Механізми впливу електронів і акустичних полів на біологічні мембрани

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ УКРАЇНИ

ХАРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

УДК 577.352.2/3; 539.1; 534.29

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора фізико-математичних наук

МЕХАНІЗМИ ВПЛИВУ ЕЛЕКТРОНІВ ТА АКУСТИЧНИХ ПОЛІВ НА БІОЛОГІЧНІ МЕМБРАНИ

Товстяк Володимир Васильович

03.00.02 - біофізика

Харків - 1999



Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському державному університеті Міністерства освіти України.

Науковий консультант:

доктор фізико-математичних наук, професор, член-кореспондент НАН України Залюбовський Ілля Іванович, Харківський державний університет, проректор з наукової роботи.

Офіційні опоненти:

-доктор фізико-математичних наук, професор, член-кореспондент НАН України Сльозов Віталій Валентинович, Національний науковий центр “Харківський фізико-технічний інститут”, завідувач відділу;

-доктор біологічних наук, старший науковий співробітник,

Гордієнко Євген Олександрович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу (м. Харків);

-доктор фізико-математичних наук, Волков Сергій Наумович, Інститут теоретичної фізики ім. М.М. Боголюбова НАН України, провідний науковий співробітник, (м. Київ).

Провідна установа: Інститут фізики НАН України, м. Київ.

Захист відбудеться “30” вересня 1999 р. о 1530 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському державному університеті за адресою: 310077, м. Харків, пл.Свободи, 4, ауд.7-4.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського державного університету за адресою: 310077, м. Харків, пл.Свободи, 4.

Автореферат розісланий “ 27 ” серпня 1999 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради С.В. Гаташ



Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. В останні роки іонізуюче й акустичне випромінювання широко використовують у різноманітних галузях промисловості, медицини та біології. Іонізуюче випромінювання застосовують для лікування цілого ряду онкогенних захворювань, а також для діагностики патологічних процесів. Велике поширення одержало використання направленого випромінювання електронів і гальмуючого випромінювання від електронних пучків у лікувальній практиці та радіобіології. З успіхом використовується ультразвукова діагностика для дослідження кровотоку судин і порожнин серця, для візуалізації глибоко розташованих внутрішніх органів і локалізації пухлин. Ефективне й безпечне застосування вже існуючих приладів, а також створення принципово нових імпульсних методів радіаційного та акустичного впливу і діагностики, неможливе без детального вивчення механізмів дії цих випромінювань на клітинному та молекулярному рівнях.

Сьогодні стало загальновизнаним, що радіобіологічні ефекти мають складний, багатофакторний характер, що залежить як від специфіки опроміненого об'єкту, так і від фізичних властивостей випромінювання. Експериментальні дані свідчать про те, що незважаючи на виняткове значення генетичного апарату в радіаційному пошкодженні клітин, не можна зводити всю сукупність радіобіологічних ефектів лише до ушкодження геному. Тому, як і раніше, науковою проблемою є виділення і дослідження критичних систем, які зумовлюють радіаційне ушкодження клітин.

До біологічних систем, що мають високу радіочутливість, належать плазматичні мембрани. Характер протікання первинних фізичних процесів і радіаційно-хімічних реакцій, що призводять до порушення структури і функціонального стану мембранних компонентів, багато в чому визначає радіаційну загибель клітини. Розуміння важливості ролі плазматичних мембран в ефектах радіаційної поразки призвело до того, що радіаційна мембранологія виділилася в самостійний розділ клітинної радіаційної біофізики. Дослідження, що спрямовані на одержання порівняних експериментальних даних і визначення фізичних механізмів впливу випромінювань на плазматичні мембрани, є базовими для розвитку радіаційної мембранології, отже актуальними.

Вивченню впливу радіації на мембранні компоненти присвячена велика кількість наукових праць. Як результат досліджень були виявлені основні закономірності впливу радіації на олігосахаридний шар, білкову і ліпідну фази мембран. Променеве пошкодження структури глікокаліксу виявляється в зміні поверхневого заряду клітин і порушенні взаємодії клітинних рецепторів з лігандами. В основі радіаційної модифікації білкового компоненту мембран лежить оксидація сульфгідрильних груп та ароматичних амінокислотних залишків, розрив водневих, дисульфідних і пептидних зв'язків, що призводять до істотних змін конформації та внутрішньомолекулярної рухливості білків. Радіаційне ушкодження ліпідної фази проявляється у зміні заряду, полярності, мікров'язкості ліпідного матриксу, порушенні структури та просторової організації ліпідних молекул. Важливим аспектом формування радіаційних мембранних ефектів є існування тісного взаємозв'язку і взаємозумовленості процесів, які індукуються опроміненням у різних компонентах мембрани. З цієї точки зору дуже важливим для радіаційної біофізики є порівняльний аналіз результатів, отриманих на простих модельних системах, біологічних мембранах і клітинах.

Уявлення про механізми радіаційного впливу на клітинні мембрани сформувалися, головним чином, на основі аналізу результатів вимірів, отриманих при опроміненні біологічних об'єктів рентгенівським та ?-випромінюванням. Суттєво менше вивчені закономірності впливу пучків заряджених частинок, зокрема, високоенергетичних електронів. Відзначимо, що в цій галузі досліджень основна увага приділялася біохімічним і біологічним аспектам впливу радіації, а питання, що торкаються специфіки первинних фізичних і хімічних процесів та механізмів, на цей час вивчені недостатньо. У цьому напрямку досліджень перспективним уявляється використання відносно простих біологічних систем та самого простого різновиду джерела випромінювання (моноенергетичні пучки електронів з малим розходженням), які дозволяють спланувати експеримент так, щоб значною мірою уникнути впливу репараційних явищ і взаємодії великої кількості різноманітних фізичних ефектів.

Аналогічні проблеми існують і в галузі досліджень впливу ультразвукового випромінювання на біологічні об'єкти. Зокрема, у більшості публікацій про вплив акустичних полів на біооб'єкти відсутні надійні дані, що дозволяють із певністю визначити первинні фізичні механізми спостережуваних біологічних ефектів. Крім того, дія акустичних і радіаційних полів у ряді випадків виявляється ідентичною до спостережуваних біологічних ефектів, тому дуже важливо дослідити можливий взаємозв'язок механізмів біологічної дії випромінювань різної фізичної природи.

