Cd2+). Вираженість інгібування визначається ентальпією гідратації КМ та їх спорідненістю до СОО- груп Са2+-уніпортера. Ca2+ і Cd2+, на відміну від Sr2+, Mn2+ та La2+, індукують збільшення неспецифічної проникності мембрани МХ. Sr2+ і Mn2+ здатні конкурентно пригнічувати цей процес. Отже, здатність КМ взаємодіяти з різними функціональними системами МХ неодинакова і визначається їх фізико-хімічними властивостями, зокрема ентальпією гідратації та спорідненістю до кисне- і сірковмісних груп біолігандів, що може бути використане для направленого пошуку антидотів до різних металів.

Ключові слова: мітохондрії печінки, катіони металів, дихання, окисне фосфорилювання, поглинання кальцію, неспецифічна проникність мембрани.

АННОТАЦИЯ

катіон метал печінка гідратація

ВОВКАНЫЧ Л.С. Влияние катионов щелочноземельных и переходных металлов на функционирование митохондрий печени крыс. - Рукопись.

Диссертация на соискание учной степени кандидата биологических наук

по специальности 03.00.02 - биофизика. - Киевский университет имени Тараса Шевченко, Киев, 1999.

Диссертация посвящена изучению механизмов влияния катионов металлов (КМ), в частности Ca2+, Sr2+, Mn2+, Cd2+, La3+, на дыхание, ADP-фосфорилирующую и Са2+-аккумулирующую функции митохондрий (МХ) печени, а также на состояние неспецифической проницаемости их внутренней мембраны.

Установлено, что МХ обладают способностью к энергозависимой аккумуляции КМ, которая сопровождается активацией дыхания МХ и выходом Н+ из этих органелл. Стимулирующий эффект КМ на дыхание МХ (Vmax, нмоль О2/мин.мг белка) уменьшается в следующем порядке: Сa2+ (35,71) > Sr2+ (33,90) > Cd2+ (26,32) > Mn2+ (22,02) >> La3+ (9,04). Полученный ряд тесно коррелирует с энтальпией гидратации КМ (r = -0,95) и костантами устойчивости их комплексов с ацетатом (r = -0,90) и аспарагиновой кислотой (r = -0,84). Следовательно, скорость энергозависимой аккумуляции КМ в МХ печени определяется энтальпией их гидратации и сродством к СОО- группам Са2+-унипортера МХ.

Выявленный нами ингибирующий эффект КМ на протонофор-стимулированное дыхание МХ увеличивается в ряду Са2+, Sr2+, Mn2+ (не влияют) < La3+ < Cd2+ . Аналогичный ряд образуют КМ по их ингибирующему влиянию на ADP-стимулированное дыхание МХ: Са2+, Sr2+ (не влияют) < Mn2+ < La3+ < Cd2+. Оба ряда тесно коррелируют (r = 0,93-0,99) с константами устойчивости комплексов КМ с SH- группами цистеина. Таким образом, угнетение КМ процессов окисления субстратов и окислительного фосфорилирования в МХ определяется их сродством к SH- группам макромолекул МХ.

КМ ингибируют транспорт Са2+ в МХ по конкурентному (Sr2+, Mn2+) или смешанному (Cd2+) типу. Ингибиторные константы (Кi , мкМ) транспорта Са2+ в МХ для КМ возрастают в ряду: La3+ (2,11), Cd2+ (10,36), Mn2+ (49,29), Sr2+ (66,43). Полученный ряд характеризуется тесной корреляцией с энтальпией гидратации КМ (r = -0,78) и константами устойчивости их комплексов с ацетатом (r = -0,96) и аспарагиновой кислотой (r = -0,91). Следовательно, в механизме транспорта Са2+ в матрикс МХ и его ингибировании катионами других металлов важное место занимает их дегидратация и взаимодействие с карбоксильными группами Са2+-унипортера.

Катионы Ca2+ и Cd2+, в отличие от Sr2+, Mn2+ и La3+, индуцируют переход внутренней мембраны МХ в состояние повышенной неспецифической проницаемости. Катионы Sr2+ и Mn2+ способны конкурентно угнетать этот процесс. Вместе с тем особенности кинетики Са2+- и Cd2+-индуцированного набухания МХ указывают на различие в механизмах индуцирования ими перехода внутренней мембраны МХ в состояние повышенной неспецифической проницаемости, что, вероятно, обусловлено их неодинаковым сродством к СОО- и SH-группам макромолекул мембраны МХ.

Следовательно, способность КМ взаимодействовать с различными функциональными системами МХ неодинакова и определяется их физико-химическими свойствами, в частности энтальпией гидратации и сродством к кислород- и серосодержащим группам биолигандов. Это может быть использовано для направленного поиска антидотов к катионам разных металлов.

Ключевые слова: митохондрии печени, катионы металлов, дыхание, окислительное фосфорилирование, поглощение кальция, неспецифическая проницаемость мембраны.

SUMMARY

VOVKANYCH L.S. Effect of earthy and transient metals` cations on the functioning of rat liver mitochondria. - Manuscript.

Thesis for scientific degree of the candidate of biological sciences by

speciality 03.00.02 - Biophysics. - The Taras Shevchenko Kyiv University, Kyiv, 1999.

The thesis are devoted to the investigation of the mechanisms of metals` cations (MC), including Ca2+, Sr2+, Mn2+, Cd2+, La3+, effect on the rat liver mitochondria (RLM) respiration, ADP-phosphorylation, Ca2+-accumulation and unspecific permeability of the RLM inner membrane. It has been shown, that RLM could accumulate MC in the energy-dependent process, velocity of which depends on their affinity to COO- groups of the RLM Ca2+-uniporter. Inhibition of the RLM substrate oxidation and oxidative phosphorylation by MC is correlated with the stability constants of MC with SH- groups of cysteine. MC inhibit RLM Ca2+ uptake in competitive (Sr2+, Mn2+ , La3+) and mixed (Cd2+) manner. The power of inhibition is determined by the MC hydratation enthalpy and their affinity to COO- groups of Ca2+-uniporter. Са2+ and Cd2+, but not Sr2+, Mn2+, La3+, induce RLM inner membrane unspecific permeability transition. Sr2+ and Mn2+ are competitive inhibitors of that process. Hence, ability of the MC to interact with the different RLM functional systems is uniqual and is determined by their physicochemical properties, especially by their hydratation enthalpy and affinity to oxygen- and sulphur-containing groups of bioligands. It could be used for the direct search of antidotes to different metals` cations.

