Нейростероид 11-диоксикортизол в работе мозга, поведении, антистрессовой защите и нейропсихиатрических заболеваниях: новые исследования и терапевтические стратегии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина

Нейростероид 11-диоксикортизол в работе мозга, поведении, антистрессовой защите и нейропсихиатрических заболеваниях: новые исследования и терапевтические стратегии

Студент Буряченко С.В.

Украина, г. Харьков,

Введение

Подробное изучение химической структуры гормона 11-диоксикортизол, в особенности его стеранового ядра позволило на молекулярном уровне увидеть действие гормона на молекулы клеток-мишеней, изучить биохимические свойства и влияние его молекул на нейроны головного мозга.

Данные полученные о рецепторных белках, обуславливающих избирательный прием гормонального сигнала клеткой позволяют по-новому смотреть на рецепцию в клетках. Рассмотрены молекулярная структура и физико-химические свойства рецепторов гормона 11-диоксикортизол, его связывающие характеристики, механизм взаимодействия гормон-рецепторного комплекса с различными клеточными компонентами, основные этапы рецепторного цикла, а также роль гормон-рецепторного комплекса в развитии метаболических ответов клетки на гормон. Специальное внимание уделено роли рецепторов нейронов в чувствительности к гормону в норме и при патологии.

Открыт и рассмотрен новый биохимический механизм регуляции гормоном 11-диоксикортизол синтеза холестерина, поддержание уровня липидов в организме, формирование иммунной системы, реакции воспаления и антистрессовой защиты организма, что в свою очередь решает такие проблемы как атеросклероз, ожирение, варикоз, тромбофлебиты, сердечно-сосудистые заболевания, нейропсихические расстройства, бесплодие, мутации, врожденные ферментопатии, старение клеток и организма в целом.

Ключевые слова: гормон 11-диоксикортизол, украинская минога, антистрессовая защита, иммунитет, реакция воспаления, нейрохимический эффект, нейростероиды, нейропсихические заболевания, нейрорегуляция, нейрорецепторные белки, нейрофизиологическая регуляция.

Цель. Предо мной стояла цель в исследовании гормона 11-диоксикортизол в раскрытии и понимании механизма интенсивного синтеза, увеличении концентрации и его активность. Одной из главных целей моих исследований является изучение механизма транспорта гормона от момента синтеза до реакции его молекул с рецепторами нейронов, оказывающий антистрессовую защиту на клетки-мишени нейроны, нейрохимический эффект дающий интенсивный синтез иммунных клеток, синтез и формирование факторов реакции воспаления, действия оказывающее гормоном на формирование работы головного мозга и поведения, подробное изучение открытого мною рецепторного белка - феромона.

Материалы и методы. Экспериментальным объектом в наших исследованиях является украинская минога. Это животное, обладающее большой природной антистрессовой защитой своего организма, не подвержена болезням и обладает сильным метаболизмом и устойчивым иммунитетом. Этими своими биологическими свойствами у нас вызвало интерес к ее подробному изучению реакции на стресс и стрессовой адаптации. Исследования проводились на украинской миноге (Lamprey mariae), рыбах (Carasius carasio), (Сarpius carpio), лабораторными крысами линии Вистар, которые и являлись экспериментальным материалом и объектом. Данное исследование или ему подобное с определением концентрации и активности гормона необходимо проводить весной в период нереста миноги. В этот период концентрация гормона в крови и тканях - максимальная.

Синтез рецепторных белков в большой концентрации обусловлен тем, что он является феромоном и играет в этот период важную роль в жизни самок миноги. Исследования готовились, таким образом, когда вначале исследуемым первым объектом является украинская минога (Lamprey mariae), остальные животные выступают подопытными, так как на них проводится испытание действия гормона с биохимической точки зрения и нейрохимического влияния на рецепцию нейронов.

Украинская минога (Lamprey mariae) достигающая 24 см длины (Kottelat, Freyhof, 2007). У этой миноги спина и бока темно-серые, слегка отливающие металлическим блеском, брюхо светло-желтое или матово-белое. Ареал охватывает бассейны Адриатического, Эгейского, Азовского, Балтийского, Чёрного и Каспийского морей. Она распространена в Восточной Европе -- от Польши до Грузии и Западной Сибири (Holсhik, Renaud, 1986). Обитает в чистых водах небольших ручьев с песчаным или каменистым дном и заходит в ручьи с более крупных рек для нереста (Renauld, Claude B., 2011). Ход из рек начинается в середине марта -- первой половине апреля.

Миграции миноги в реке, как правило, происходят ночью. Отчетливо выраженная отрицательная реакция на свет у миноги ставит интенсивность ее хода в зависимость от фазы луны. В темные, безлунные ночи интенсивность хода достигает максимума. Известны примеры и дневного хода речной миноги, но это происходит обычно в пасмурные дни при сильном помутнении воды. Вверх по ручью Студенок (Харьковская область) минога поднимается со скоростью от 1 до 4 км/час.