Для визначення специфічних механізмів взаємодії випромінювання з мембранними структурами актуальною є розробка комплексної експериментальної методики, що містить достатньо повний набір методів вимірювання електрофізичних і структурно-функціональних властивостей біологічних мембран. У роботі наведені результати комплексного дослідження механізмів дії пучків високоенергетичних електронів та ультразвуку на клітини, мембрани клітин і модельні мембранні структури.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках досліджень кафедри експериментальної ядерної фізики Харківського державного університету за темами:

“Розробка і створення експериментального зразку імпульсно-доплерівського спектрального ультразвукового приладу діагностики серцево-судинної системи” (номер держреєстрації 0194U018973)

“Дослідження фізико-хімічних механізмів впливу іонізуючого випромінювання на структуру та функціональні властивості модельних і природних мембран з метою розробки радіопротекторних засобів” (номер держреєстрації UA 01008653P)

“Розробка фізико-хімічних методів екологічного контролю, радіаційного захисту та медичної діагностики дії іонізуючих випромінювань малої інтенсивності” (номер держреєстрації 0197U016499).

Мета і задачі дослідження. Метою дисертаційної роботи є визначення фізичних механізмів модифікації біологічних мембран під впливом високоенергетичних електронів та акустичних полів.

Для досягнення цієї мети в роботі були поставлені та вирішені такі задачі:

- Розробити експериментальну методику та створити устаткування радіаційно-біологічних досліджень, що дозволяють одержувати набори порівняних даних шляхом вимірювання електрофізичних та структурно-функціональних параметрів біологічних мембран. Методика повинна використовувати модифікатори прямої та опосередкованої продуктами радіолізу середовища дії радіації для виділення внесків окремих механізмів у формування модифікацій мембранних структур під впливом випромінювань.

- Провести виміри й одержати дані про електрофоретичну рухливість еритроцитів та тимоцитів, проникність мембран для іонів калію та поверхневий заряд ізольованих мембран під впливом пучків високоенергетичних електронів та ультразвуку терапевтичної інтенсивності. На основі отриманих експериментальних даних провести теоретичний аналіз і деталізувати основні первинні механізми впливу зовнішніх фізичних полів на електрокінетичні та електрофізичні властивості мембранних структур.

- Провести комплексне вивчення індуктивно-резонансного перенесення енергії між флуоресцентними зондами при дії електронного випромінювання, а також аналіз тонкої структури спектрів флуоресценції та власної флуоресценції білків. Провести ідентифікацію основних первинних механізмів зміни фізико-хімічних і структурно-динамічних властивостей ліпідного компоненту і структурних білків мембран при опроміненні високоенергетичними електронами.

- Визначити радіорезистентність Ca2+- та Mg2+-АТФаз тіней еритроцитів у присутності різноманітних мембранотропних агентів, а також дослідити вплив пучків високоенергетичних електронів на ферментні системи клітинних органел. Встановити первинні механізми впливу випромінювання на ці біологічні об'єкти та характер зв'язку між механізмами впливу та параметрами білок-ліпідних та внутрішньомолекулярних взаємодій білкових глобул.

- Оцінити роль радіаційно-акустичного механізму впливу високоенергетичних електронів на біологічні об'єкти та середовища, визначити ситуації, в яких цей механізм може бути вагомим у радіобіологічному ефекті для біологічних мембран.

Наукова новизна одержаних результатів

Вперше отримані порівняні набори даних про електрофоретичну рухливість еритроцитів та тимоцитів під впливом високоенергетичних електронів та виявлене зменшення їх ЕФР при збільшенні дози опромінення у широкому інтервалі доз (від 20 до 1000 Гр).

Вперше проведена оцінка радіочутливого об'єму клітин за зміною електрокінетичних характеристик мембран під впливом електронного опромінення.

Виявлено, що під дією пучків високоенергетичних електронів у широкому діапазоні інтенсивностей та доз опромінення спостерігається збільшення поверхневого негативного заряду та потенціалу ізольованих еритроцитарних мембран.

Запропоновано нову фізичну модель перерозподілу об'ємного заряду примембранних шарів при опроміненні. Модель дозволяє самоузгоджено описати дані про електричні властивості мембран, отримані шляхом вимірювання електрофоретичної рухливості та методом флуоресцентних зондів.

За допомогою запропонованої моделі пасивного транспорту іонів та досліджень, проведених з використанням набору флуоресцентних зондів, вперше встановлено, що під дією електронних пучків знижується мікров'язкість як полярної, так і гідрофобної зони ліпідної фази мембран.

Вперше отримані дані про індуктивно-резонансне перенесення енергії між зондами АНС і ДСП-12 при дії електронного опромінення та зроблені висновки про зміну фізичних властивостей і структури біологічних мембран.

Показано, що в основі спостережуваного зниження власної флуоресценції структурних білків мембран та інактивації АТФаз лежить зміна білок-ліпідних взаємодій у мембранах і внутрішньомолекулярних у білкових глобулах.

Отримано нові дані про зменшення швидкості дифузії гасників власної флуоресценції білків, пов'язаної з обмеженням їх внутрішньомолекулярної рухливості в мембрані.

Детально досліджено механізм локального радіаційно-акустичного впливу іонізуючого випромінювання на біологічні середовища. Вперше показано, що характерні розміри області локального динамічного впливу швидкого електрону порівняні з розмірами мембранних структур.

Практичне значення одержаних результатів. Проведені дослідження дозволили одержати нову інформацію про закономірності впливу пучків електронів та ультразвуку на фізико-хімічні та структурно-функціональні властивості клітинних мембран, необхідну, зокрема, для розвитку прикладних напрямків у біофізиці та ефективній розробці нових медико-біологічних технологій. Результати комплексних вимірів характеристик біологічних об'єктів стали основою для розробки і створення ряду нових методів, приладів і речовин, що мають практичне використання, а саме:

розроблено новий метод фізико-хімічної очистки води;

розроблені технології отримання нових композиційних матеріалів з органічною основою;

отримано нову речовину, що має радіопротекторну дію;

розроблено та створено кілька нових діагностичних приладів для медицини.

Доведена за одержаними результатами можливість підвищення радіорезистентності мембранних систем шляхом модифікації їхнього структурного стану та фізико-хімічних властивостей, що важливо при розробці нових радіопротекторних препаратів. Крім того, отримані дані про високу радіочутливість деяких компонентів мембранних структур можуть бути використані для розробки нових методів експрес-діагностики радіаційних пошкоджень живих організмів.

Особистий внесок здобувача. У дисертації узагальнені матеріали досліджень, що є результатом багаторічної самостійної роботи автора, або отримані при його особистій участі. З опублікованих робіт із співавторами використані лише ті матеріали, у які він вніс найбільш вагомий внесок.