Key words: liver mitochondria, metals` cations, respiration, oxidative phosphorylation, calcium uptake, unspecific permeability of membrane.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальнiсть теми. Дослiдження закономiрностей функцiонування клiтин органiзму в екстремальних умовах, у тому числi пiд впливом антропогенних факторiв, є одним iз прiоритетних напрямкiв сучасної бiологiї. Серед таких факторiв одне з перших мiсць займають катіони металiв, якi характеризуються широким спектром патогенного впливу на органiзм людини i тварин. Вони впливають на активнiсть ряду ферментiв (Левина, 1972, Ершов, Плетнева, 1989), стан клiтинних мембран (Уильямс, 1978, Venugopal, Luckey, 1978, Evans, 1990), виступають антагонiстами кальцiю в клiтинi (Клевець, Манько, 1992, Дубицький, Сабадаш, 1995, Пономарев, 1980). Це суттєво вiдбивається на функцiональнiй активностi клiтин та їх органоїдiв, зокрема мiтохондрiй (МХ), якi здатнi накопичувати ряд металiв при iнтоксикацiї ними в умовах in vivo (Probst, 1979, Korck, 1986). Порушення функцiонування МХ, якi займають важливе мiсце у забезпеченнi енергетичних потреб (Gunter et. al., 1994) i кальцiєвого гомеостазу (Gunter, Pfeiffer, 1990) клiтин, може бути одним з механiзмiв, за яким реалiзується токсичний ефект металiв. Проте бiльшiсть дослiджень впливу катiонiв металiв на функцiонування МХ носять фрагментарний характер i в основному пов'язанi iз вивченням кальцiйтранспортних функцiй цих органел. Практично вiдсутнi роботи, присвяченi комплекснiй оцiнцi порушень основних функцiй МХ пiд впливом катiонiв металiв. Слабо дослiдженим залишається також питання залежностi ефектiв металiв на функції МХ вiд їх фiзико-хiмiчних властивостей, зокрема вiд спорiдненостi до рiзних бiолiгандiв. Вiдсутнiсть достатньої бази даних у цьому напрямку обмежує можливості розробки методiв пiдвищення стiйкостi органiзмiв до цих факторiв, та методiв терапiї iнтоксикацiй, викликаних солями металiв.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота виконана в рамках науково-дослiдних тем "Вивчення клiтинних механiзмiв порушень секреторної функцiї шлункових залоз катiонами металiв" (№ держреєстрацiї 0194 V 015656), "Дослiдження механiзмiв дiї катiонiв перехiдних металiв на секреторну функцiю клiтин травних залоз" (№ держреєстрацi 0195 V 006596), "Вияснення механiзмiв функцiонування Na-Ca обмiну мебрани секреторних клiтин" (№ держреєстрацiї 1096 V 002178) та Дослідження Na-залежного транспорту кальцію через мембрани секреторних клітин у прямому і зворотному напрямах та ролі у ньому функціональних груп протеїну обмінника (№ держреєстрації 0198 V 004853).

Мета i задачі дослiдження. Вивчити первинні механiзми дiї катiонiв металiв з рiзними фiзико-хiмiчними властивостями (Ca2+, Sr2+, Mn2+, Cd2+, La3+) на функцiонування МХ печiнки щурiв. Ця мета досягалась вирiшенням таких основних завдань: 1) з'ясувати механiзми впливу катiонiв металiв на дихання МХ та транслокацiю протонiв через мембрану цих органел; 2) дослiдити вплив металiв на протонофор-стимульоване дихання МХ та фосфорилювання ADP цими органелами; 3) вивчити механiзми впливу катiонiв металiв на Са2+-акумулюючу здатнiсть МХ; 4) вивчити вплив катiонiв металiв на стан проникностi внутрiшньої мембрани МХ печiнки та механiзми цього впливу; 5) з'ясувати залежнiсть ефектiв катiонiв металiв на функцiонування МХ вiд їх фiзико-хiмiчних властивостей.

Наукова новизна одержаних результатiв. Вперше проведено комплексне дослiдження змiн функцiонального стану МХ печiнки пiд впливом катiонiв ряду металiв з рiзними фiзико-хiмiчними властивостями (Ca2+, Sr2+, Mn2+, Cd2+, La3+). У процесi дослiджень отримано такi новi данi: 1) здатнiсть катiонiв металiв стимулювати дихання МХ обумовлена їх енергозалежним транспортом у матрикс цих органел i характеризується оберненою кореляцією з ентальпiєю їх гiдратацiї та спорiдненiстю до карбоксильних груп Са2+-унiпортера МХ; 2) вплив катiонiв рiзних груп металiв на дихання МХ не залежить вiд субстрату окислення; 3) здатнiсть катiонiв металiв пригнiчувати протонофор-стимульоване дихання МХ та фосфорилювання ADP цими органелами корелює з їх спорiдненiстю до SH-груп біолігандів; 4) катiони металів з високою спорiдненiстю до кисневмiсних лiгандiв (Mn2+ i iн.) iнгiбують транспорт Са2+ у МХ за конкурентним типом, а катiони металів з високою спорiдненiстю до сiрковмiсних лiгандiв (Cd2+) - за змiшаним типом; 5) здатнiсть катiонiв металiв iнгiбувати транспорт Са2+ в МХ характеризується оберненою кореляцією з ентальпiєю їх гiдратацiї та спорiдненiстю до карбоксильних груп Са2+-унiпортера; 6) катiони Са2+ i Cd2+ iндукують перехiд внутрiшньої мембрани МХ у стан високої неспецифiчної проникностi за рiзними механiзмами, проте шляхом формування одних i тих же пор; 7) катiони Sr2+ i Mn2+ пригнiчують Са2+-iндукованi змiни проникностi внутрiшньої мембрани МХ за конкурентним типом.

Практичне значення одержаних результатiв. Отриманi результати поглиблюють i уточнюють знання про механiзми впливу катіонів металiв iз рiзними фiзико-хiмiчними властивостями на функцiонування МХ. Вони розширюють базу даних, необхiдних для розробки методiв пiдвищення стiйкостi органiзмiв до iнтоксикацiй катiонами металiв, а також для направленого пошуку антидотів до катіонів металів з різною спорідненістю до кисне- і сірковмісних груп лігандів клітини, що має важливе значення для України у зв'язку з високим техногенним забрудненням ряду її регiонiв. Результати використовуються при викладаннi загального курсу "Фiзiологiя людини i тварин", та спецкурсiв "Фiзiологiя мiнерального обмiну" i "Бiоенергетичнi основи фiзiологiчних процесiв" у Львiвському державному унiверситетi iменi Івана Франка, а також загального курсу "Нормальна фiзiологiя" у Львiвському державному медичному унiверситетi. Вони можуть бути використанi для пiдготовки спецiалiстiв медико-бiологiчного профiлю в iнших учбових закладах України.

