Закономірності деградації хроматину тимоцитів за променевого ураження щурів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Київський університет імені Тараса Шевченка

УДК 576.315.42

Закономірності деградації хроматину тимоцитів за променевого ураження щурів

03.00.01-радіобіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Пархомець Юрій Петрович

Київ 1999

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в лабораторії фізико-хімічної біології кафедри біохімії біологічного факультету Київського університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник - доктор біологічних наук Цудзевич Борис Олександрович, професор кафедри біохімії Київського університету імені Тараса Шевченка

Офіційні опоненти - доктор біологічних наук Дружина Микола Олександрович, провідний науковий співробітник відділу біофізики Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України доктор біологічних наук Дмитренко Микола Петрович, завідуючий лабораторією біохімії Інституту екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя МОЗ України

Провідна установа - Український науковий центр радіаційної медицини АМН України, відділ радіаційної біохімії, м. Київ

Захист дисертації відбудеться “22“ червня 1999р. о 12 год на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26. 001. 24 Київського університету ім. Тараса Шевченка за адресою: 252127, м. Київ, проспект Глушкова 2, корпус 12 (біофак), ауд. 215

Поштова адреса: 252033. Київ-33, вул. Володимирська, 64, спецрада Д 26.001.24, біологічний факультет

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці уніве-рситету: Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “18” травня 1999 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, професор О.В. Брайон

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Дія численних екстремальних факторів, включаючи іонізуючу радіацію на організм, викликає ряд імунодефіцитних та аутоімунних станів. Основними проявами імунодефіциту є зміна кількісного і субпопуляційного складу імунокомпетентних клітин, зниження проліферативної активності лімфоцитів, їх міграційних властивостей. Центральне місце у функціонуванні імунної системи належить лімфоцитам, яким характерна висока радіочутливість (Ярилин, 1988 ; Дмитренко, 1997).

Дослідження впливу іонізуючої радіації на імунну систему, вивчення типових змін і особливостей структурних, метаболічних та функціональних порушень в лімфоцитах продовжує бути однією із основних проблем сучасної радіобіології. Згідно сучасних уявлень, загибель лімфоїдних клітин при променевому ураженні пов'язане з безпосереднім пошкодженням мембран і структурної цілісності хроматину (Волянский, 1994; Бурлакова, 1992). Відомо, що хроматин в лімфоїдних і гемопоетичних тканинах опромінених тварин розщеплюється на кратні нуклеосомам фрагменти, що утворюють на електрофореграмах характерну картину “драбини” (Brown, 1993). Подальше вивчення механізмів міжну-клеосомної деградації хроматину показали, що цей процес ініціюється ендогенними нуклеазами і має місце у багатьох випадках програмованої клітинної загибелі (Ярилин, 1996; Цудзевич 1997).

Аналіз проблеми загибелі лімфоцитів показує, що у пізнанні молекулярних основ процесу деградації ДНК, механізмів його регуляції досягнутий певний прогрес (Уманский, 1996; Хансон, 1997). Дискусійними залишаються питання ініціації та регуляції пускових механізмів фрагментації хроматину лімфоцитів після дії на тварин низьких доз іонізуючої радіації, немає вичерпної картини стану компенсаторних, захисно-відновних і патологічних реакцій у відмираючих клітинах.

Не викликає сумніву, що комплексні дослідження молекулярних механізмів розвитку загибелі клітин приведуть до поглибленого розуміння природи багатьох важливих захворювань людини, що пов'язані зі змінами показників імунної системи і відкриють нові перспективи ефективного впливу на імунодефіцитні стани в умовах дії іонізуючої радіації.

Отже, проблема, якій присвячена робота, є актуальною і являє собою значний теоретичний і практичний інтерес.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є частиною тематичного плану науково-дослідних робіт кафедри біохімії, що виконується на замовлення Кабінету Міністрів України від 1995 до 2000 р., № 2 держреєстрації 0197 U 003173 “Біохімічні механізми розвитку променевого ураження після дії іонізуючої радіації”.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи є дослідження механізму розвитку і регуляції деградації структури хроматину, динаміки неспецифічних стресорних реакцій в тимоцитах тварин, що зазнали опромінення, та вивчення особливостей впливу на ці процеси радіомодулятора-нікотинаміду.