У дисертації представлені результати досліджень, виконаних автором самостійно [14,15,17,18,20], а також під його науковим керівництвом [1-13,16,19], де здобувачу належить вибір проблематики та мети досліджень, постановка експериментальних і теоретичних задач, вибір оптимальних експериментальних методів. Йому належить значна роль у проведенні експериментів та обробці отриманих результатів. Автору належить основна роль в аналізі та інтерпретації експериментальних даних, у розробці конкретних фізичних моделей. У роботах [21,22,23] автором зроблені пропозиції по практичному використанню результатів проведених ним наукових досліджень. Він безпосередньо брав участь у розробці і створенні приладу для фізико-хімічного очищення води [22], в тестуванні нової радіопротекторної речовини [23], у розробці ультразвукового медичного перетворювача [21].

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень, які ввійшли в дисертаційну роботу, були представлені та обговорені на: Українській конференції по фундаментальним проблемам біології та медицини (Харків, 1987), Всесоюзному симпозіумі “Використання ультразвуку у промисловості та медицині”, Всесоюзній конференції по новим напрямкам у біотехнології (Пущино, 1988), VI конференції по спектроскопії біополімерів (Харків, 1988), Всесоюзній конференції по використанню ультразвуку в сільському господарстві (Москва, 1988), Всесоюзній нараді по новим методам та приладам у біології і медицині (Москва, 1989), I Всесоюзному радіобіологічному з'їзді (Пущино, 1989), International Symposium on Mechanisms of Acoustical Bioeffects (Pushchino, 1990), Радіобіологічному з'їзді (Київ, 1993), VIII Нараді по застосуванню прискорювачів заряджених часток у промисловості та медицині (Санкт-Петербург, 1995), II з'їзді Українського біофізичного товариства (Харків, 1998), II з'їзді біофізиків Росії (Москва, 1999), Семінарі Харківського відділення біофізичного товариства України (Харків, 1999).

Публікації. Результати роботи опубліковані в 44 наукових працях, у тому числі в 20 статтях, з них 5 без співавторів, в 3 авторських посвідченнях і патентах на винаходи та в 21 тезах доповідей національних і міжнародних конференцій, симпозіумів, з'їздів.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, восьми розділів та висновків. Повний обсяг дисертації складає 299 сторінок, 59 ілюстрацій, з них 4 ілюстрації займають повні сторінки, 28 таблиць, з них 2 таблиці займають повні сторінки, 41 сторінку займає список використаних бібліографічних джерел (428 найменувань).

Основний зміст роботи

У вступі визначене коло найбільш важливих проблем радіаційної мембранології та обгрунтовані необхідність і актуальність виконаних досліджень. Сформульовано мету дисертаційної роботи, поставлені задачі, рішення яких забезпечує досягнення мети.

У розділі 1 на основі наявних літературних даних проведено детальний аналіз сучасного стану проблем, пов'язаних із біофізикою акустичних ефектів, особливостями дії радіації на мембранні компоненти й активність мембранозв'язаних ферментів. Біологічна ефективність випромінювання в значній мірі залежить від локальної щільності поглиненої енергії, тому необхідне детальне дослідження динаміки передачі енергії від частинок первинного випромінювання до біологічного середовища. У зв'язку з можливою радіаційно-акустичною дією пучків електронів актуально порівняння характеру залежності спостережуваних ефектів від дози опромінення під впливом полів різноманітної природи та виявлення граничних значень біологічної дії як за дозою, так і за абсолютним значенням акустичного тиску.

Відзначено, що запропоновані до цього часу моделі радіаційно-індукованого механізму структурних перебудов мембран відбивають у більшій мірі біохімічну сторону процесів, що протікають. За рамками розгляду залишається аналіз причин зміни спостережуваних фізичних величин та побудова коректних моделей для самоузгоджуваного опису сукупності спостережуваних ефектів. Важливим фактором необхідності детального дослідження пошкодження біологічних мембран пучками електронів є також виявлена до теперішнього часу неоднозначна залежність спостережуваних змін фізичних величин та ефектів впливу радіації від умов та виду опромінення.

У розділі 2 описана комплексна експериментальна методика з використанням лінійного прискорювача електронів ЛПЕ-8-5А, яка застосована для проведення радіаційно-біологічних та акустичних досліджень та отримання коректних і порівняних наборів даних про біофізичні механізми модифікації біологічних мембран під впливом випромінювань. Особливостями методики є комп'ютерна технологія планування режиму опромінення і стикування на апаратно-програмному рівні систем керування прискорювачем електронів і джерела ультразвукових коливань із контрольно-вимірювальним комплексом дозиметричного та метрологічного забезпечення проведення дослідів. Вимірювання фізико-хімічних параметрів мембранних структур проведено з використанням комплексу устаткування і методів, серед яких створені прилади для вимірювання провідності бішарових ліпідних мембран (БЛМ), електрофоретичної рухливості (ЕФР) клітин та концентрації К+ у суспензії еритроцитів. Розвинені та відпрацьовані методики вимірювання власної флуоресценції мембранних білків, флуоресцентних зондів та ін..

У розділі 3 представлені дані про зміну ЕФР еритроцитів і тимоцитів під впливом високоенергетичних електронів та ультразвуку терапевтичної інтенсивності. Показано, що вплив випромінювання призводить до зниження ЕФР клітин. Ступінь проявлення ефекту змінюється в присутності модифікаторів - перехоплювачів продуктів радіолізу води (тіомочевини, триптофану, іонолу), SH-активних сполук (цистаміну, дітіотреітолу, ПХМБ), зшиваючих агентів (глутарового альдегіду) та сполук, що модифікують ліпідну фазу мембран (іонів Са2+, хлорпромазину, тритону X-100).

Важливим фактором, що визначає зміну електрокінетичних властивостей клітин під впливом пучка електронів, є пошкодження структури білкової фази мембран, зумовлене оксидацією сульфгідрильних груп та порушенням білок-ліпідних взаємодій. Зміна електрокінетичних властивостей в значній мірі визначається взаємодією вільних радикалів, що утворюються при радіолізі води, з мембранними компонентами, внаслідок якого зменшується мікров'язкість білок-ліпідної компоненти мембран, що впливає на рухливість білкових молекул і приєднаних до них вуглеводних залишків.