Особистий внесок здобувача полягає у виконаннi всього обсягу експериментальної частини дисертацiї, статистичнiй обробцi результатiв, пiдборi i опрацюваннi даних лiтератури, а також, за участю наукового керiвника та співавторів, у аналiзi та iнтерпретацiї одержаних результатiв.

Апробацiя результатiв дисертації. Результати дослiджень, що включенi до дисертацiї, доповiдались на: 1-му з'їздi Українського бiофiзичного товариства (1994 р., Київ), XIV з'їздi Українського фiзiологiчного товариства iм. І.П. Павлова (1994 р., Київ), науково-практичному симпозiумi "Медико-бiологiчнi проблеми адаптацiї в сучасних умовах iснування органiзму" (1995 р., Кузнецовськ), конференцiї до 100-рiччя кафедри фiзiологiї Львiвського державного медичного унiверситету (1995 р., Львiв), щорiчних наукових конференцiях Львiвського унiверситету (1994-1998 р., Львiв), 9-тiй Європейськiй конференцiї з проблем бiоенергетики (1996 р., Ловейн-ла-Неув), 4-iй Європейськiй студентськiй науковiй конференцiї (1996 р., Гданськ), VII Українському бiохiмiчному з'їздi (1997 р., Київ), XV з'їздi Українського фiзiологiчного товариства (Донецьк, 1998 р.).

Публікації. Основнi положення дисертацiї висвiтленi у 11 публiкацiях, у тому числi у 3 статтях в наукових журналах та 8 тезах.

Структура дисертацiї. Дисертацiя складається з вступу, огляду лiтератури, опису об'єкта i методiв дослiджень, викладу отриманих результатiв та їх обговорення, висновкiв, списку використаних джерел (332 назви) і додатків. Робота викладена на 106 сторiнках основного тексту, мiстить 10 таблиць, 14 рисунків та додатки на двох сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

ОБ'ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослiдження механiзмiв дiї катiонiв металiв на функцiонування МХ проводили в умовах in vitro. Використовували хлориди металiв. МХ iзолювали з печiнки бiлих щурiв методом диференцiального центрифугування (Кондрашова, Григоренко, 1985). До складу середовища видiлення МХ входили (ммоль/л): сахароза - 300, трiс - 10 (рН 7,4, t 0oC). Дихання МХ вивчали полярографiчним методом з використанням закритого електрода Кларка та кисневимiрювального блоку ГФ-012 (НДІ бiол. дослiджень, Пущино, Росiя). Середовище iнкубацiї МХ мiстило (ммоль/л): сахароза - 150, KCl - 50, KH2PO4 - 1, трiс - 5, сукцинат - 0,35 (рН 7,4, t 26oC). Вихiд Н+ з МХ печiнки реєстрували рН-метричним методом з використанням електрода ЭСЛ-43-07 та унiверсального iонометра ЭВ-74. У цих дослiдженнях концентрацiю трiсу у середовищi iнкубацiї зменшували до 3 ммоль/л (рН 7,4, t 26oC).

Кальцiйакумулюючу функцiю МХ вивчали з використанням радiоактивного iзотопу 45Ca2+ (0,37 МБк/нмоль) у середовищi iнкубацiї iз зменшеною кiлькiстю KH2PO4 (0,1 ммоль/л). Поглинання 45Са2+ зупиняли внесенням у суспензiю МХ 25 мкл стоп-розчину (сахароза - 150 ммоль/л, KCl - 50 ммоль/л, трiс - 5 ммоль/л, LaCl3 - 20 ммоль/л, рН 7,4) iз наступним її швидким фiльтруванням через мембраннi фiльтри Synpor (0,45 мкм). Фiльтри промивали 5 мл середовища такого складу (ммоль/л): KCl - 150, трiс - 5, LaCl3 - 0,5 (рН 7,4). Радiоактивнiсь фiльтрiв вимiрювали на рiдинному сцинтиляцiйному лiчильнику Rackbeta-1219 з використанням сцинтиляцiйної рiдини ЖС-8.

Неспецифiчну проникнiсть мiтохондрiальної мембрани оцiнювали за набуханням МХ методом реєстрацiї свiтлопоглинання суспензiї цих органел (? = 520 нм) на спектрофотометрi Cary-210. У середовище видiлення МХ додатково вносили ЕГТА (1 ммоль/л) i альбумiн сироватки бика (1%, маса/об'єм). Середовище iнкубацiї МХ мiстило (ммоль/л): сахароза - 150, KCl - 50, KH2PO4 - 2, трiс - 5, сукцинат - 1 (pH 7,4, t 30оС). Вмiст бiлка в суспензiї МХ визначали за методом Лоурi (Lowry et. al., 1951) або бiуретовим методом (Bialey, 1967).

Отриманi результати обробляли статистично з використанням критерiю Стьюдента, а також методами кореляцiйного та регресiйного аналiзу.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Вплив катіонів лужноземельних i перехiдних металiв на дихання мiтохондрiй та транслокацію протонів через мітохондріальну мембрану.

Відомо (Saris, Akerman, 1980), що катіони Са2+, Sr2+, Ba2+ та Mn2+ викликають стимуляцiю дихання iзольованих МХ. Виявлений нами гiперболiчний характер (рис. 1) дозової залежностi ефектiв Са2+, Sr2+, Mn2+ та Cd2+ (50-400 мкмоль/л) на дихання МХ печінки дозволив визначити константу напiвнасичення (K0,5) та максимальну швидкiсть (Vmax) цього процесу методом лiнеаризацiї у системi обернених координат Лайнуiвера-Берка. Катiони La3+ (50-400 мкмоль/л) не впливали на дихання МХ, а за вiдсутностi у середовищi iнкубацiї екзогенних фосфатiв дещо пригнiчували його. Інгібіторну константу (Ki) у цьому випадку визначали у координатах Уеба. Встановлено, що значення Vmax метал-стимульованого дихання МХ спадає у такому порядку:

Катiони металiв: Сa2+ > Sr2+ > Cd2+ > Mn2+ >> La3+

Vmax, нмоль О2/хв*мг бiлка: 35,71 33,90 26,32 22,02 9,04

K0,5 для дослiджуваних металiв та Ki для La3+, якi характеризують чутливiсть МХ до катiонiв металiв утворюють такий ряд:

Катiони металiв: Cd2+ < Ca2+ << La3+ < Sr2+ < Mn2+

K0,5, Ki (La3+), мкмоль/л: 12,63 14,82 39,79 100,68 188,30

Вплив катiонiв металiв на швидкiсть дихання мітохондрій печiнки (V, нмоль О2/хвмг білка). а) Залежність швидкості дихання мітохондрій від концентрації катіонів металів ([Меn+], мкмоль/л) у суспензії цих органел (пунктирна лiнiя - у середовищi iнкубацiї вiдсутнiй екзогенний фосфат); б) вплив Ca2+, Sr2+, Mn2+ (100 мкмоль/л) та Cd2+ i La3+ (50 мкмоль/л) на швидкість дихання мiтохондрiй пiд час окислення ними сукцинату (0,35 ммоль/л, заштриховані стовпчики) i ?-кетоглутарату (1 ммоль/л, темні стовпчики).