У відповідності з метою були поставлені такі завдання: 1. Дослідити вплив різних доз іонізуючої радіації на деградацію хроматину тимоцитів щурів. Виявити умови прояву цитогенетичного ефекту, тобто, дозу іонізуючої радіації та найменший час стабільного формування дискретних зон хроматину за типом “драбини”. 2. Дослідити механізм деградації хроматину та стан репараційної системи ДНК тимоцитів щурів при одноразовому рентгенівському опроміненні та дії хронічного випромінювання низької інтенсивності. 3. Дослідити протеолітичну активність тимоцитів при впливі іонізуючої радіації. 4. Дослідити вплив тотального одноразового рентгенівського випромінювання на стан процесів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) в тимоцитах. 5. Вивчити модифікуючу дію нікотинаміду на деградацію ДНК тимоцитів опромінених щурів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що деградація хроматину в тимоцитах щурів з формуванням дискретних ДНК-фрагментів за типом “драбини” розпочинається через 3 години після одноразового рентгенівського опромінення в дозі 1 Гр. Тривале хронічне зовнішнє та внутрішнє опромінення з загальним радіаційним навантаженням 25 сГр викликає подібну картину деградації хроматину. Виявлені закономірності утворення однониткових та двониткових розривів ДНК, які відбуваються в хроматині тимоцитів після дії на щурів іонізуючої радіації в дозі 1 Гр, їх зв”язок з роботою репараційної системи клітини.

Вивчені характерні закономірності протікання реакцій ПОЛ і встановлено, що в опромінених тимоцитах реакції ПОЛ мають фазову залежність, що відповідає основним термінам деградації хроматину.

Досліджено протеолітичну активність тимоцитів щурів, що зазнали впливу іонізуючої радіації та модифікуючої дії нікотинаміду.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати щодо закономірностей механізму деградації хроматину тимоцитів опромінених тварин мають, перш за все, фундаментальне значення, оскільки дозволяють суттєво обгрунтувати розвиток післярадіаційних порушень в лімфоїдних клітинах на молекулярному рівні і лежать в основі розробки засобів цілеспрямованої їх корекції. Досліджено характер неспецифічних реакцій та зміни протеїназних активностей ферментів, що доповнюють відомі на сьогоднішній день принципи і етапи загибелі лімфоїдних клітин після дії іонізуючої радіації.

Результати досліджень можуть бути покладені в основу при розробці науково-обгрунтованих шляхів створення ефективних засобів, здатних модифікувати дію іонізуючої радіації на організм і системи органів. Так, нікотинамід стимулює розпад ДНК, і тим самим, прискорює апоптоз в лімфоїдних клітинах.

Особистий внесок здобувача. В процесі виконання дисертації автор особисто відібрав та критично проаналізував весь обсяг вітчизняної та зарубіжної літератури стосовно теми проведеного наукового дослідження, і запропонував його головну мету. Дисертантом відібрані та модифіковані методи вирішення поставлених завдань, інтерпретовано отримані результати. Експериментальні дослідження проводились самостійно, а також спільно з співробітниками лабораторії фізико-хімічної біології. В дисертації використані результати наукових публікацій, в тому ж числі написані у співавторстві, доля особистої участі у підготовці колективних публікацій -90 %.

Апробація роботи. Основні матеріали дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на 3-му симпозіумі, присвяченому пам'яті доктора біологічних наук Е.В. Михайловської "Діагностика та профілактика негативних наслідків радіації" (Київ, 1997), VII Українському біохімічному з'їзді (Київ, 1997), ІІІ з'їзді по радіаційним дослідженням (Москва, 1997), ІІІ з”їзді Українського біофізичного товариства (Харків, 1998), професорсько-викладацькій конференції КУ, 1998.

Публікації. Основний зміст дисертаційної роботи викладено у 7 публікаціях (3 статті, 4 тези доповідей).