Миноги, вошедшие в ручей в конце лета -- начале осени, остаются в ней около года, ничем не питаясь. За это время у них происходят заметные как внешние, так и внутренние изменения: созревают икра и молоки, кишечник дегенерирует и превращается в тонкий тяж, зубы становятся тупыми, прекращают функционировать расположенные в ротовой воронке слюнные железы, спинные плавники увеличиваются и просвет между ними сокращается, у самки вырастает спинной плавник, а у самцов -- половой сосочек. Но самое замечательное в преднерестовых изменениях миноги -- это то, что у миног уменьшается не только вес, но и длина. Нерестится речная минога в начале весны. Каждая самка выметывает в среднем 22 тысячи икринок. Икринки донные, прилипающие, грушевидной формы. Их диаметр равен 12 мм. Личинки (пескоройки) выклевываются на 11-14-й день после оплодотворения. Они очень похожи на маленьких (3,2 мм) светло-желтых червячков (М.М. Иванова-Берг, 1962). Пескоройки скатываются в углубление между камнями и галькой, откуда их не может вымыть течение реки, и лежат неподвижно 3--4 дня, питаясь остатками желтка, запасы которого сосредоточены у них в печени. По достижении 1 мм пескоройка зарывается в грунт. 15--20-дневные личинки миноги покидают места выклева и сносятся течением вниз по реке, задерживаясь на заиленных, со слабым течением, участках реки. Здесь они закапываются в ил и начинают активно питаться детритом и диатомовыми водорослями. К этому времени личинки приобретают окраску, маскирующую их под цвет ила. Личиночная стадия у миноги продолжается 4--5 лет (В.А. Абакумов, 1966).

Рис. 1. Внешний вид речной миноги: 1 -- ротовая (присасывательная) воронка, 2 -- непарная ноздря, 3 -- глаз, 4 -- наружные отверстия жаберных мешков, 5 -- органы боковой линии, 6 -- анальное отверстие, 7 -- мочеполовой сосочек, 8 -- спинные плавники, 9 -- хвостовой плавник, 10 -- миомер, 11 -- миосепта (фото Буряченко С.В., 2012).

Это животное, обладающее огромным запасом жиров в своем организме, накапливаемый в течение нескольких лет (4-7) способно вырабатывать колоссальное количество стероидного гормона 11-диоксикортизол непосредственно выбрасывая его в кровь. В зависимости от экологического состояния водной среды обитания, наличия питательных веществ, украинская минога накапливает в запас жир, который в период нереста переходит в жирные кислоты, холестерин и синтезируется гормон. Стероидогенез протекает почти при идеальных условиях. Вот какие данные мы получили, исследуя и сопоставляя все химические составляющие:

1. Достаточное наличие запасов липидов и триацилглицеридов

2. Достаточный и полный синтез жирных кислот

3. Полноценный синтез холестерина

4. Температура при протекании реакции +28⁰

5. Температура окружающей среды (воды) +16-+18⁰С

6. Поступление в организм таких минералов как Сa²⁺

7. Cолевой состав воды равен по жесткости (рН - 114%)

8. Достаточное освещение

9. Очень высокая скорость синтеза рецепторных белков

10. Очень высокая скорость распада гормона и его метаболитов в печени

11. Очень высокая скорость транспорта гормона

12. Синтез специфических белков

13. Быстрое дедепонирование жиров для стероидогенеза

14. Высокая метаболическая зависимость: запас липидов - холестерин - метаболические процессы - стероидогенез

Сопоставляя полученные данные, можно сказать, что данные условия синтеза гормона считаются идеальными, так как получены в природных, и подтверждены в лабораторных условиях. Следующим этапом исследований является выделение гормона 11-диоксикортизол в чистом виде посредством приготовления гомогената. Ценным объектом исследования является надпочечник, в нем синтезируется этот гормон. Взятие образцов тканей мы проводили в лабораторных условиях, материал отбирал у умерщвленных взрослых зрелых особей скальпелем вырезая части мышц в брюшной и хвостовой частях тела в виде больших квадратов размером 1 х 2 см., массой 10-14-11 и 13 г. Кровь набирал инсулиновым шприцом с области сердца (Пучков, 1982). Также для исследований (на микроскопию и получение гомогената) были взяты надпочечниковая железа. Надпочечниковую железу взвешиваем (его масса равна 0,6 мг), делаем конфокальную микроскопию. Гомогенат мы готовили следующим образом: приготовления гомогената тканей у всех исследуемых животных (нескольких пар особей миноги): самки и самцы украинской миноги (8 пар). Гормон 11-диоксикортизол можно обнаружить только у взрослых, зрелых особей в возрасте 4-7 лет. Образцы тканей брались с разных участков тела. У миноги мышцы тела с брюшной и хвостовой части. Так или иначе, образцы были взяты с соединительной ткани и покровной. Гомогенат приготавливал для исследования гормона именно 11 - диоксикортизола. Полученные образцы тканей отмыли от крови, измельчили хирургическими ножницами, потом тщательно измельчили в фарфоровой ступке до кашецообразного состояния, отфильтровываю через несколько слоев марли. Как нейтральную среду использовали буферный раствор с добавлением 0,25 М сахарозы и ЭДТА. Соотношение ткань/среда 1: 9(10%). Соотношение ткань/среда (вес/объем) может быть различным. Обычно готовят исходный 10% гомогенат (1 г ткани на 9 мл среды).