За здатнiстю стимулювати дихання МХ катiони металiв утворюють аналогiчний ряд пiд час окислення ними сукцинату (0,35 ммоль/л) i ?- кетоглутарату (1 ммоль/л) (див. рис. 1). Це свiдчить, що вплив катiонiв металiв на дихання МХ мало залежить вiд субстрату окислення.

Вiдомо (Nicholls, Akerman, 1982), що енергозалежне поглинання Са2+ мiтохондрiями супроводжується виходом iз них Н+. Зокрема, нами виявлено, що поглинання 55,997,47 нмоль Са2+ МХ супроводжується виходом з цих органел 49,732,44 нмоль Н+. Встановлено також, що катiони усiх дослiджуваних металiв стимулюють вихiд Н+ з МХ печiнки (рис. 2), що у випадку Са2+, Sr2+ i Mn2+ підтверджується даними інших авторів (Saris, Akerman, 1980). Дозова залежнiсть швидкостi виходу Н+ з МХ для катiонiв Са2+, Sr2+ i Mn2+ (25-400 мкмоль/л) мала гiперболiчний, а для катiонiв Cd2+ i La3+ - куполоподiбний характер. В цiлому за здатнiстю стимулювати вихiд Н+ з МХ (Vmax, нмоль Н+/хв*мг бiлка) катiони металiв утворюють такий ряд:

Катiони металiв: Ca2+ > Sr2+ >> La3+ > Cd2+ > Mn2+

Vmax, нмоль Н+/хв*мг бiлка: 990,10 800,00 166,95 108,39 95,15

Отриманий ряд аналогiчний рядовi металiв, побудованому на основi їх здатностi до стимуляцiї дихання МХ, за винятком iонiв La3+, якi у цьому ряді змiщуються влiво.

Для з'ясування ролi транспорту катiонiв дослiджуваних металiв у матрикс МХ у реалiзацiї їх впливу на функцiонування цих органел нами була проведена серiя дослiдiв з використанням неконкурентного iнгiбiтора Са2+-

унiпортера мiтохондрiальної мембрани - рутенiю червоного. Показано, що рутенiй червоний (10 мкмоль/л) зменшує сумарний вихiд Н+ з МХ печiнки, який стимульовали катiонами Са2+, Sr2+ i Mn2+ (100 мкмоль/л), вiдповiдно на 97, 100 та 90% (P< 0,05). Проте рутенiй червоний не впливав на сумарний вихiд Н+ з МХ печiнки, який стимулювали катiонами Cd2+ i La3+ (50 мкмоль/л), хоча зменшував його швидкiсть на 65 i 43% (P< 0,05). Це свідчить, що стимуляцiя дихання МХ та виходу з них Н+ катiонами Ca2+, Sr2+, Mn2+ визначається їх транспортом в цi органели за участю Са2+-унiпортера. Куполоподiбний характер дозової залежностi ефектiв Cd2+ i La3+ на вихiд Н+ з МХ та неповне iнгiбування цього процесу рутенiєм червоним свiдчать, що він лише частково визначається їх транспортом у МХ через Са2+-унiпортер.

Таблиця 1 Кореляційний аналіз залежності кiнетичних параметрiв метал-стимульованого дихання мітохондрій вiд фiзико-хiмiчних властивостей iонiв металiв.

	Коефiцiєнт кореляцiї, r
Кiнетичнi параметри дихання мітохондрій	Іон. радiус, нм	?Но гiдр, ккал/моль	lgK1 метал-ацетат	lgK1 метал-Asp	lgК1 метал-Cys
Vmax, нмоль О2/ хв*мг бiлка	-0,25 p=0,35	-0,95 p>0,98	-0,90 p=0,96	-0,84 p=0,93	-0,20 p=0,28

Примiтка. р - вiрогiднiсть коефiцiєнта кореляцiї.

Ряд металiв, побудований на основi їх здатностi до стимуляцiї дихання МХ, характеризується тiсною оберненою кореляцiєю (табл. 1) з ентальпiєю гiдратацiї катiонiв металiв (r = -0,95), та константами стiйкостi їх комплексiв з ацетатом (r = -0,90) та аспарагiновою кислотою (r = -0,84). Це свiдчить про важливу роль дегiдратацiї катiонiв металiв та їх взаємодiї з карбоксильними групами Са2+-унiпортера пiд час їх енергозалежної транслокацiї в матрикс МХ.

Таким чином, МХ печінки здатні до енергозалежної акумуляції катіонів Ca2+, Sr2+, Mn2+ і Cd2+, швидкість якої визначається ентальпією гідратації катіонів металів та їх спорідненістю до СОО--груп Са2+-уніпортера МХ. Разом з тим, пригнічення дихання МХ іонами La3+ та куполоподібний характер дозової залежності ефектів Cd2+ і La3+ на вихід іонів Н+ з МХ печінки вказують на здатність цих металів взаємодіяти з іншими функціональними системами цих органел.

Вплив катiонiв перехiдних i лужноземельних металiв на протонофор-стимульоване дихання та ADP-фосфорилюючу здатність мітохондрій

Вiдомо, що швидкiсть дихання МХ, стимульованого протонофорами, зокрема n-трихлорметоксикарбонiлцiанiдфенiлгiдразоном (CCCP) та 2,4-динiтрофенолом (DNP), визначається iнтенсивнiстю процесiв окислення у дихальному ланцюгу цих органел. Нами встановлено, що CCCP (0,5 мкмоль/л) рiзко збiльшує швидкiсть дихання МХ (VCCCP) пiсля їх преiнкубацiї з іонами Са2+, Sr2+ та Mn2+ (100 мкмоль/л) (рис. 3). У цьому випадку VCCCP мало залежала вiд виду катiонiв металiв (P > 0,05) i становила 57,40?2,51- 58,20?1,15 нмоль О2/хв*мг бiлка. Інку-бацiя МХ з катiонами La3+ (50 мкмоль/л) супроводжувалась суттє-вим зниженням VCCCP до рiвня 28.95?1.28 нмоль О2/хв*мг бiлка (P < 0,001). Разом з тим CCCP (0,5 мкмоль/л), а також DNP (1 мкмоль/л) не впливали на швидкiсть дихання МХ пiсля їх взаємодiї з катiонами Сd2+ (50 мколь/л). Пригнiчення протонофорстимульованого дихання МХ пiд впливом iонiв Cd2+ i La3+ свiдчить про здатнiсть цих катiонiв iнгiбувати процеси мiтохондрiального окислення. Інгiбуючий ефект iонiв Cd2+ розвивається пiсля попередньої стимуляцiї дихання, обумовленої їх енергозалежною акумуляцiєю в МХ.