Об'єм і структура дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури (3 розділи), методів, результатів досліджень та їх обговорення (2 розділи), заключення, висновків, списку використаної літератури (160 джерел). Дисертація викладена на 124 сторінках машинопису.

іонізуючий тимоцит щур випромінювання

2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження проводилися на білих нелінійних щурах-самцях масою 130-170 г. Застосовували такі експериментальні моделі опромінення: 1. Одноразове тотальне опромінення тварин в різних дозах (1,29 х 10-2 Кл х кг-1, 2,58 х 10-2 Кл х кг-1, 5,16 х 10-2 Кл х кг-1, 10,32 х 10-2 Кл х кг-1, 15,48 х 10-2 Кл х кг-1, 20,64 х 10-2 Кл х кг-1) проводили на рентгенівській установці РУМ-17 за умов: фільтри 0,5 мм Сu та 1 мм Аl; напруга 200 кВ, сила струму 5 мА; шкірно-фокусна відстань 50 см; потужність дози в повітрі-8,3 х 10-4 А х кг-1. 2. Хронічне комбіноване зовнішнє та внутрішнє опромінення щурів проводили при постійному, на протязі 6 місяців, перебуванні щурів на експериментальній базі м. Чорнобиль. Внутрішнє радіаційне навантаження створювалося за допомогою раціону місцевого виробництва. Загальне радіаційне навантаження за умов хронічного досліду складало 25 сГр, без урахування щільноіонізуючої компоненти від трансуранових елементів.

В дослідах забезпечували стимуляцію біосинтезу нікотинамідаденін-динуклеотиду (НАД) одноразовим внутрішньочеревним введенням інтактним тваринам 20 мг нікотинаміду на 100 г маси тіла.

Тимус контрольних та опромінених тварин перетирали через 4 шари нейлонової сітки у середовищі Хенкса, далі отримували суспензію тимоцитів (Уманский, 1986). Фрагментацію ДНК, характерну для апоптозу, виявляли за допомогою електрофорезу в 1,2 % агарозному гелі, деградацію ДНК визначали методом Солов”яна, (1993). Для виявлення одно - та двониткових пошкоджень ДНК (ОР, ДР) в суспензії тимоцитів використовували метод Дмитренка, (1997). Визначали позаплановий синтез ДНК (Спитковский, 1992). Проводили дослідження нейтральної протеолітичної активності ядерного матриксу (Малахова, 1990) та активності катепсин В-подібних протеїназ (Чорна, 1996). Досліджували стан перекисного окислення ліпідів (Стальная, Гаришвили, 1977). Визначення Са2+, Мg2+-залежного та Мg2+-залежного накопичення полі-дезоксинуклеотидів (ПДН) у тимоцитах опромінених щурів проводили за методом Уманського, (1988). Визначення білка проводили за методом Lowry, (1951). Статистичну обробку результатів здійснювали з використанням програм Microsoft Excel.

3. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

При дії екстремальних факторів на клітину виникає геномна та гомеостазна нестабільність (Кунах, 1995). Наявність внутрішньоклітинних механізмів, які можуть забезпечити геномні і метаболічні перебудови, має не тільки еволюційне, а й безпосередньо адаптивне значення (Соловьян, 1990). Такий стан організму доцільно зобразити схемою: стрес -адаптація -виживання або смерть.

При екстремальній дії стратегія організму направлена на те, що клітини, які він не може відновити і контролювати, підлягають загибелі шляхом включення програми апоптозу.

Основним і загальновідомим біохімічним маркером апоптозу в самих різних клітинах і під дією різних стимулів є упорядкована міжнуклеосомна деградація хроматину. Цей процес є першою незворотною подією, що визначає долю клітини. Одним із його проявів є накопичення розчинних дезоксинуклеопротеїдів (ДНП).

І. Фрагментація ДНК тимоцитів за умов променевого ураження

Закономірності деградації хроматину тимоцитів опромінених щурів. Відомо, що основними наслідками дії іонізуючої радіації на клітини радіочутливих органів є розпад хроматину і накопичення полідезоксинуклеотидів. Однак в науковій літературі обмаль даних про характер та закономірності деградації хроматину і особливості початкових механізмів цих процесів. Існують також суперечливі дані про дозову залежність, розвиток цих подій в часі, інтенсивність розпаду в умовах дії іонізуючої радіації різної інтенсивності.