Зменшення ЕФР пов'язується з просторовим перерозподілом заряду у примембранних шарах та обумовлено як прямою дією на нього радіації, так і зміною фізичних властивостей білок-ліпідного комплексу мембран. Запропоновано модель перерозподілу об'ємного заряду мембран при опроміненні і показано, що зміна електрокінетичних властивостей клітин може бути пояснена зменшенням об'ємної щільності негативних фіксованих зарядів олігосахаридного шару.

В рамках розглянутої моделі використано самоузгоджене рішення одномірного рівняння Пуассона

з граничними умовами

, ,

що враховує як поверхневий заряд мембрани , так і об'ємний фіксований заряд олігосахаридного шару

.

Рішення має вигляд

, (1)

де - товщина олігосахаридного шару, - дебаєвський параметр екранування, - діелектрична проникність, - постійна Больцмана, - температура, - потенціал, що визначає зв'язування глікопротеїнової молекули з поверхнею мембрани, і - середня щільність зарядженої групи типу в приповерхневому шару мембрани.

В наближенні постійної в межах товщини глікокаліксу просторової щільності заряджених груп для потенціалу з (1) отримуємо

, (2)

де - частина повного поверхневого заряду клітини, обумовлена фіксованими зарядами глікопротеїнового шару. З урахуванням характерних розмірів товщини глікокаліксу та величини дебаєвського радіусу екранування з формули (2) маємо, що відносний внесок фіксованих зарядів приповерхневого шару є визначальним для потенціалу в примембранній області. Зменшення величини призводить, як бачимо з (2) і показано на рис.1, до зменшення електрокінетичного потенціалу в площині ковзання навіть при зберіганні величини повного заряду . Зміна щільності негативного заряду безпосередньо на поверхні білок-ліпідного матриксу при опроміненні залежить від характеру перерозподілу об'ємного заряду глікокаліксу і може зростати при зменшенні останнього.

В рамках теорії мішені отримана аналітична оцінка величини радіочутливого об'єму за кривою “виживання” ЕФР, яка для еритроцитів наведена у логарифмічному масштабі.

Для обробки даних і розрахунку величини радіочутливого об'єму була використана загальна формула

, (3)

де - доза опромінення, - відносна густина речовини об'єкту, - об'єм мішені, - кількість чутливих областей, U - електрофоретична рухливість.

З урахуванням аддитивності поверхневої щільності заряду в (2) можна вважати, що залишкова ЕФР обумовлена здебільшого поверхневим зарядом , а змінна складова пов'язана в основному зі зміною об'ємного заряду та зумовленою ним величиною . Відповідно до цього постійні величини і визначають зв'язок між величиною U та параметром виживання , прийнятим у теорії мішені:

.

Велика порівняльно з характерними розмірами треку частинок величина розрахованого таким чином радіочутливого об'єму мішені ~  5,5·10_5 мкм3 підтверджує важливість внеску вільних радикалів, що утворюються при радіолізі води, які впливають на структурний стан та об'ємний розподіл заряду в приповерхневих шарах мембрани. Як відомо, продукти радіолізу води локалізовані уздовж треку електрона в невеличких обсягах-шпорах, що знаходяться на відстані ~ 500 нм один від одного. У такого роду шпорах з діаметром ~ 4 нм утворюється 10-12 гідратованих електронів та первинних радикалів - продуктів радіолізу води, на утворення кожного з котрих витрачається енергія ~ 10 еВ. При народженні декількох вторинних та третинних електронів це означає збільшення практично на два порядки кількості безпосередньо діючих на заряд мембрани радикалів, на кожний з яких припадає, вочевидь, відносно невеликий об'єм локальної дії.

У розділі 4 досліджено вплив високоенергетичних електронів і ультразвуку на мембрани еритроцитів та виявлено збільшення виходу калію з клітин. Аналіз кінетики виходу калію показує, що при малих відрізках часу пострадіаційної інкубації внеском у збільшення потоку іонів калію

(4)



можливої зміни мембранної різниці потенціалів можна знехтувати. Тут - товщина мембрани, розглянутої як безперервний шар, - рухливість іонів калію, - валентність іонів калію.

У порушенні проникності еритроцитарних мембран для іонів калію важливу роль відіграють пошкодження білкового компоненту мембран продуктами радіолізу води - гідроксильними радикалами та гідратованими електронами. Збільшення проникності мембран обумовлено, зокрема, ушкодженням SH-груп мембранних білків і, як наслідок, зміною білок-ліпідних та внутрішньомолекулярних взаємодій білкової глобули.

Характер залежності виходу іонів К+ від температури підтверджує, що у формуванні реакції еритроцитів на вплив радіації важливу роль відіграють фізичні властивості ліпідного бішару. Виявлено збільшення радіорезистентності систем пасивного транспорту іонів K+ при підвищенні текучості ліпідної фази. Збільшення ж в'язкості мембран при 4°С призводить до більшого відносного виходу іонів калію і, таким чином, до зниження стійкості еритроцитів до дії опромінення.

У рамках запропонованої моделі та на підставі даних, отриманих при ультразвуковому опроміненні БЛМ, показано, що додатковим фактором підвищення проникності є зміна дифузійного режиму в примембранних шарах електроліту. Як бачимо з рис.4, частота відкриття іонних каналів, утворених дімерами граміцидіну, достатньо добре описується лінійною функціональною залежністю від часу

,

де - міжфазовий коефіцієнт розподілу граміцидіну і D - коефіцієнт дифузії. Для досліджених клітинних структур наявність достатньо великих неперемішуваних шарів Нернста пов'язана не тільки із структурованістю води поблизу поверхні мембрани, але й з морфологією мембран, а саме, наявністю глікокаліксу. Тому ефективна товщина цих шарів за порядком величини збігається з характерною товщиною олігосахаридного шару .

У розділі 5 проведено аналіз радіорезистентності Ca2+- та Mg2+-АТФаз тіней еритроцитів при великих дозах опромінення високоенергетичними електронами і показано, що активність АТФаз інгібується, причому Mg2+-АТФаза відрізняється більшою радіорезистентністю. Виявлено, що неіоногенний детергент тритон Х-100 сенсибілізує обидва ферменти до дії радіації, у той час як глутаровий альдегід, що структурує білкову компоненту, зменшує радіаційний ефект для Ca2+-АТФази.

При низьких концентраціях мембранного білка в опроміненій суспензії активність кальцієвої АТФази інгібується переважно продуктами радіолізу води, основним діючим агентом серед яких є радикали Н* . Зі збільшенням концентрації мембранного білка починає переважати пряма дія радіації на фермент.