Порушення мiтохондрiального окислення пiд впливом катiонiв металiв (50-100 мкмоль/л) суттєво позначається на процесах окисного фосфорилювання у МХ.

Показано, що швидкiсть ADP-стимульованого дихання МХ (VADP, 200 мкмоль/л) пiсля їх преiнкубацiї з катiонами Сa2+ i Sr2+ суттєво не вiдрiзняється вiд VADP за вiдсутностi в середовищi iнкубацiї катiонiв металiв (34,66±0,33 нмоль О2/хв*мг бiлка) i становить вiдповiдно 32,63?1,95 i 32,36?1,87 нмоль О2/хв*мг бiлка (P > 0,05).

Преiнкубацiя МХ з катiонами Mn2+ та La3+ супроводжувалась зменшенням VADP вiдповiдно до 26,16?2,25 та 15,58?1,09 нмоль О2/хв*мг бiлка, тобто на 25 та 31% (P < 0,05). Інкубацiя МХ з катiонами Cd2+ призводила до повного пригнiчення ADP-стимульованого дихання цих органел. За здатнiстю пригнiчувати протонофор- та ADP-стимульоване дихання МХ катiони металiв утворюють такий ряд:

Катiони металiв: Са2+ , Sr2+ < Mn2+ < La3+ < Cd2+

Зменшення VCCCP, %: 0 1 0 50 100

Зменшення VADP, %: 6 7 25 31 100

Інгiбуючий ефект катiонiв металiв на VCCCP i VADP тiсно корелює (r = 0,93 - 0,99) з константами стiйкостi комплексiв цих металiв з SH-групами цистеїну (табл. 2). Таким чином, катіони досліджуваних металів, зокрема Cd2+,

La3+ і частково Mn2+ пригнічують процеси окислення і фосфорилювання в МХ печінки. Здатність катіонів металів пригнічувати процеси окислення і фосфорилювання в МХ визначається їх спорідненістю до сірковмісних лігандів цих органел.

Таблиця 2 Залежнiсть iнгiбуючих ефектiв катiонiв металiв на протонофор- та ADP-стимульоване дихання мітохондрій вiд їх фiзико-хiмiчних властивостей

Параметри	Коефiцiєнт кореляцiї, r
дихання мітохондрій	Іон. радiус, нм	?Но гiдр, ккал/моль	lgK1 метал-ацетат	lgK1 метал-Asp	lgК1 метал-Cys
Зменшення VCCCP, %	0,15 p=0,22	0,32 p=0,59	0,67 p=0,81	0,66 p=0,75	0,93 p=0,98
Зменшення VADP, %	-0,17 p=0,22	0,07 p=0,15	0,50 p=0,61	0,63 p=0,75	0,99 p>0,99

Примiтка. р - вiрогiднiсть коефiцiєнта кореляцiї.

Механiзми дiї катіонів лужноземельних і перехідних металiв на калцiйакумулючу функцiю мiтохондрiй

Вiдомо, що висока кальцiйакумулююча здатнiсть МХ має важливе значення у пiдтриманнi кальцiєвого гомеостазу клiтини (Gunter, Pfeiffer, 1990, Костерин, Бурдыга, 1993) та у регуляцiї функцiонування цих органел (McCormack et al., 1990). Встановлено, що катiони Sr2+ (20-200 мкмоль/л), Cd2+ i La3+ (2-50 мкмоль/л), внесенi у суспензiю МХ одночасно з катiонами Са2+ (30 мкмоль/л), пригнiчують поглинання iонiв Са2+ цими органелами (рис. 4).

Дозова залежнiсть ефектiв катiонiв Sr2+, Cd2+ i La3+ мала експоненцiальний характер. Катiони Mn2+ у концентрацiях 10-50 мкмоль/л також пригнiчували поглинання кальцiю мiтохондрiями печiнки. Проте збiльшення концентрацiї iонiв Mn2+ у суспензiї МХ в дiапазонi 50-200 мкмоль/л супроводжувалось зменшенням їх iнгiбуючого впливу на поглинання iонiв Са2+ мітохондріями. Подібний ефект був відмічений і іншими авторами (Hughes , Exton , 1983, Allshire et al., 1985) які виявили здатність іонів Mn2+ стимулювати поглинання Са2+ МХ печінки щурів та мозку морської свинки. Ймовiрно, iони Mn2+ у високих концентрацiях здатнi взаємодiяти з катiонзв'язуючими групами Са2+-унiпортера, що супроводжується модифiкацiєю його провiдностi.

Лінії дозової залежності інгібуючих ефектів катіонів Sr2+, Mn2+ та La3+ на поглинання Са2+ мітохондріями у координатах Уеба перетинають вісь ординат у точках, близьких до одиниці (рис. 5). Це вказує на конкурентний тип інгібування цими катіонами транспорту Са2+ у МХ. У випадку з іонами Cd2+ координати точки перетину отриманої лінії з віссю ординат значно відрізняються від одиниці, що свідчить про інший тип інгібування.

Кінетичний аналіз інгібуючого впливу катіонів металів на поглинання Са2+ мітохондріями печінки в системі координат Уеба (а) та Лайнуівера-Берка (б). а) 1/[Меn+] - обернені величини концентрації катіонів металів у суспензії мітохондрій, V0/(V0-Vi) - обернені величини частки неінгібованої швидкості поглинання Са2+ мітохондріями; б) 1/[Ca2+] - обернені значення концентрацій катіонів Са2+ у суспензії мітохондрій; 1/V - обернені значення швидкості поглинання кальцію мітохондріями.

Визначення типу iнгiбування катіонами Cd2+ транспорту Са2+ в МХ проводили графiчним методом у координатах Лайнуiвера-Берка. Для порівняння у цій системі координат був оцінений тип інгібування поглинання Са2+ мітохондріями катіонами Mn2+. Виявлене пiд впливом Mn2+ (50 мкмоль/л) збiльшення К0,5 поглинання Са2+ мiтохондрiями з 56,99 до 113,68 мкмоль/л та вiдсутнiсть суттєвих змiн Vmax цього процесу підтверджує конкурентний характер iнгiбування. Пiд впливом Cd2+ (10 мкмоль/л) К0,5 поглинання кальцiю МХ збiльшувалась з 56,99 до 67,37 мкмоль/л, а Vmax цього процесу зменшувалась з 913,79 до 532,50 нмоль Са2+/хв*мг бiлка, що вказує на змiшаний тип iнгiбування. Можливим механiзмом цього є виявлене нами пригнiчення пiд впливом iонiв Cd2+ процесiв окислення у дихальному ланцюгу МХ.