Тому на першому етапі роботи ми досліджували характер та основні закономірності деградації хроматину тимоцитів опромінених щурів при дії різних доз радіації, а також порівнювали дію одноразового рентгенівського опромінення на щурів з наслідком дії хронічного іонізуючого опромінення низької інтенсивності.

При використанні електрофорезу в агарозному гелі не вдається спостерігати чіткої картини фрагментації хроматину тимоцитів через 3 год після дії на тварин випромінювання в дозі 0.5 Гр, але відмічається його деградація. Через 1та 2 год після дії випромінювання в дозі 1 Гр було виявлено посилення деградації хроматину, але відсутні чітко сформовані дискретні області ДНК. Як видно з Рис. 1, поява набору ДНК-фрагментів відбувається через 3 год після дії на щурів іонізуючої радіації в дозі 1 Гр. Нуклеосомні фрагменти формують дискретні області за типом "драбини" відповідно до їх розміру. При цьому на електрофореграмі в агарозному гелі виявляються виразні смуги, що, як правило, відповідають фрагментам ДНК довжиною 200, 600 та 800 пар нуклеотидів (Матишевська, 1997).

При опроміненні в дозі 2 та 4 Гр спостерігається накопичення дискретних ДНК-фрагментів. Кількість фрагментів не збільшується з підвищенням дози. Збільшення дози до 8 Гр приводить до підвищення вмісту ДНК в термінальних зонах електрофореграми. Паралельно відбувається формування нових фрагментів ДНК, що мають більшу молекулярну масу.

При вивченні структурного стану хроматину тимоцитів хронічно опромінених щурів встановлено, що відбувається його фрагментація. Кількість фрагментів ДНК значно зростає та розподілені вони рівномірніше за спектром молекулярних мас (Рис. 2).

В результаті проведених досліджень встановлено, що дія хронічного іонізуючого випромінювання в дозі 25 сГр, як і одноразового рентгенівського опромінення, приводить до активації процесів фрагментації ДНК в тимоцитах з подібним характером.

Другим із підходів для визначення ступеня деградації хроматину в клітинах було дослідження виходу низько-молекулярних фрагментів ДНК - ПДН. Нами встановлено, що з підвищенням дози випромінювання спостерігається достовірне збільшення накопичення ПДН (Рис. 3).

В результаті накопичення ПДН, які мають різну молекулярну масу, відбувається формування дискретних областей на електрофореграмах. Факт їх появи дає змогу зробити висновок про активацію в клітині процесів, які вже не підлягають контролю з боку репараційної системи. Отримані нами дані та результати літератури (Солдатенков, 1989) дозволяють стверджувати, що в опромінених лімфоцитах деградація ДНК є ранньою подією і передує загибелі цих клітин.

Утворення розривів ДНК та їх репарація. Для аналізу фрагментації ДНК тимоцитів опромінених щурів ми вивчали динаміку структурних змін хроматину. Цілісність полімерної ДНК після опромінення порушується внаслідок утворення одно-ниткових та двониткових розривів. Як видно з Рис. 4, процес розщеплення структури ДНК має фазовий характер. Так, вже через 15 хв після опромінення відбувається збільшення кількості однониткових розривів, що на далі може визначати розвиток подій. Хоча більшість їх ліквідуються, деяка частина залишається нерепарованою і приводить до виникнення додаткових двониткових розривів, кількість яких через 120 хв. починає збільшуватись. Критичний рівень двониткових розривів, можливо, є сигналом в результаті якого відбувається активація систем деградації генетичного матеріалу (Bruant, 1984).

У відповідь на дію випро-мінювання відбувається активація функціонування репараційних систем, які мають значний, але певний резерв. (Рябченко, 1982, Shall, 1982). Це приводить до того, що приблизно через 2 год кількість однониткових розривів зменшується. Індекс репарації збільшується порівняно з першим дослідженим терміном. Та в інтервалі до 60 хв позаплановий синтез ДНК підвищений стосовно інтактних тварин (Рис. 5).