Рис. 2. Взятие образцов ткани с передней части тела (фото Буряченко С.В., 2012).

Гомогенат взятых образцов ткани необходимо приготовить в очень короткий срок (не более 2-4 ч.) после забора у живого животного. После полученный и отфильтрованный гомогенат подвергаем экстракции, помещая пробы в экстрактор, готовим экстракт тканей.

Тоже самое делаем со всеми взятыми образцами тканей (как с передней - брюшной так и с задней части тела - хвостовой).

Экстракт тканей проводим хлороформом все 4 пробы, гомогенат переносим в делительные воронки (емкостью 150 мл) и доливают к ним по 75 мл очищенного и дважды перегнанного хлороформа. При отсутствии делительных воронок экстракционные процедуры можно проводить в самих колбах. Хлороформ вливают порциями, обмывая им внутренние колбы (для более полного использования гомогената). Делительные воронки плотно закрываем пробками, энергично встряхиваем в течение 2 мин и оставляем в штативах для расслаивания фаз.

Рис. 3. Взятие образцов ткани с задней части тела (фото Буряченко С. В., 2012)

Затем удаляем верхний слой гомогената обычным сливанием (если экстракцию осуществляли в делительных воронках) или осторожным отсасыванием капиллярной пипеткой с помощью водоструйного насоса или отбираем микропипеткой. Энергичным встряхиванием промываем хлороформные экстракты сначала 7,5 мл 0,1 н раствора едкого натра, а затем (после расслаивания фаз) - 3 мл воды. После встряхивания в течение 15 с верхний, водный, слой удаляют. Для освобождения органической фазы от остатков воды к пробам прибавляем по 2 г безводного сернокислого натрия. Колбы плотно закрываем пробками и вновь встряхиваем, ставим в холодильник на 2 ч. После этого отмериваем цилиндром в чистые круглодонные колбы с притертыми пробками по 20 мл каждого хлороформного экстракта (2/3 от цельного количества), осторожно сливая хлороформ с осадка или отфильтровывая его от порошка сернокислого натрия. Экстракцию хлороформом определяемого гормона из гомогената и стандартного раствора, формирование окрашенного комплекса с фенилгидразиновым реактивом, фотометрический учет результатов осуществляется исходя из того, что из двух проб ткани - после гидролиза каждая первая проба будет служить контрольной на неспецифическую окраску, развивающуюся от действия серной кислоты. Поэтому к каждой первой пробе прибавляем по 4 мл спиртового раствора серной кислоты без фенилгидразина, а к каждой второй пробе и стандартному раствору (1 мл стандартного раствора выпариваем досуха, а затем растворяем в 20 мл хлороформа) приливаем по 4 мл спиртового раствора серной кислоты с фенилгидразином. Все колбы плотно закрываем притертыми пробками и энергично встряхиваем на протяжении 2 мин. Оставляем их, в штативе для расслаивания фаз, а затем капиллярной пипеткой, соединенной с водоструйным насосом, отсасываем нижний, хлороформный слой. Для развития окраски все пробы с реактивами инкубируем в водяной бане при 60 с в течение 20 мин, затем охлаждаем в водопроводной воде.

Измерение интенсивности окраски производим на спектрофотометре в кюветах с толщиной слоя 10 мм при длине волны 410 нм или на ФЭКе с синим светофильтре. Компенсационной жидкостью служит чистый реактив - спиртовой раствор серной кислоты. Оптическую плотность опытных проб и стандартного раствора измеряем путем сравнения с абсорбцией спиртового раствора серной кислоты с фенилгидразином.

Количество свободного гормона определяем по формуле:

Х(мг) = С₁ d, или С₂ 3 d

5 2/3 1000 5 2 1000

Где, С₁/(10 . 2/3) - содержание (мкг) суммарного 11-диоксикортизола в 1 мл гомогената ткани (10 - количество гомогената ткани, мл, в пробе, 2/3 - часть хлороформного экстракта использованного для анализа), d - масса ткани взятой для приготовления гомогената (мг), 1000 - коэффициент для перевода из мкг в мг.