Порiвняння iнгiбуючого впливу катiонiв металiв на кальцiйакумулюючу здатнiсть МХ проводили на основi інгібіторних констант (Ki), якi визначали методом лiнеаризацiї експоненцiальних кривих доза-ефект в координатах Уеба (див. рис. 5). Для порівняльного аналізу була використана також Ki транспорту Са2+ в МХ іонами Ва2+, визначена К.Акерманом із співавторами (Akerman et al, 1977). Встановлено, що за зменшенням iнгiбуючого впливу на поглинання кальцiю мiтохондрiями (Кi, мкмоль/л) катiони металiв утворюють такий ряд:

Катiони металiв: La3+ < Cd2+ < Mn2+ < Sr2+ < Ba2+

Ki, мкмоль/л: 2,11 10,36 49,29 66,43 70,00

Отриманий ряд характеризується тiсною оберненою кореляцiєю (табл. 3) з ентальпiєю гiдратацiї (r = -0,78) iонiв металiв та константами стiйкостi їх комплексiв з карбоксильними групами ацетату (r = -0,96) та аспарагiнової кислоти (r = - 0,91). Це вказує на важливу роль процесiв дегiдратацiї катiонiв металiв та їх взаємодiї з карбоксильними групами Са2+-унiпортера у механiзмах транслокацiї Са2+ через мембрану МХ та у пригнiченні цього процесу катiонами металiв. На користь цього свідчить високий вміст (24%) дикарбонових амінокислот у складі Са2+-транспортного глікопротеїну МХ серця бика (Миронова, Утешева, 1989).

Таблиця 3 Залежнiсть iнгiбуючих ефектiв катiонiв металiв на поглинання Са2+ мiтохондрiями вiд фiзико-хiмiчних властивостей iонiв металiв.

Кiнетичнi параметри	Коефiцiєнт кореляцiї, r
iнгiбування поглинання Са2+ мітохондріями	Іон. радiус, нм	?Но гiдр, ккал/моль	lgK1 метал-ацетат	lgK1 метал-Asp	lgК1 метал-Cys
Ki поглинання Са2+, мкмоль/л	-0,26 p=0,35	-0,78 p=0,90	-0,96 p>0,98	-0,91 p=0,97	-0,72 p=0,83

Примiтка. р - вiрогiднiсть коефiцiєнта кореляцiї.

Таким чином, катіони металів інгібують транспорт Са2+ в МХ печінки за конкурентним (Sr2+, Mn2+, La3+) та змішаним (Cd2+) типом. Здатність катіонів металів інгібувати транспорт Са2+ в МХ визначається ентальпією їх гідратації та спорідненістю до карбоксильних груп Са2+-уніпортера цих органел.

Вплив катіонів лужноземельних і перехідних металiв на неспецифiчну проникнiсть внутрiшньої мембрани мiтохондрiй

Вiдомо (Zoratti , Szabo, 1995), що нагромадження кальцiю у МХ за певних умов призводить до переходу їх внутрiшньої мембрани у стан високої неспецифiчної проникностi (ВНП), набухання цих органел, що супроводжується втратою ними здатності до окисного фосфорилювання. Поряд з тим дані про вплив катіонів металів на стан проникності мембрани МХ, що може бути одним із механізмів реалізації їх впливу на функціонування цих органел, обмежені. Нами встановлено, що iндуковане Са2+ (30-100 мкмоль/л) набухання МХ включає фази повiльного (лаг-фаза) та швидкого набухання цих органел (рис. 6). Зменшення свiтлопоглинання суспензiї МХ, що свiдчить про їх набухання, досягало 0,1780,003 од. екст/мг білка (P < 0,001), а його швидкiсть - 0,099??0,008 од. екст./хв*мг бiлка. Катiони Cd2+ (15-50 мкмоль/л) також iндукували набухання МХ, яке, проте, характеризувалось вiдсутнiстю лаг-фази, меншою амплiтудою та тривалiстю процесу. Так, максимальна амплiтуда Cd2+-iндукованого набухання, досягала 0,097 0,002 од. екст/мг білка (P <0,05), а його швидкiсть - 0,148?0,006 од. екст./хв*мг бiлка. Катiони Sr2+ (50, 100 мкмоль/л), Mn2+ (50, 200 мкмоль/л) та La3+ (2, 50 мкмоль/л) на протязi 7-8 хв. не викликали суттєвих змiн свiтло-поглинання суспензiї МХ (P > 0,05). Очевидно, що катiони Sr2+, Mn2+ та La3+ у дослiджуваних концентрацiях не викликають переходу внутрiшньої мембрани МХ у стан ВНП.

Часова кiнетика впливу катiонiв металів (50 мкмоль/л) на свiтлопоглинання суспензiї мiтохондрiй (?E520, од. екст./мг білка).

Катiони Cd2+ у концентрацiях 15 i 50 мкмоль/л суттєво змiнювали кiнетику Са2+-iндукованого набухання МХ, наближаючи її до кiнетики власного впливу (табл. 4). Так, катiони Cd2+ (50 мкмоль/л) зменшували амплiтуду Са2+-iндукованого (30 мкмоль/л) набухання МХ з 0,178?0,003 до 0,076?0,005 од. екст./мг бiлка (P < 0,001), а також тривалiсть лаг-фази та загальну тривалiсть набухання. Вiдсутнiсть адитивностi ефектiв iонiв Ca2+ i Cd2+ на набухання МХ свiдчить, що їх вплив реалiзується через формування одних i тих же пор у мембранi цих органел. Проте особливостi кiнетики Са2+- i Сd2+-iндукованого набухання вказують на рiзнi механiзми iнiцiацiї формування цих пор, в основi чого може лежати неодинакова спорiдненiсть катiонiв цих металiв до карбоксильних i сульфгiдрильних груп бiолiгандiв.