З приведених вище даних деградації і репарації можна зробити висновок про те, що на першому етапі (120 хв) в результаті дії іонізуючої радіації відбувається накопичення двониткових розривів ДНК. А збільшення кількості однониткових розривів ДНК приводить до зменшення синтетичного потенціалу клітини.

Хронічно опромінені тварини мали інший розподіл досліджених показників. Так, при аналізі одно - та двониткових розривів ДНК їх кількість відповідає закінченню першої фази деградації генетичного матеріалу. Але індекс репарації перевищує норму, що може свідчити про потенційну життєздатність клітин. Приймаючи до уваги раніше отримані дані за допомогою електрофорезу: більшу, у порівнянні з одноразовим рентгенівським опроміненням, кількість дискретних зон деградації хроматину, їх рівномірне розподілення за спектром молекулярних мас, зникнення зазначених особливостей через 2-3 тижні після опромінення тварин можна зробити висновок, що ці клітини знаходяться у стані адаптації.

Результати порівняння дії одноразового рентгенівського та хронічного випромінювання свідчать про те, що зменшення індексу репарації не пов'язано зі зменшенням ресурсу клітини, а є наслідком дії програми адаптації більш складної за ієрархією біологічної системи.

Механізм розвитку фрагментації хроматину тимоцитів опромінених щурів.

Експериментальним шляхом було встановлено, що Са2+, Mg2+-залежна ендонуклеаза здійснює розриви ниток ДНК, що знаходяться між нуклеосомами (Cohen, 1984). Внаслідок цього з'являються розриви, які несуть 3'-ОН кінці (Белецкий, 1987), накопичуються ПДН. Тому частина нашої роботи була направлена на вивчення ферментативної деградації ДНК та визначення природи нуклеаз, що відповідають за цю деградацію в тимоцитах опромінених щурів. Через 30 хв після дії радіації в тимоцитах починає збільшуватись Са2+, Mg2+-залежне накопичення ПДН, що через 120 хв набуває максимального значення (при цьому воно збільшується в п'ять разів у порівнянні з контролем). Репараційні системи вже не справляються з новою хвилею утворення ферментативних розривів, і через 180 хв спостерігалась впорядкована деградація ДНК. Далі відбувається елімінація клітин з деградованим хроматином.

Нами було досліджено і Mg2+-залежне накопичення ПДН, оскільки Mg2+-залежна нуклеаза відома як фермент, що також деградує нативну ДНК (Никонова, 1982). Як видно з Рис. 6, через 120 хв. Mg2+-залежне накопичення ПДН збільшується у два рази, але у порівнянні з активністю Са2+, Mg2+-залежної ендонуклеази можна зробити висновок про незначний вклад цього ферменту у формування ефекту.

Таким чином, можна зазначити, що в умовах нашого експерименту 120 хв після дії опромінення можна вважати незворотним терміном процесу пошкодження клітин. Са2+, Mg2+-залежна ендонуклеаза -ініціює процес ферментативного розпаду хроматину, і її ферментативна активність визначає фрагментацію генетичного матеріалу. Сигналом для збільшення активності ферменту може бути збільшення нерепарованих двониткових розривів.

ІІ. Стан ПОЛ тимоцитів при дії рентгенівського опромінення

В тимоцитах після опромінення швидко прискорюються вільнорадикальні реакції перекисного окислення, що супроводжуються розщепленням складних органічних сполук, дисипитацією їх енергетичного потенціалу і утворенням токсичних продуктів ліпоперекисної природи (Кудряшов, 1961; Серкіз, 1990; Кудряшов, 1992). Тому наступним етапом наших досліджень було вивчення динаміки спонтанного, ферментативного та неферментативного окислення в тимоцитах опромінених щурів.

Ферментативна система ПОЛ використовує донором відновлених еквівалентів НАДФН, а неферментативна-аскорбінову кислоту. Спонтанне перекисне окислення вимірювали при інкубації суспензії клітин без додавання відновників.