Х(мг) = 66,6 . 10 = 666 = 20 мг

5 2/3 1000 5 6,66 1000

Подобным образом рассчитываем количество свободного гормона для всех 4 проб гомогената:

Х(мг)₂ = 28 мг Х(мг)₃ = 22 мг Х(мг)₄ = 26 мг

Как видно, на долю свободного 11-диоксикортизол в тканях приходится от 2-3% общего его количества.

Определение уровня гормона 11-диоксикортизол в периферической крови по его флюоресценции в серно-спиртовом реактиве

Способ определения суммарного содержания гормона 11-диоксикортизола в плазме крови включает в себя этапы сбора и хранения материала, выделения из него 11-диоксикортизола (экстракция, очистка экстракта), количественного исследования. Для этих целей мы использовали колориметрический метод, в основе которых лежит реакция с фенилгидразином (наиболее специфична), 2,4 -денитрофенилгидразином, восстановление солями тетразолия (на 20, 21 - кетоловую группу) и с гидрозидом изоникотиновой кислоты (Камышников В.С., Т II, 2003).

Рис. 4. Схема получения гормона 11-диоксикортизол (гомогенация и экстракция): a - образец ткани, b - центрифугирование гомогената, c -экстракция, d - инкубация образца, e - очистка гормона, е1 - чистый образец гормона

Выделение экстракцией из плазмы крови 11-диоксикортизола, имеющего гидроксилы при 11-м углеродном атоме и Д⁴-3-кетогруппировку в кольце А, обнаруживаем флюоресценцию после обработки проб смесью концентрированной серной кислоты и этилового спирта. Эта реакция позволяет определять концентрацию гормона в любое время в особенности в норме и после воздействия стрессорных факторов на организм миноги, рыб и крыс. Отдельно параллельно подготавливаем экспериментальных животных. Для этого карася и сазана в аквариумах подвергаем стрессовым нагрузкам с изменением температурного режима на протяжении 4 дней по 40 мин каждый день и другую контрольную группу таких же рыб подвергаем заражению культурой. Отбор крови на исследование гормона проводим у рыб через 4 суток во всех группах. Лабораторных крыс делим тоже на две группы: опытную и контрольную. Опытную подвергаем холодовым и тепловым воздействиям с изменением температуры от + 42⁰ до -25⁰С, голоданием на протяжении 4 суток и световым раздражением. У миноги большое влияние на синтез гормона оказывает питуитарный вырост, очень чувствительный к свету. В зависимости от освещенности синтез и концентрация гормона меняется, усиливается или полностью прекращается. Например, помещая нерестящихся особей в аквариум находящийся в совершенно темном помещении на 2 часа, после была взята кровь на определение концентрации гормона. Колебания составили 0,200-400 мкМ/л. Активность гормона, полученного из тканей особей находившихся в темноте проверяли введением лабораторным крысам и особых изменений никаких при этом не наблюдалось. При введении этим же животным гормона от нерестящихся миног живших в обычных условиях вызвали эффект стимуляции к половому сношению, усиливались обменные процессы, увеличивалось восприимчивость к стрессорным воздействиям, они практически были не подвержены.

Реактивы:

1. Гексан (нормальный)

2. Хлороформ или метилендихлорид(для наркоза)

3. 0,2 н раствор углекислого натрия

4. этиловый спирт, дважды перегнанный

5. концентрированная серная кислота, выдерживающая пробу Саваля

6. реактив, выдерживающий флюоресценцию кортикостероидов, смесь концентрированной серной кислоты и этилового спирта в отношении 3:1

7. стандартный раствор гидрокикортизона и кортикостерона. Концентрация и соотношение этих гормонов по возможности должны быть близкими к их содержанию в исследуемой плазме крови. При исследовании 11-диоксикортизола в плазме мы использовали две стандартные пробы: первая в 100 мл раствора содержит 20 мкг гидроксикортизона и 5 мкг кортикостерона. Стандартные пробы готовим следующим образом: навеску кортикостероидов растворяем в 10-15 каплях спирта, объем раствора доводят водой до получения нужных разведений, и храним в холодильнике.

8. культура диоксикортизол нейрон антистрессовый мозг

Ход определения: 0,8-1,0 мл крови собираем в пробирку инсулиновым шприцем из сердца живой миноги, карася, сазана или лабораторных крыс, содержащую гепарин в качестве антикоагулянта. Плазму отделяют от эритроцитов центрифугированием при 3000 об/мин (на центрифуге типа ОПН-3) в течение 20 мин. Ее можно держать несколько суток в холодильнике. В мерную пробирку с притертой пробкой помещаем 1,0 мл плазмы и доливаем к ней 3,0 мл гексана. После энергичного встряхивания пробирки в течение 1 минуты гексан отбираем микропипеткой на 200 мл, остаток гексана удаляем отгонкой на водяной бане при 40⁰С. К плазме добавляем 10,0 мл хлороформа и после встряхивания пробирки на протяжении 1 мин плазму отбираем тем же способом, что и гексан. Экстракт промывают сначала 0,5 мл раствора карбоната натрия (1мин), а затем 0,5 мл дистиллированной воды (1 мин), которые также удаляют с помощью пастеровской пипетки. 8,0 хлороформного экстракта переносят в чистую пробирку на 15,0-20,0 мл с притертой пробкой, куда доливают 2,5 мл смеси концентрированной серной кислоты и этилового спирта (3:1), приготовленный перед применением. После встряхивания в течение 1 мин хлороформ удаляют и через час флюоресценцию проб измеряем на флюориметре.