Дія радіації на досліджувані АТФази переважно реалізується через зміну молекулярних білок-ліпідних і внутрішньомолекулярних взаємодій білкової глобули, характер яких, зокрема, визначається збільшенням під дією радіації частки окислених SH-груп. У результаті підвищується структурна жорсткість білкових молекул і знижується внутрішньомолекулярна рухливість.

Встановлено, що ферменти органел (ДХФІФ- і ферріцианідредуктази мікросомальних мембран) мають меншу чутливість до дії пучків електронів у порівнянні з Ca2+-АТФазою тіней еритроцитів. Мембранотропні агенти сенсибілізують обидва ферменти до опромінення швидкими електронами, причому радіорезистентність ферріцианідредуктази в присутності агентів виявляється істотно нижче. Механізм впливу високоенергетичних електронів на ферментативну активність оксидоредуктаз реалізується, головним чином, через зміну фізичних властивостей ліпідної фази внутрішньоклітинних мембран.

У розділі 6 наведені результати дослідження закономірностей впливу пучка високоенергетичних електронів на структурний стан та електрофізичні характеристики мембран еритроцитів і тимоцитів базуючись на даних, отриманих із використанням флуоресцентних зондів АНС і ДСМ. Виявлене зниження флуоресценції АНС і посилення інтенсивності свічіння ДСМ у суспензії опромінених тіней еритроцитів пояснюється збільшенням щільності поверхневого негативного заряду ізольованих еритроцитарних мембран під впливом радіації.

Відзначається, що висновок про збільшення щільності негативного заряду та потенціалу безпосередньо на поверхні мембрани

(5)

не суперечить виявленому зменшенню просторової щільності фіксованого негативного заряду в примембранному олігосахаридному шарі і, відповідно, потенціалу в площині ковзання. Відповідно до (2) електрокінетичний потенціал, що реєструється методом ЕФР, відбиває перерозподіл заряджених груп поблизу площини ковзання, що знаходяться на відстанях ~ 30 нм від ліпідного матриксу мембрани, і мало впливає на потенціал (5) безпосередньої поверхні мембрани. Сильно екранований заряд поверхні мембрани також не виявляє істотного впливу на електрокінетичний потенціал.

Встановлено, що одним із головних факторів, що визначають радіаційно-індуковану зміну заряду тіней еритроцитів під впливом високоенергетичних електронів, є розвиток процесів ПОЛ. Показано, що для зонда АНС (ДСМ) збільшення негативного поверхневого заряду призводить до зменшення (збільшення) кількості центрів зв'язування і зменшенню (збільшенню) константи асоціації



обумовленому відповідною зміною величини потенціалу.

У розділі 7 наведені результати досліджень флуоресценції пірену та показано зниження інтенсивності флуоресценції під впливом опромінення електронами. Характер гасіння флуоресценції пірену полярним гасником - іонами йоду не змінюється при опроміненні, тому зниження інтенсивності пояснюється зниженням квантового виходу флуоресценції зонду.

Проведено аналіз тонкої структури спектрів флуоресценції пірену та ступеню його ексимеризації при дії високоенергетичних електронів. Показано, що зменшення квантового виходу зонду

пов'язане, у свою чергу, не зі зміною полярності мікрооточення зонду, а з радіаційним порушенням фізичних властивостей ліпідної фази мембран. Про це свідчить зростання ступеню ексимеризації пірену в опромінених мембранах, що вказує на збільшення текучості в області вуглеводних ланцюгів ліпідних молекул. Висновок про зниження мікров'язкості гідрофобної зони ліпідної фази мембран під дією опромінення підтверджується також порівняльним аналізом параметрів флуоресценції пірену в суспензії тіней еритроцитів та модельних мембран.

Зміна фізичних властивостей та структурного стану мембран еритроцитів під впливом пучка електронів виявляється також у підвищенні ефективності перенесення енергії між флуоресцентними зондами АНС і ДСП-12. Розглянуті фізичні моделі сінглет-сінглетного переносу енергії вказують на збільшення рухливості молекул ДСП-12 в області неполярної зони ліпідного шару, що призводить до збільшення коефіцієнту доступності і зменшенню відстані , на якій молекули акцептора проводять більшу частину часу поблизу донора.

Дійсно, у загальному випадку вираз для стаціонарної флуоресценції донора при його гасінні акцептором може бути записаний у вигляді:



(6)

де , - інтенсивності флуоресценції донора у відсутності та в присутності акцептора, відповідно; - час гасіння флуоресценції донора у відсутність акцептора. Інтегральна величина

(7)

визначається характером процесу перенесення енергії, зокрема, його мультіплетністю, умовами перенесення, розподілом у просторі молекул акцептора , а також часткою доступної для акцепторів частини об'єму, що примикає до донора. Молекула ДСП-12, що містить вуглеводний ланцюжок, локалізується ближче до неполярної зони ліпідного бішару та знаходиться, таким чином, на цілком визначеній відстані від найближчого донора. В рамках найбільш простого підходу такому взаємному розташуванню молекул АНС і ДСП-12 відповідає уявлення просторового розподілу молекул акцептора у вигляді

, (8)

де - -функція Дірака, - середня кількість молекул акцептора, що припадає на одного донора. У виразі (8) ураховано, що молекули ДСП-12 можуть займати півпростір навколо молекул донора АНС, тому коефіцієнт доступності в даному випадку приблизно дорівнює 0,5.

У цьому випадку відношення інтенсивностей флуоресценції зонда-донора в присутності та у відсутності акцептора може бути подане у вигляді

, (9)

де - така відстань між донором і акцептором, при якій можливість гасіння дорівнює 0,5.

Вираз (9) є безпосереднім узагальненням відомої формули, що описує систему “1 донор - 1 акцептор”, у випадку довільного числа акцепторів .

У рамках фізичної моделі, яка більш коректно враховує структуру мембрани, відношення інтенсивностей описується виразом

,

в якому величина безпосередньо залежить від коефіцієнту доступності та геометрії мембрани

, (10)

у той час як постійна визначається обертальною рухливістю, взаємною орієнтацією молекул та іншими фізичними параметрами, що характеризують процес перенесення енергії ( концентрація пов'язаного з мембраною акцептора). Відповідно до (10) результати експериментів свідчать про можливе зменшення площі поверхні мембран після опромінення, особливо при великих відрізках часу після опромінення, коли розвиваються процеси ПОЛ.