Табл. 7 Накопичення малонового діальдегіду в тимоцитах щурів при опроміненні в дозі 1 Гр (нмоль МДА на 2,5 х 107 кл., М ± m)

* - Р<0,05 у порівнянні з контролем.

Як видно з Табл. 7, при спонтанному процесі відмічається збільшення кількості малонового діальдегіду в тимоцитах. Швидкість ПОЛ збільшується в присутності Fe2+-аскорбата.

Після дії одноразового рентгенівського випромінювання в дозі 1 Гр в тимоцитах відбувається збільшення кількості продуктів неферментативного і фермент залежного окислення ліпідів. Ця закономірність має фазовий характер. Відмічено статистично достовірне збільшення накопичення МДА, що припадає на 120 хв після дії радіації. Причому вклад ферментативного процесу у першій фазі (15 хв і 120 хв) більший та становить 178 % і 433 % у порівнянні з контролем, неферментативна система-115 % і 192 % відповідно. У третій термін (через 180 хв) швидкість нефермент- і фермент залежного ПОЛ знижується. Нами визначено також приріст дієнових кон'югатів через 120 хв і 180 хв після опромінення щурів - відповідно у 1,9 та 3 рази (Рис. 8). Отже, результати проведених досліджень свідчать, що в тимоцитах опромінених щурів відбуваються зміни в системі вільнорадикального окислення ліпідів у напрямку активації процесу ліпопероксидації, що статистично підтверджується для початкових (дієнових кон'югатів) і кінцевих продуктів (малонового діальдегіду) у порівнянні з контролем. Одержані дані вказують на можливість існування певної специфічності прояву променевого ефекту на систему ПОЛ відмираючих тимоцитів. Так, при аналізі динаміки накопичення МДА звертає на себе увагу їх фазова залежність з перерозподілом на активність НАДФН -залежної пероксидації ліпідів, що співпадає з кількістю ОР і ДР під час закінчення першої фази деградації.

ІІІ. Дослідження протеїназної активності тимоцитів опромінених щурів

Активація протеїназ, що розщеплюють білки хроматину в клітинах опромінених тварин опосередковано приводить до деградації ДНК. Відомо, що у формуванні радіобіологічних ефектів приймають участь ферменти які вивільнюються з субклітинних структур в результаті пошкодження мембран, так і безпосередньо ядерні протеїнази (Zhivotovsky, 1994).

В результаті чисельних досліджень встановлено, що велика кількість білків гідролізується в процесі загибелі лімфоїдних клітин (Сологуб, 1992). При цьому спочатку в протеоліз включаються ядерні білки, а на заключних стадіях білки цитоплазми. Відповідно до субстратів і оптимальних умов дії в цьому розділі представлені дані щодо вивчення активності протеїназ в умовах нашого експерименту. Як видно з Рис. 9, активність нейтральних протеїназ хроматину підвищується. Завдяки особливостям своєї дії: обмеженому протеолізу широкого спектра білків, зміні конформації хроматину вони можуть виконувати регуляторну функцію. Їх підвищена активність відмічається всю першу фазу деградації генетичного матеріалу. Через 180 хв. після іонізуючого випромінювання їхня активність знижується. По іншому активуються протеїнази, що мають оптимальну активність при кислому середовищі (Рис. 10). Лише наприкінці першої фази (120 хв) починає проявлятися тенденція до їх активації, а через 180 хв. вона становить 150 % від контрольних величин. При аналізі та порівнянні змін протеїназних активностей видно, що в початковий (до 120 хв) післярадіаційний період спостерігається активація протеолітичних ферментів ядерного матриксу. Їх активація може викликати каскад гідролітичних реакцій, що призводять до модифікації шляхом обмеженого розщеплення важливих ядерних ферментів, структурних білків хроматину і цитоскелету (Сологуб, 1988). Далі у апоптичних клітинах відбувається ряд структурних та метаболічних змін, при яких активуються катепсин В-подібні протеїнази. Хоча лізосоми залишаються інтактними, але можливо, що певна кількість ферментів перебуває на зовнішній поверхні цих органел. Катепсин В-подібні протеїнази можуть приймати участь в дерепресії окремих ділянок геному шляхом протеолізу гістонів, регуляції обмінних процесів у клітині. Але на наш погляд, основна протеолітична активність катепсин В-подібних протеїназ направлена на розщеплення цитоскелету відмираючих клітин, що полегшує утворення апоптичних тілець.