Флюориметрия осуществляется при двух длинах волн: 475 нм (для возбуждения флюоресценции) и 530-550 нм (для выделения максимума спектра флюоресценции), что достигается с помощью интерференциональных светофильтров. Концентрацию гормона рассчитываем по формуле:

Х (мкг/л) = Ф_оп С_ст:Ф_ст

где Ф_оп и Ф_ст - флюоресценция опытной и стандартной проб (число делений показывающего прибора),

С_ст - концентрация гормона 11-диоксикортизола в одной из двух стандартных проб (мкг/л). Мы берем обычно величину С_ст/Ф_ст берут средней из всех определений стандартных проб.

Коэффициент преобразования мкг/дл в мкмоль/л - 0, 0276.

В плазме периферической крови миноги содержится 0,358-0,984 мкМ/л в период нереста (середина марта - первая половина апреля). Полученные таким же способом результаты при стрессовой нагрузке (применялись световой раздражитель, повышение температуры до + 31 - 32⁰С, химические факторы - добавление в воду слабого раствора яблочной кислоты, нитраты) дали следующие результаты: при добавлении яблочной кислоты и нитратов концентрация гормона возросла и была равна 0,996 мкМ/л при полученной в нормальном физиологическом состоянии 0,756 мкМ/л. При действии светового раздражения в течении 25 мин количество гормона также увеличилось до 0,894 мкМ/л (в норме 0,675 мкМ/л). При повышении температуры до + 32⁰С - 0,992 мкМ/л при нормальных показателях (0,543 мкМ/л).

У лабораторных крыс после исследования концентрации и активности гормона определялись общие липиды в сыворотке крови. Это было необходимо для понимания способности формировать вместе с белками структурные комплексы в живых клетках. Сам гормон 11-диоксикортизол - это гормон липидного характера, являющийся производным стероида кортизола, синтезируемый с жирных кислот и холестерина.

Определение общих липидов проводили в сыворотке крови по цветной реакции с сульфофосфованилиновым реактивом.

Принцип метода: продукты распада ненасыщенных липидов образуют с реактивом (состоящий из серной, ортофосфорной кислот и ванилина) соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию общих липидов в сыворотке крови.

Реактивы:

1. Серная кислота, концентрированная, для пробы Саваля.

2. Ортофосфорная кислота, концентрированная.

3. 6 г/л водный раствор ванилина, 0,6 г ванилина растворяем в небольшом количестве дистиллированной воды при нагревании смеси на водяной бане; после охлаждения объем доводят водой до 100 мл.

4. фосфорнованилиновая смесь. 4 объема концентрированной ортофосфорной кислоты смешиваем с одним объемом 6 г/л раствора ванилина.

5. хлороформ, х. ч.

6. основной (12,0 г/л) стандартный раствор триолеина.

Ход определения. К 0,05 мл сыворотки прибавляем 2,5 мл концентрированной серной кислоты. Содержимое пробирки тщательно перемешиваем и помещаем на 10 мин в кипящую водяную баню. Пробирку вынимаем и сразу же охлаждаем водопроводной водой до комнатной температуры. Из пробирки отбираем 0,2 мл смеси, которую переносим в другую пробирку, содержащую 3 мл фосфорнованилиновой смеси. После тщательного перемешивания пробы оставляем на 45 мин в темноте при комнатной температуре. Абсорбцию измеряем при длине волны 525 нм (500 - 560 нм). В случае применения фотоэлектроколориметра используем зеленый светофильтр и кювету с толщиной слоя 5 мм. Результаты сравниваем с аналогичными данными контрольной пробы.

Контрольную пробу ставим так же, как опытную, но вместо сыворотки берем 0,05 мл воды (Камышников В.С., Т II, 2003).

Расчет производим по формуле или по калибровочному графику.

С_оп(г/л) = А_оп : А_ст . С_ст

где А - абсорбция опытных и стандартных проб, С_ст - концентрация основного стандартного раствора (12,0 г/л).

Нормальные значения липидов в сыворотке крыс - 2,0-6,0 г/л.

У нас получились следующие данные:

С_оп(г/л) = А_оп : А_ст . С_ст = 5,8 : 12,0 . 12,0 = 5,8 г/л.