Встановлено, що індуковане опроміненням зниження білкової флуоресценції, суттєво зменшується при зменшенні радіаційно-хімічного виходу вільнорадикальних реакцій. Зміна внутрішньомолекулярних взаємодій та конформаційного стану білків, що виявляється в зниженні флуоресценції, пов'язана з оксидацією SH-груп білкових молекул гідроксильними радикалами.

Виявлено зменшення ефективної константи гасіння триптофанової флуоресценції білків зовнішніми гасниками в ранні строки після опромінення та зміну характеру пошкоджень білкових молекул у процесі пострадіаційної інкубації. Зменшення швидкості дифузії гасників та ефективності гасіння пов'язано, очевидно, з підвищенням структурної жорсткості та обмеженням внутрішньомолекулярної рухливості мембранних білків еритроцитів та тимоцитів.

У розділі 8 теоретично досліджене збудження ультразвукових коливань при опроміненні біологічних об'єктів імпульсним пучком релятивістських електронів. Показано, що біологічна дія пучка швидких електронів може реалізуватися через ультра- та гіперзвукові коливання, що генеруються в процесі імпульсного опромінення речовини. При радіаційно-акустичному ефекті імпульсний електронний пучок виявляє дію на структури біологічного об'єкту, які не охоплені іонізацією безпосередньо. Ефективність трансформації енергії, що відбувається в мікроопіку, в енергію термоакустичного імпульсу досягає декількох відсотків для опіків від повторних електронів з енергією 50 - 500 еВ.

Характерною рисою збуджуваного імпульсу є його широкополосність та просторова локалізованість. Для оцінки величини виникаючих у зоні опромінення акустичних напруг можна використати вираз

, (11)



де - параметр Грюнайзена, який у загальному випадку залежить від температури речовини біооб'єкта, R - ефективний радіус пучка електронів, f - частота проходження імпульсів, - середній ток пучка, = 1,89 МеВ/см - іонізаційні втрати енергії електронів, s - швидкість звуку та - тривалість імпульса прискорювача. Наявна у виразі (11) величина b являє собою деяке порогове значення акустичної напруги, що призводить до суттєвих змін у біологічному об'єкті, тому нерівність у правій частині (11) є умовою радіаційно-акустичної дії на біооб'єкт з боку середнього акустичного поля.

Оцінка акустичних напруг, збуджуваних пучком у проведених дослідженнях, та їхнє порівняння з відомими даними про граничні значення показує, що при використаних параметрах пучка дією на біологічні об'єкти усередненого акустичного поля мегагерцового діапазону можна знехтувати.

Вперше теоретично вивчена локальна радіаційно-акустична дія швидких електронів на біологічні об'єкти та середовища. Показано, що утворення малих перегрітих областей поблизу місць зупинення вторинних електронів при проходженні іонізуючого випромінювання через біологічні середовища призводить до генерації мікросферичних термоакустичних імпульсів, що мають початкову величину амплітуди акустичного тиску до декількох кілобар та початкову тривалість в декілька пікосекунд.

Для оцінки розмірів мікроопіків і породжуваних ними акустичних імпульсів використане відоме інтегральне рішення Кірхгофа хвилевого рівняння

, (12)



де - потенціал зміщень, - локальна щільність поглиненої дози, - щільність середовища, - координати точки спостереження. Вважаючи, що щільність теплових джерел факторизується та задається гаусовим розподілом як у просторі, так і в часі, з (12) одержуємо такий вираз для величини акустичних тисків:

, (13)

де величина E визначає повну теплову енергію зони генерації, D - ефективний поперечник зони генерації і - ефективний час нагрівання. Пружна хвиля (13) має вигляд біполярного антисиметричного імпульсу.

Виникаючі мікроімпульси тиску можуть суттєво впливати на характеристики субклітинних структур у деякій сферичній зоні з центром у мікроопіці. Об'єм такої зони біологічної дії радіаційно-акустичного механізму визначається величиною збудженого у мікроопіці імпульсу тиску, законом його просторового спадання та граничного тиску інактивації. Урахування впливу поглинання акустичних хвиль показує, що для широкополосного акустичного сигналу (13) затухання має не експоненціальний, а степневий характер, внаслідок чого об'єм зони біологічної дії навколо мікроопіку може бути на порядок більше об'єму самого опіку. Відповідно, лінійні розміри області локальної динамічної дії порівняні з характерними розмірами мембранних структур і залежать від температури речовини біологічного об'єкту. У результаті цього зміна останньої може істотно впливати на швидкість інактивації при опроміненні. Відзначені особливості локального радіаційно-акустичного ефекту вторинних електронів дозволяють розглядати його як один із факторів біологічної дії високоенергетичних електронів.

Основні результати та висновки роботи

Показано, що вплив високоенергетичних електронів та ультразвуку терапевтичної інтенсивності призводить до зниження ЕФР еритроцитів та тимоцитів. Встановлено, що зміна електрокінетичних властивостей клітин у значній мірі визначається порушенням молекулярних взаємодій, зменшенням мікров'язкості ліпідної фази мембран і збільшенням рухливості білкових молекул.

Проведена в рамках теорії мішені аналітична оцінка розміру радіочутливного об'єму клітин указує на важливу роль продуктів радіолізу води у виявленій зміні фізичних властивостей і структурного стану клітинних мембран.

Спостережувана зміна електрокінетичних властивостей клітин пов'язана зі зменшенням об'ємної щільності негативних фіксованих зарядів примембранних шарів. Показано, що зміна щільності негативного заряду та потенціалу безпосередньо на поверхні мембрани при опроміненні залежить від перерозподілу об'ємного заряду і може зростати при його зменшенні.

Порушення проникності мембран еритроцитів для іонів калію під впливом пучка електронів пов'язано з підвищенням текучості ліпідної фази мембран та опосередковано пошкодженням SH-груп мембранних білків. Аналіз даних ультразвукового опромінення БЛМ показує, що додатковим фактором підвищення проникності є зміна дифузійного режиму в примембранних шарах електроліта.

На основі даних флуоресценції зондів АНС і ДСМ виявлене збільшення поверхневого негативного заряду та потенціалу ізольованих мембран еритроцитів при опроміненні електронами. Важливим фактором зміни електрофізичних властивостей мембран та параметрів комплексоутворення заряджених зондів є розвиток процесів ПОЛ.

Проведено аналіз тонкої структури спектрів флуоресценції пірену та ступеню його ексимеризації при дії високоенергетичних електронів, що вказує на зменшення квантового виходу зонду. Порівняльний аналіз параметрів флуоресценції пірену в суспензії тіней еритроцитів та модельних мембран свідчить про зниження мікров'язкості гідрофобної зони ліпідної фази мембран.