ІV. Особливості радіомодифікуючої дії нікотинаміду на структурний стан хроматину тимоцитів опромінених щурів

В останній час велику увагу дослідників привертає питання про участь полі- АДФ-рибозилювання у механізмі апоптозної загибелі клітин (Kroemer, 1995). Вважається також, що згаданий процес біохімічної модифікації відіграє важливу роль у репарації ДНК та модифікації активності ендонуклеаз (Кириллова, 1990). Оскільки субстратом для АДФ-рибозилювання служить НАД, доцільно було вивчити особливості радіомодифікуючої дії нікотинаміду. В першій серії експериментів ми вивчали вплив нікотинаміду (НАМ) при введенні його тваринам за 15 та 30 хв до опромінення на формування розривів в ДНК. На Рис. 11, представлені результати дослідів по визначенню кількості одно- та двониткових розривів ДНК через 3 год. після опромінення в дозі 1 Гр. Як видно, кількість ДР зростає при введенні НАМ відповідно на 14% і 21,5%. Кількість ОР зменшується у порівнянні з хроматином тимоцитів, в яких ініціюється апоптоз. Порівняння показників кількості ОР і ДР при введенні НАМ за 15 та 30 хв до опромінення показує, що радіомодифікуючий препарат не однозначно впливає на процеси репарації ДНК. Так, його дія приводить до прискорення відновлення частини ОР, але кількість ДР зростає. Такий розвиток подій можна пояснити тим, що НАМ в заданих умовах експерименту виявляє свою дію, як інгібітор АДФ-рибозилювання (Wright, 1996). Можливо, що специфічні інгібітори АДФ-рибозилювання пригнічують схильну до помилок компоненту репарації, але загальновідомою роллю полі-АДФ-рибози-лювання є збільшення доступності деградо-ваного генетичного матеріалу комплексам ферментів репарації (Wielckens, 1985). Також, в цих умовах не виключена можливість порушення метаболізму нуклеотидів з наступ-ним інгібуванням репаративного синтезу (Milam, 1984).

В другій серії експериментів ми вивчали вплив НАМ на Са2+, Мg2+-накопичення ПДН. Представлені дані (Рис. 12) свідчать про підсилення Са2+, Мg2+-залежного накопичення ПДН через 15 хв у 2,2 рази порівняно з апоптозними клітинами. Але основний пік активності відповідального за це ферменту в нашій моделі апоптозу припадає на другу годину після дії випромінення в дозі 1 Гр. Та найбільше підсилення дії іонізуючої радіації відбувалося при введенні НАМ за 30 хв до дії іонізуючої радіації, то саме такі параметри використо-вувалися далі при дослід-женнях. Як видно з Рис. 12 , введення НАМ знижувало Са2+, Мg2+-залежне нако-пичення ПДН в 2,2 рази у порівнянні з апоптозними клітинами. Введення НАМ через 30 хв після дії випромінення, також, знижує активність ферменту в 1,8 разів.

Введення нікотинаміду за 15 хв до опромінення збільшує Са2+, Мg2+- залежне накопи-чення ПДН порівняно з опромі-неними тваринами (декапітація через 15 хв після дії іонізуючої радіації), що говорить про невеликий внесок нікотинаміду у внутрішньоклітинний рівень НАД в тимоцитах, а зазначений вище радіомодифікуючий ефект відбувається за рахунок непрямого впливу нікотинаміду на систему репарації ДНК.

ВИСНОВКИ

1. Установлена дозова залежність деградації хроматину тимоцитів опромінених щурів в інтервалі 0,5-8 Гр. Розпад хроматину з формуванням на електрофореграмах дискретних областей ДНК-фрагментів за типом “драбини” розпочинається через 3 год після дії одноразового рентгенівського випромінення в дозі 1 Гр. Збільшення дози опромінення та терміну після дії іонізуючого випромінення приводить до накопичення дискретних ДНК - фрагментів, що мають більшу молекулярну масу.