Для того чтобы понять механизм действия определенной концентрации гормона 11-диоксикортизол на клетки и организм в целом мы провели опыт подтверждающий наглядно транспорт гормона, его рецепцию, взаимодействие с геномом нейронов, поступление в головной мозг, соединение с сератонином, вхождение в фосфолипиды и жировую ткань (Розен, Смирнов, 1981). Эксперимент включал в себя введение светящегося белка люцеферина.

Задача: провести наблюдения и исследовать на подопытных животных процесс и начало синтеза гормона 11 - диоксикортизол, его движение по крови от надпочечников, оказываемые им нейрохимический эффект. Изучить степень влияния гормона в ответ на стресс, тепловое, холодовое и солевое воздействия на скорость синтеза, его количество и пути мобилизации.

Принцип метода: естественный белок люцеферин обладает люминесцентным эффектом в живых тканях. Его введение в надпочечниковую железу животных вызывает его соединение с гормоном 11-диоксикортизол в железе и выброс его в кровь с поступлением через плазматическую мембрану непосредственно соединяясь с рецепторными белками нейронов по всему организму. Проникая в геном клеток, люцеферин позволяет проследить в онлайн - времени на МРТ движение гормона, весь процесс взаимодействия с клетками и тканями до момента его распада в печени.

Приборы и реактивы:

1. оборудование МРТ

2. конфокальный микроскоп

3. белок люцеферин КФ 1.13.12.7

Постановка опыта: исследование проводили на лабораторных крысах линии Вистар. Живым животным при нормальных условиях вводили белок люцеферин в надпочечниковую часть почек (в обе почки). Используем в данном эксперименте люминесцентный белок - люцеферин светлячка (Photinus pyralis) КФ 1.13.12.7. Так как гормон 11-диоксикортизол минералокортикоид и содержит в своем составе многие минералы в том числе Са²⁺, он люминесцентен в присутствии ионов именно Са²⁺. В две почки вводим в количестве 0,01-0,05 мл белка и через 0, 5 сек после начала введения с помощью МРТ томографии наблюдаем соединение ярко люминисциирующего светло-зеленого цветом белка с гормоном 11-диоксикортизол in vivo. Интенсивность сигнала при томографии in vivo зависит от различных факторов, таких как абсорбция D - люцеферина в брюшной полости и крови (как в нашем случае), проницаемости клеточных мембран, доступности ко-факторов, рН внутри клеток. По тому, как начинает происходить движение окрашенного гормона в кровяном русле фиксируем время проникновения в клетки головного мозга, спинного мозга (0, 11 с. для спинного мозга) и (0, 14 с. для головного мозга). Время процесса проникновения гормона через клеточные мембраны составило 0,02 с. Активация гормоном ДНК достигается через 0,04 с после проникновения его через клеточную мембрану. Ферменты начинают продуцироваться спустя 0, 03 с. Исследование проводится больше визуально, наблюдая процессы на МРТ, а отдельные моменты смотрим с помощью конфокальной микроскопии на отдельно взятых образцах клеток и крови. Клетки активируются, и жизнеспособность клеток увеличивается, происходит увеличение синтеза теломеразы, транспозазы, альфа-амилазы, фосфатазы, аминотрансферазы, альдолазы, липазы и др. распад и процесс мобилизации гормона от момента синтеза до его полного выведения происходит за 3 часа. 10% гормона 11-диоксикортизол циркулирует в свободной физиологически активной форме, и выделяется с каловыми массами (у миног) и мочой у крыс, мышей и человека в нематобилизированной форме.

Результаты и обсуждения. Результатами исследований являются следующие полученные данные:

Стероидогенез протекает почти при идеальных условиях. Вот какие данные мы получили, исследуя и сопоставляя все химические составляющие: достаточное наличие запасов липидов и триацилглицеридов, полный синтез жирных кислот, синтез холестерина, температура при протекании реакции +28⁰,температура окружающей среды (воды) +16-+18⁰С, поступление в организм таких минералов как Сa²⁺, солевой состав воды равен по жесткости (рН - 114%₀), достаточное освещение, очень высокая скорость синтеза рецепторных белков, высокая скорость распада гормона и его метаболитов в печени, высокая скорость транспорта гормона, синтез специфических белков, быстрое дедепонирование жиров для стероидогенеза, высокая метаболическая зависимость: запас липидов - гормон - метаболические процессы - гормон (стероидогенез).

Сопоставляя полученные данные, можно сказать, что данные условия синтеза гормона считаются идеальными, так как получены в природных, и подтверждены в лабораторных условиях.

Количество гормона 11-диоксикортизол полученного с гомогената тканей миноги: Х(мг)₁ = 20 мг Х(мг)₂ = 28 мг Х(мг)₃ = 22 мг Х(мг)₄ = 26 мг, что говорит как видно, на долю свободного 11-диоксикортизол в тканях приходится от 2-3% общего его количества.