Отримано дані про індуктивно-резонансне перенесення енергії між зондами АНС і ДСП-12 при дії опромінення електронами. Збільшення ефективності перенесення енергії пов'язане зі зміною в'язкості ліпідної фази мембран, що обумовлює збільшення рухливості молекул ДСП-12, та зменшенням площі поверхні мембран.

Досліджено вплив пучка високоенергетичних електронів на фізичні властивості білкового компоненту тіней еритроцитів. Встановлено, що в основі спостережуваного зниження власної флуоресценції структурних білків та інактивації Ca2+- та Mg2+-АТФаз лежить зміна білок-ліпідних та внутрішньомолекулярних взаємодій білкової глобули, яка пов'язана з оксидацією SH-груп продуктами радіолізу води.

Виявлено зменшення ефективної константи гасіння триптофанової флуоресценції білків у ранні строки після опромінення та зміну механізму пошкоджень у процесі пострадіаційної інкубації. Показано, що зменшення швидкості дифузії гасників та ефективності гасіння пов'язане з обмеженням внутрішньомолекулярної рухливості мембранних білків.

Встановлено, що під впливом пучків електронів активність Ca2+- та Mg2+-АТФаз, а також оксидоредуктаз мікросомальных мембран, інгібується продуктами радіолізу води та прямою дією радіації. Фізичний механізм дії пучків електронів на оксидоредуктази реалізується, головним чином, через ліпідну фазу мембран.

Проведено теоретичний аналіз термоакустичного механізму впливу швидких електронів на біологічні об'єкти. Показано, що усереднені акустичні поля мегагерцового діапазону, збуджені поглинанням енергії випромінювання, до біологічної дії не призводять. У той же час, мікроопіки та породжувані ними акустичні імпульси мають характерні розміри, порівняні з розмірами мембранних структур, і можуть бути одним із фізичних факторів впливу.

Проведені дослідження й отримані результати відносяться до тієї області радіаційної біофізики, яка на сьогоднішній день продовжує залишатися найменш вивченою. Отримана нова інформація про закономірності впливу пучка електронів та ультразвуку на фізико-хімічні властивості клітинних мембран важлива для більш глибокого розуміння первинних механізмів взаємодії випромінювань із мембранними структурами. Водночас, значення поданих результатів не вичерпується тільки науковою цінністю, оскільки виявлені закономірності і тенденції разом із відомими даними про вплив інших видів випромінювань можуть суттєво сприяти ефективній розробці нових медико-технічних і медико-біологічних технологій.

мембрана електрон еритроцит електрофоретичний



Основні результати дисертації опубліковані в наступних роботах:

Баранник Е.А., Гирнык С.А., Товстяк В.В. Стимуляция внедрения грамицидина в бислойную липидную мембрану ультразвуком // Биофизика. - 1988. - Т.33, N 2. - С. 364 -366.

Товстяк В.В., Древаль В.И., Назаренко Н.Д., Баранник Е.А. Влияние ультразвука на ионную проницаемость мембран эритроцитов // Ультразвук в сельском хозяйстве. - М.- 1988. - С. 40-41.

Древаль В.И., Назаренко Н.Д., Товстяк В.В. Исследование влияния ультразвука на Са-АТФазу // Ультразвук в сельском хозяйстве.- М. -1988. -С.42-43.

Крупин В.Д., Курилко С.А., Ткаченко В.Н., Горбенко Г.П., Товстяк В.В. Влияние ультразвука на электрофоретическую подвижность лимфоцитов и их способность связывать 1,8-анилинонафталинсульфонат // Биополимеры и клетка. -1993. - Т.9, N 1. - С. 35-38.

Крупин В.Д., Курилко С.А., Ткаченко В.Н., Горбенко Г.П., Товстяк В.В. Влияние радиации на электрофоретическую подвижность эритроцитов // Укр. биохим. журн. - 1993. - Т.65, N 5. - С. 105-108.

Горбенко Г.П., Крупин В.Д., Финашин А.В., Товстяк В.В. Влияние ионизирующего излучения на структуру мембран эритроцитов // Укр. биохим. журн. - 1993. - Т.65, N 1. - С. 75-79.

Горбенко Г.П., Крупин В.Д., Товстяк В.В. Влияние радиации на структурное состояние мембран эритроцитов // Биофизика. - 1993. - Т.38, N 4.- С. 699-702.

Крупин В.Д., Курилко С.А., Ткаченко В.Н., Горбенко Г.П., Товстяк В.В. Влияние электронов на транспорт калия в эритроцитах // Биополимеры и клетка. - 1993. - Т.9, N 3. - С. 54-56.

Ткаченко В.Н., Горбенко Г.П., Дюбко Т.С., Крупин В.Д., Курилко С.А., Товстяк В.В. Влияние ионизирующей радиации на активность микросомальных оксидоредуктаз // Радиационная биология и радиоэкология. - 1994. - Т.34, N 4-5. - С.627-630.

Крупин В.Д., Горбенко Г.П., Курилко С.А., Ткаченко В.Н., Товстяк В.В. Нарушение проницаемости мембран эритроцитов для ионов калия при воздействии радиации // Биополимеры и клетка. - 1994. - Т.10, N 1.- С. 90-93.

Горбенко Г.П., Крупин В.Д.. Товстяк В.В. Исследование влияния радиации на структуру мембран эритроцитов // Укр. биохим. журн. - 1994. - Т.66, N 3. - С. 71-75.

Ткаченко В.Н., Горбенко Г.П., Курилко С.А., Товстяк В.В. Влияние мембранотропных агентов на активность оксидоредуктаз микросом // Укр. Биохим. Журн. - 1996. -Т.68, N 4.- С. 105-108.

Финашин А.В., Крупин В.Д., Товcтяк В.В. Влияние тритона Х-100 и глутарового альдегида на активность Са2+- и Мg2+-АТФаз эритроцитов при облучении // Укр. Биохим. Журнал. - 1997. - Т.69, N 1.- С. 99-103.

Товстяк В.В. Исследование влияния радиации на структуру мембран тимоцитов методом флуоресцентных зондов // Биол. Вестник.- 1998. - Т.2, N 1. -С.54-56.

Товстяк В.В. Нарушение проницаемости мембран эритроцитов для ионов калия под влиянием пучка электронов // Биол. Вестник.- 1998.- Т.2, N2. - С. 24-27.