Катiони Sr2+ i Mn2+ у концентрацiї 50-200 мкмоль/л суттєво пригнiчували Са2+-iндуковане набухання МХ (див. табл. 4). Інгiбуючий ефект катiонiв Sr2+ i Mn2+ збiльшувався iз зростанням їх концентрацiї у суспензiї МХ. Так, катiони Mn2+ у концентрацiї 50 мкмоль/л збiльшували тривалiсть лаг-фази Са2+- iндукованого (30 мкмоль/л) набухання МХ вiд 268,50±32,03 до 562,00±72,38 с (P < 0,01), а у концентрацiї 200 мкмоль/л повнiстю запобiгали розвитку цього процесу. Аналогiчнi, хоча i менш вираженi змiни, спостерiгались пiд впливом iонiв Sr2+. Інгiбуючий вплив катiонiв Sr2+ i Mn2+ на Са2+-iндуковане набухання МХ зменшувався iз збiльшенням концентрацiї Са2+ у середовищi iнкубацiї. Так, катiони Mn2+ у концентрацiї 100 мкмоль/л збiльшували тривалiсть лаг-фази набухання МХ, iндукованого Са2+ у концентрацiях 30 та 100 мкмоль/л, вiдповiдно на 110 (P < 0,01) та 32% (P < 0,05).

Таблиця 4 Вплив катiонiв металiв на Са2+-iндуковане набуханя мiтохондрiй печiнки (M??m, n = 4)

Концентрацiя катiонiв металів, мкмоль/л	Вiдноснi змiни об'єму мiтохондрій, ?Е520 од. екст./хв*мг бiлка	Вiдносна швидкiсть набухання мітохондрій, ?Е520 од. екст. /хв*мг бiлка	Загальна тривалiсть процесу, c	Тривалiсть лаг-фази, c
Ca2+,30	0,178±0,003	0,080±0,008	839,63 ±4,31	268,50±32,03
Ca2+,100	0,166±0,004	0,099±0,008	750,69±43,67	258,60±31,74
Cd2+,50	0,065±0,002	0,089±0,004	283,20±23,03	23,72±0,85
Ca2+,30 Cd2+,50	0,076±0,005 P1<0,001	0,111±0,011 P1>0,05	376,50±19,19 P1<0,001	28,20±2,24 P1<0,001
Ca2+,100 Cd2+,50	0,090±0,007 P1<0,001	0,107±0,013 P1>0,05	451,80±15,40 P1<0,001	31,00±1,00 P1<0,001
Ca2+,30 Sr2+,50	0,175±0,010 P1>0,05	0,038±0,004 P1<0,01	1069,80±49,80 P1<0,01	225,75±43,39 P1>0,05
Ca2+,30 Sr2+,100	0,159±0,016 P1>0,05 P2>0,05	0,032±0,001 P1<0,01 P2<0,05	1241,00±32,05 P1<0,01 P2<0,01	440,25±62,85 P1<0,01 P2<0,05
Ca2+,100 Sr2+,50	0,163±0,007 P1>0,05 P3>0,05	0,058±0,005 P1<0,01 P3<0,01	692,50±73,33 P1>0,05 P3<0,01	237,75±21,51 P1>0,05 P3>0,05
Ca2+,30 Mn2+,50	0,184±0,001 P1>0,05	0,099±0,017 P1>0,05	1115,00±32,79 P1<0,01	562,00±72,38 P1<0,01
Ca2+,30 Mn2+,200	0,008±0,001 P1<0,01 P2<0,01	Н а б у х а н н я в і д с у т н є
Ca2+,100 Mn2+,50	0,166±0,003 P1>0,05 P3<0,01	0,088±0,005 P1>0,05 P3>0,05	891,75±41,33 P1<0,05 P3<0,01	341,25±30,10 P1<0,05 P3<0,05

Примiтка. P1 - достовiрнiсть рiзницi показникiв Са2+-iндукованого набухання міто-хондрій у присутностi та за вiдсутностi у середовищi iонiв металiв; P2 - достовiрнiсть рiзницi показникiв Са2+-iндукованого (30 мкмоль/л) набухання мітохондрій у присутностi рiзних концентрацiй iонiв металiв; P3 - достовiрнiсть рiзницi показникiв набухання мітохондрій, iндукованого рiзними концентрацiями Са2+ (30 i 100 мкмоль/л) у присутностi iонiв металiв.

Аналогiчнi змiни спостерiгались пiд впливом Sr2+. Наведенi результати свiдчать про конкурентний характер пригнiчення Са2+-iндукованого збiльшення неспецифiчної проникностi мембрани МХ катiонами Sr2+ i Mn2+. В основi цього лежить, iмовiрно, пригнiчення цими катiонами акумуляцiї катiонiв Са2+ мiтохондрiями та їх взаємодiя з Са2+-зв'язуючими групами пороутворюючих бiлкiв мембрани МХ

Таким чином, катіони Са2+ і Cd2+ індукують перехід внутрішньої мембрани МХ у стан ВНП. Особливості кінетики Са2+- і Cd2+-індукованого набухання МХ свідчать про відмінність механізмів їх впливу на стан проникності мембрани цих органел, що, ймовірно, обумовлено їх неодинаковою спорідненістю до СОО- і SH-груп. Катіони Sr2+, Mn2+ i La3+ не індукують набухання МХ. Sr2+ і Mn2+ пригнічують Са2+-індуковані зміни проникності внутрішньої мембрани МХ за конкурентним типом.

В И С Н О В К И

1. Мітохондрії печінки здатні до енергозалежної акумуляції катіонів ряду лужноземельних (Ca2+, Sr2+) i перехiдних (Mn2+, Cd2+) металiв, що супроводжується стимуляцією їх дихання та виходом Н+ з цих органел. Катiони La3+ (50-400 мкмоль/л) не змінюють, а у відсутності екзогенного фосфату частково пригнічують швидкiсть дихання мітохондрій, хоча і стимулюють вихід Н+ з цих органел.

2. Здатність катіонів металів стимулювати дихання мітохондрій (Vmax), обумовлена їх транслокацiєю в матрикс цих органел, визначається ентальпiєю гiдратацiї катіонів металів та їх спорiдненiстю до карбоксильних груп Са2+-унiпортера мітохондріальної мембрани і спадає у такому ряді: Ca2+ > Sr2+ > Cd2+ > Mn2+ >> La3+.

3. Катіони Ca2+, Sr2+ i Mn2+ (100 мкмоль/л) не впливають, а катiони Cd2+ i La3+ (50 мкмоль/л) пригнiчують дихання мітохондрій, стимульоване протонофорами (СССР, 0,5 мкмоль/л; DNP, 10 мкмоль/л), що свiдчить про безпосереднє iнгiбування ними процесiв окислення в дихальному ланцюгу цих органел. В цiлому, здатнiсть катiонiв металiв пригнiчувати процеси окислення в дихальному ланцюгу мітохондрій збiльшується у такому порядку: Са2+, Sr2+, Mn2+ < La3+ < Cd2+.