В плазме периферической крови миноги гормона 11-диоксикортизол содержится 0,358-0,984 мкМ/л в период нереста (середина марта - первая половина апреля). Полученные таким же способом результаты при стрессовой нагрузке (применялись световой раздражитель, повышение температуры до +31- +32⁰С, химические факторы - добавление в воду слабого раствора яблочной кислоты, нитраты) дали следующие результаты: при добавлении яблочной кислоты и нитратов концентрация гормона возросла и была равна 0,996 мкМ/л при полученной в нормальном физиологическом состоянии 0,756 мкМ/л. При действии светового раздражения в течении 25 мин количество гормона также увеличилось до 0,894 мкМ/л (в норме 0,675 мкМ/л). При повышении температуры до + 32⁰С - 0,992 мкМ/л при нормальных показателях (0,543 мкМ/л).

Общие липиды, полученные при исследовании у крыс равны - 5,8 г/л., что составляет нормальные значения.

При использовании люминисциирующего белка - люцеферина КФ 1.13.12.7 время проникновения гормона в клетки головного мозга, спинного мозга составил (0, 11 с. для спинного мозга) и (0, 14 с. для головного мозга). Время процесса прохождения гормона через клеточные мембраны составило 0,02 с. Активация гормоном ДНК достигается через 0,04 с после проникновения его через клеточную мембрану. Ферменты начинают продуцироваться спустя 0, 03 с. Исследование проводится больше визуально, наблюдая процессы на МРТ, а отдельные моменты смотрим с помощью конфокальной микроскопии на отдельно взятых образцах клеток и крови. Гормон 11-диоксикортизола стимулирует продукцию самотропина и регулирует его в гипоталамусе по портальной системе кровообращения, связывающей сетью своих широко разветвленных капилляров гипоталамус с паренхимой передней доли гипофиза, 11-диоксикортизол перемещается в нее и стимулирует функцию базофильных клеток гипофиза. В крови 11-диоксикортизол связан с белком транскортином и с альбумином, а также с тестостерон-эстрадиолсвязывающим глобулином. Клетки активируются, и жизнеспособность клеток увеличивается, происходит увеличение синтеза теломеразы, транспозазы, альфа-амилазы, фосфатазы, аминотрансферазы, альдолазы, липазы и др. распад и процесс мобилизации гормона от момента синтеза до его полного выведения происходит за 3 часа. 10% гормона 11-диоксикортизол циркулирует в свободной физиологически активной форме, и выделяется с каловыми массами (у миног) и мочой у крыс, мышей и человека в нематобилизированной форме. Молекулы гормона 11-диоксикортизол содержатся в достаточно небольшой концентрации в крови (10%), остальная часть находится в мышцах и надпочечниках (80%) - 10^-9. Но количество молекул, соответствующее этой концентрации, огромно (10¹⁷ молекул/л) - триллионы молекул в 1 л (Комов, Шведова, 2008). Это большое количество молекул делает возможным их влияние на каждую отдельную клетку организма и регуляцию ею специфических процессов. 11-диоксикортизол легко проникает внутрь клетки через плазматические мембраны клетки. Результатом его действия является глубокая длительная перестройка клеточного метаболизма. Гормон оказывает существенное влияние на водно-солевой обмен. Любое интенсивное воздействие на организм приводит к появлению в организме стресс-реакций, лучше всего определяемых по состоянию надпочечников, их весу и химическому составу или по выделению в кровь и содержанию в тканях стресс-гормона - 11-диоксикортизола. Воздействие высокой температуры воздуха на организм животных вызывает резкое повышение функционального состояния коры надпочечников, которое проявляется в увеличении веса надпочечников и содержании эозинофилов в периферической крови. Эти сдвиги зависят от величины теплового воздействия. При гипоксии у миног, рыб и крыс наблюдается повышение концентрации 11-диоксикортизола в крови. При длительном воздействии стрессовых условий, нормализуется не только вес надпочечников и гипофиза, но и содержание гормона в тканях (Эколог. физиология животных, АН СССР, 1979). Это соответствует стадии резистентности общего адаптационного синдрома к агенту, вызывающему реакцию. Роль гипофиза и коры надпочечников в период, когда адаптация уже достигнута, заключается в качественном изменении секреции гормона. Изменяется количество гормона 11-диоксикортизола. Его выделяется меньше, но его молекул становятся крупнее, изменяется соотношение между другими гормонами и гормоном 11-диоксикортизол, это формируется специфическая адаптация.