Товстяк В.В., Калиниченко А.И. Локальный радиационно-акустический эффект как фактор действия ионизирующего излучения // Вісник Харківського Університету N 438 Серія Фізична “Ядра, частинки, поля”.- 1999. - вип. 1(5). - С. 7-17.

Товстяк В.В. Оценка величины радиочувствительного объема мембран при электронном облучении // Вісник Харківського Університету, N 443 Серія Фізична “Ядра, частинки, поля”.- 1999. - вип. 2(6). - С. 26-30.

Товстяк В.В. Флуоресцентное исследование действия радиации на структуру белков эритроцитарных мембран // Вісник ХДУ, № 434, Біофізичний Вісник .- 1999.- Вип.3(1). - С.122-124.

Финашин А.В., Товстяк В.В. Исследование модифицированного действия быстрых электронов на ферментативную активность Са2+- и Mg2+-АТФаз плазматических мембран эритроцитов // Вісник ХДУ, № 450, Біофізичний Вісник .- 1999.- Вип. 4(2). - С.45-52.

Tovstiak V.V. Radiation effect on the surface charge of natural and model membranes // School of Fundamental Medicine Journal.- 1999. - V.5.- N 1.- P. 61-65.

А.с. 1520682 СССР. Ультразвуковой преобразователь / Баранник Е.А., Громов А.А., Кадников О.Г., Папакица В.В., Стервоедов Н.Г., Товстяк В.В., А.В. Яковлев. - N 3826600. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 8 июля 1989 г.

Патент 548 Установка для физико-химической очистки сточных вод . Цымбал В.И., Батвинов Л.П., Товстяк В.В., Мельник А.Н. - N 94020050; Заявлено 15.11.93; Опубликовано 30.06.94 Бюллетень N 8-II.

Патент 4950053/14 Российская Федерация, RU 2049473 C1, Государственный научный центр лекарственных средств, Харьковский государственный университет (UA) / Вещество, обладающее радиопротекторным действием / Оболенцева Г.В., Ветров В.В., Товстяк В.В., Древаль В.И., Гарная С.В., Брюзгинова Л.П.; Заявлено 27.06.91; Опубликовано 10.12.95, Бюл. N 34. - 8 с.

Товстяк В.В., Гирнык С.А., Древаль В.И., Назаренко Н.Д. Влияние ультразвука на физическую структуру липидной компоненты мембран // Труды конф. “Научно-технический прогресс в медицине и фундаментальные проблемы биологии”. - Харьков. - 1987. - С. 335-336.

Гирнык С.А., Товстяк В.В. Действие терапевтического ультразвука на бислойные липидные мембраны // Труды конф. “Научно-технический прогресс в медицине и фундаментальные проблемы биологии”. - Харьков. - 1987. - С. 336-338.

Гирнык С.А., Древаль В.И., Товстяк В.В. Модифицированный бислой в качестве компонента биосенсоров // Труды Всесоюзн. конф. “Новые направления биотехнологии”.- Пущино. -1988. - С.116.

Горбенко Г.П., Древаль В.И., Товстяк В.В. Спектрофотометрическое изучение кинетики взаимодействия метгемоглобина с модельными фосфолипидными мембранами // Труды 6-й конференции по спектроскопии биополимеров. - Харьков. - 1988. - С. 102.

Баранник Е.А., Папакица В.В., Товстяк В.В., Шарыгин Б.Г., Яковлев А.В. Ультразвуковой прибор для измерения скорости кровотока // Труды Всесоюзн.совещания “Новые ультразвуковые методы и приборы для применения в биологии и медицине”. - М. - 1989. - С. 10.

Древаль В.И., Назаренко Н.Д., Товстяк В.В. Регистрация ультразвуковой стабильности эритроцитов методом электрохимического пробоя мембран // Труды Всесоюзн.совещания “Новые ультразвуковые методы и приборы для применения в биологии и медицине”. - М. - 1989. - С. 27.

Бондарь И.Д., Древаль В.И., Крупин В.Д., Курилко С.А., Назаренко Н.Д., Ткаченко В.Н., Товстяк В.В. Структурно-функциональные изменения мембран эритроцитов при действии пучка электронов // Труды 1-го Всесоюзного радиобиологического съезда. - Пущино. - 1989.- С. 54-55.

Barannik E.A., Tovstiak V.V. A simple method of estimation of intercellular temperature gradients produced by ultrasound // Thesis to International symposium “ Mechanisms of acoustical bioeffects ”.- Pushchino.- 1990.- P. 13.

Barannik E.A., Girnyk S.A., Tovstiak V.V. Ultrasonic stimulation of gramicidin building into bilayer // Thesis to International symposium “Mechanisms of acoustical bioeffects”.- Pushchino.- 1990.- P. 2.

Tovstiak V.V. Action of ultrasound on the structural and functional characteristics of biological membrane // Thesis to International symposium “Mechanisms of acoustical bioeffects”.- Pushchino.- 1990.- p. 39.

Горбенко Г.П., Крупин В.Д., Курилко С.А., Ткаченко В.Н., Товстяк В.В. Действие ультразвука на физико-химические свойства эритроцитов // Труды ХХ Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов “Актуальные вопросы медицины”. - Харьков. - 1992. - С.29-30.

Ткаченко В.Н., Крупин В.Д., Курилко С.А., Горбенко Г.П., Товстяк В.В. Влияние радиации на функциональное состояние эндоплазматического ретикулума печени // Труды Радиобиологического съезда. - Ч. Ш. - Киев. - 1993. -С. 999.

Крупин В.Д., Курилко С.А., Ткаченко В.Н., Товстяк В.В. Влияние пучка электронов на электрофоретическую подвижность клеток // Труды Радиобиологического съезда. - Ч. II. - Киев. - 1993. - С.530.

Финашин А.В., Крупин В.Д., Горбенко Г.П., Товстяк В.В. Влияние радиации на активность Са2+- и Mg2+-АТФаз эритроцитарных мембран // Труды Радиобиологического съезда. - Ч. Ш. - Киев. - 1993. - С. 1049-1050

Горбенко Г.П., Крупин В.Д., Товстяк В.В. Действие быстрых электронов на структурное состояние мембран эритроцитов // Труды Радиобиологического съезда. - Ч. 1. - Киев. - 1993. - С. 242.

Баранник Е.А., Гирнык С.А., Товстяк В.В. Ультразвуковой фетальный “Mini-Dop” // Труды школы-семинара “Автоматизація фізичних методів контролю в технічній диагностиці та медицині” . - Київ. - 1995. - С. 107.

...