4. Катiони Mn2+ (100 мкмоль/л), Cd2+ i La3+ (50 мкмоль/л) пригнiчують ADP-стимульоване дихання мітохондрій, а катіони Са2+ і Sr2+ (100 мкмоль/л) не впливають на цей процес. Здатнiсть iонiв металiв пригнiчувати ADP-стимульоване дихання мітохондрій зростає в ряді: Са2+, Sr2+ < Mn2+ < La3+ < Cd2+.

5. Здатнiсть катiонiв металiв пригнiчувати процеси окислення i фосфорилювання в мітохондрій визначається їх спорiдненiстю до SH- груп макромолекул дихального ланцюга цих органел.

6. Катіони Mn2+, Sr2+ i La3+ iнгiбують транспорт Са2+ у мітохондрії за конкурентним, а катiони Cd2+ - за змiшаним типом. Інгібіторна константа (Ki, мкмоль/л) транспорту Са2+ у мітохондрії для катiонів металiв збiльшувалась у такому порядку: La3+ < Cd2+ < Mn2+ < Sr2+. Здатнiсть катiонiв металiв iнгiбувати транспорт Са2+ в мітохондрії значною мiрою визначається ентальпiєю їх гiдратацiї та спорiдненiстю до карбоксильних груп Са2+-унiпортера цих органел.

7. Катiони Са2+ (30-100 мкммоль/л) i Cd2+ (15-50 мкмоль/л) iндукують перехід внутрішньої мембрани мітохондрій у стан високої неспецифічної проникності за різними механізмами, проте шляхом формування одних і тих же пор. Найбiльш iмовiрно в основi цього лежить неодинакова спорiдненiсть катiонiв Са2+ i Cd2+ до карбоксильних i сульфгiдрильних груп макромолекул мембрани мітохондрій.

8. Катiони Sr2+ (50-100 мкмоль/л), Mn2+ (50-200 мкмоль/л) та La3+ (2-50 мкмоль/л) не iндукують набухання мітохондрій печiнки. Разом з тим вони пригнiчують Са2+-iндукованi змiни проникностi внутрiшньої мембрани мітоходрій за конкурентним типом. В основi цього лежить, iмовiрно, пригнiчення цими катiонами акумуляцiї катiонiв Са2+ мiтохондрiями та їх взаємодiя з Са2+-зв'язуючими групами пороутворюючих бiлкiв мембрани мітохондрій.

9. Катiони ряду лужноземельних (Ca2+, Sr2+) i перехiдних (Mn2+, Cd2+, La2+) металiв суттєво впливають на функцiонування мітохондрій печiнки, зокрема на дихання, ADP-фосфорилюючу та кальцiйакумулюючу функцiї мітохондрій, а також на стан проникностi внутрiшньої мембрани цих органел. Здатнiсть катiонiв металiв взаємодiяти з рiзними функцiональними системами мітохондрій неодинакова i визначається їх фiзико-хiмiчними властивостями: ентальпiєю гiдратацiї, спорiдненiстю до карбоксильних i сульфгiдрильних груп макромолекул. Це створює можливості для направленого пошуку антидотів до металів з різною спорідненістю до кисне- і сірковмісних лігандів клітини.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦЇ

1. Дубицький Л.О., Вовканич Л.С. Вплив катiонiв перехiдних металiв на дихання i продукування Н+ мiтохондрiями печiнки // Укр. бiохiм. журн. - 1996. - Т. 68, N 5. - С. 59-63.

2. Дубицький Л.О., Вовканич Л.С., Полотнюк С.Я. Роль кальцiйтранспортних систем i мiтохондрiй у порушеннi екзоцитозу секреторних клiтин шлунка катiонами перехiдних металiв // Актуал. пробл. медицини, бiологiї, ветеренарiї та сiльського господарства. - Львiв: Вiче, 1997. - С. 59-62.

3. Вовканич Л.С., Дубицький Л.О. Вплив катiонiв лужноземельних i перехiдних металiв на неспецифiчну проникнiсть внутрiшньої мембрани мiтохондрiй // Експериментальна та клiнiчна фiзiологiя i бiохiмiя. - 1998. - N 1. - С. 5-9.

4. Дубицький Л.О., Вовканич Л.С. Дослiдження впливу катiонiв перехiдних металiв на Са2+-стимульоване дихання мiтохондрiй печiнки щурiв // Матерiали 1-го з'їзду Українського бiофiзичного товариства. - Київ. - 1994. - С. 90 - 91.

5. Дубицький Л.О., Вовканич Л.С., Сабадаш Г.І. Дослiдження впливу катiонiв перехiдних металiв на функцiональну активнiсть секреторних клiтин шлунка. // Тез. доп. XIV з'їзду Українського фiзiологiчного товариства iм. І.П. Павлова. - Київ. - 1994. - С. 157.

6. Дубицький Л.О., Вовканич Л.С. Дослiдження адаптивних реакцiй мiтохондрiй печiнки щурiв при iнтоксикацiях металами // Мат. наук.-практ. симп. "Медико-бiологiчнi проблеми адаптацiї в сучасних умовах iснування органiзму" (14-16 березня 1995 р., м. Кузнецовськ). - Львiв, 1995. - С. 19.

7. Дубицький Л.О., Вовканич Л.С., Сабадаш Г.І., Синюк З.В. Вплив катiонiв перехiдних металiв на системи пiдтримання кальцiєвого гомеостазу секреторних клiтин шлунку // Експериментальна та клiнiчна фiзiологiя. - Львiв, 1995. - С. 148-149.

8. Vovkanych L.S. Investigation of the mechanisms of metals` cations effect on respiration and H+ release of rat liver mitochondria // Book of abstracts of the 4-th International students` scientific conference. - Gdansk, 1996. - P. 6.

9. Vovkanych L.S., Dubitsky L.O. Investigation of the mechanisms of metals` cations effect on respiration of rat liver mitochondria // 9-th European bioenergetic conference. - August 17-22, EBEC Reports. - Biochim. Biophys. Acta. - 1996, V. 9. - P.192.

10. Дубицький Л.О., Вовканич Л.С., Полотнюк С.Я. Дослiдження ролi кальцiйтранспортних систем в порушеннi функцiональнои активностi секреторних клiтин катiонами металiв // Тез. доп. VII Укр. бiохiм. з'їзду. - Київ, 1997. - С. 40-41.

11. Вовканич Л.С., Дубицький Л.О. Вплив катiонiв металiв на дихання та кальцiйтранспортнi процеси у мiтохондрiях печiнки щура // Матерiали XV з'їзду Українського фiзiологiчного товариства (Донецьк, 1998). - Фiзiол. журн. - 1998. - Т. 44, N 3. - С. 156.

Размещено на Allbest.ru

...