Рис. 5. Гистограмма концентрации гормона 11-диоксикортизол полученные при гомогенизации тканей экспериментальных объектов

Рис. 6. Гистограмма изменения концентрации и синтеза гормона 11-диоксикортизол в норме и после стимуляции стрессорными факторами (по группам: 1 - свет, 2 - химический раздражитель, 3 - температура)

Выводы

Надпочечники - парные эндокринные железы, расположенные у верхних полюсов почки миноги. Их масса составляет около 0,5-0,8 мг. Надпочечниковая железа состоит из двух слоев: внутреннего и наружного, формирующегося из симпатического ганглия, и наружного коркового, образующегося из мезодермальной ткани, из которой также закладываются гонады. Этим и объясняется химическое сродство гормона коры надпочечника (11-диоксикортизол) и половых гормонов. Таким образом, надпочечник представляет собой соединение двух самостоятельных эндокринных желез, два основных гормона которых отличаются друг от друга, как по химическому строению, так и по механизму действия: внутренний слой продуцирует адреналин, наружный - минералокортикоид 11-диоксикортизол. На корковый слой надпочечника приходится до 2/3 массы железы. Вырабатываемый ею гормон 11-диоксикортизол влияет на метаболизм белков (иммуноглобулины, рецепторные белки), липидов, углеводов и электролитов. Он участвует в регуляции кровяного давления, деятельности ЦНС, почки, половой функции, в формировании реакции организма на “стресс” и воспаление. По химической природе гормон коры надпочечника 11-диоксикортизол является стероидом (в его основе лежит углеводород циклопентанпергидрофенантрен, что обуславливает схожесть химического строения стероида с таковым половых гормонов, холестерола, провитамина D и желчных кислот). Вырабатывается он в наружном (клубочковом) слое коры надпочечника (Гонский, Максимчук, 2001). Также, внутренней зоной коры надпочечника продуцируется прогестерон, промежуточный продукт биосинтеза гормона 11-диоксикортизол. Оказывает выраженное действие на водно-электролитный обмен. У миноги общее количество гормона достигает 80% от общего количества гормонов в организме.

Гормон 11-диоксикортизол является основным (физиологически весьма активный) в организме миноги гормоном. 10% гормона постоянно циркулирует в кровяном русле в свободной форме. Является гормоном антистресса и защищает организм от любых резких изменений физиологического равновесия, воздействуя на метаболизм белков, углеводов, липидов, электролитный баланс. Обладает эффектом действия половых гормонов (в основном мужских). Вызвав биологический эффект гормон подвергается катаболическим превращениям в печени (отчасти в почках). При этом происходит окисление боковой цепи, располагающейся в структуре молекулы гормона у 17-го атома углерода, в результате чего образуются 17-кетостероиды. В патологии, адекватность уровней гормональной регуляции зависит не только от качества и количества формирующегося гормонального сигнала и его своевременного поступления в нейроны, но и от соответствующего настроя рецепторных белков на прием и узнавание поступающего сигнала. В перспективе синтетический аналог гормона можно применять в медицине при лечении генетических дефектов рецепции андрогенов, антистрессовой защите организма, бесплодии, при нарушении синтеза или рецепции половых гормонов при патологии беременности, при диабете, при рассасывании опухолей рака молочной железы, рака эндометрия, рака аденомы простаты, гепатомы, при опухолях лимфоидной ткани, лейкозе, раке почек, меланоме, опухолях семенников, миоме матки, яичников, альвеолярной карциноме легких, опухоли аденогиповиза, иммунопатологий лейкоцитов. Гормон 11-диокcикортизол положительно влияет на ДНК клетки, стимулируя в ней как синтез собственных нуклеотидных последовательностей так и синтез ферментов.

Рис. 7. Нейрогуморальная регуляция жирового обмена гормоном 11 - диоксикортизол

Использованная литература

1. M. Kottelat, J. Freyhof, The Freshwater fishes of Europe/Berlin, Germany, 2007;

2. Holсhik J., Renaud C.B., The Freshwater fishes of Europe/Berlin, Germany, 1986;

3. Claude B. Renaud, Lampreys of the World/Rome, 2011;

4. Иванова - Берг М. М., О личинках миног. Вопр. Ихтиол., т. 2, вып. 3, АН ССР/ Москва, 1962;

5. В.А. Абакумов, Систематика и экология украинской миноги // Вопр. Ихтиол. Т6, вып. 4(41), 1966;

6. Пучков Н.В., Физиология рыб, М.:, 1982, стр. 36 - 44;

7. Камышников В.С., Клинико-биохимические методы исследований // Т II, Минск, 2003, стр. 370 - 373;

8. Камышников В.С., Клинико-биохимические методы исследований // Т II, Минск, 2003, стр. 109 - 110;

9. Розен В.Б., Смирнов А.Н., Рецепторы и стероидные гормоны, Изд-во МГУ, 1981, стр. 66 - 70;

10. Комов В.П., Шведова В.Н., Биохимия: учебник для вузов - 3-е издание, стереотипное - М.: Дрофа, 2008 - 638 с., стр. 157 - 159;

11. Экологическая физиология животных// АН СССР, - Л.: Наука, 1979, стр. 126 - 132;

12. Я.И. Гонский, Т.П. Максимчук, Биохимия человека // Тернополь - Укрмедкнига, - 2001, стр. 355 - 365.

Размещено на Allbest.ru