2. Комбіноване хронічне опромінювання з загальним радіаційним навантаженням 25 сГр викликає подібну до дії одноразового рентгенівського випромінювання картину деградації хроматину.

3. Цілісність полімерної ДНК після опромінення порушується внаслідок утворення однониткових та двониткових розривів. Деградація структури ДНК має фазовий характер. Так, в умовах нашого експерименту 120 хв є терміном закінчення першої фази. На цьому етапі достовірно зменшується індекс репарації і у 5 разів підвищується активність Са2+, Мg2+-залежної ендонуклеази, наслідки таких процесів приводять до збільшення однониткових та двониткових розривів ДНК відповідно на 112% і 70 % у порівнянні з контролем. Індекс репарації тимоцитів хронічно опромінених тварин перевищує норму і свідчить про те, що ці клітини знаходяться у стані адаптації.

4. Через 15, 120 та 180 хв після дії одноразового рентгенівського опромінення спостерігається зміна протеїназної активності тимоцитів щурів. Активність нейтральних протеїназ хроматину підвищується через 15 хв після дії випромінення, а в кінці першого етапу деградації хроматину спадає. На заключних стадіях апоптозу відбувається збільшення активності катепсин В-подібних протеїназ на 53 %.

5. Вплив іонізуючої радіації викликає активацію перекисного окислення ліпідів. Зміни неферментативної і ферментзалежних складових процесів носять фазовий характер із перерозподілом активності на НАДФН -залежну систему, що відповідає стадіям деградації хроматину тимоцитів щурів.

6. Використання нікотинаміду, як радіомодифікуючого препарату, приводить до активації розпаду хроматину. Цей процес відбувається за рахунок активації Са2+, Мg2+-залежної ендонуклеази в ранні терміни, а також за рахунок непрямого впливу нікотинаміду на систему репарації.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Кучеренко Н.Е., Пархомец Ю.П., Ряполова И.Ю., Цудзевич Б.А. Этапы развития интерфазной гибели тимоцитов при лучевом поражении //Доп. АН України. -1998. -№11. -С.158-161.

Цудзевич Б.О., Пархомець Ю.П., Андрійчук Т.Р., Юркіна В.В. Деградація ДНК імунокомпетентних клітин за променевого ураження// Укр. біохім. журн. -1998. -№4. -С.105-110.

Пархомець Ю.П., Андрійчук Т.Р., Харсун В.А., Цудзевич Б.О. Етапи деградації хроматину тимоцитів щурів, що підлягають загибелі шляхом апоптозу// Вісник КУ.-1998. -Т.27. -С. 9-11.

Цудзевич Б.О., Пархомець Ю.П., Андрійчук Т.Р., Юркіна В.В. Деградація ДНК імунокомпетентних клітин за променевого ураження. VII Укр. біохім. з”їзд (верес. 1997 р., Київ)// Тез. доп. (Ч. 3)-Київ, 1997. -С.134-135.

Цудзевич Б.О., Пархомець Ю.П., Андрійчук Т.Р., Юркіна В.В., Кучеренко М.Є. Радиационно индуцированный апоптоз клеток иммунокомпетентных органов. ІІІ съезд по радиационным исследованиям (14-17 октября, 1997. Москва) //Тез. докл. (Том 1)-Пущино, 1997. -С. 136-137.

Цудзевич Б.О., Пархомець Ю.П. Апоптоз імунокомпетентних клітин в умовах променевого ураження // ІІІ симпозіум: Діагностика та профілактика негативних наслідків радіації (16-17 грудня 1997 р., Київ) Київ, 1997. -С.265-266.

Пархомець Ю.П., Андрійчук Т.Р., Юркіна В.В., Цудзевич Б.О. Закономірності деградації структури ДНК за променевого ураження. ІІ з”їзд Укр. біофізичного товариства (29червня-3липня 1998. Харків) // Тези доп. -Харків, 1998.-С. 231.

Размещено на Allbest.ru