Интенсивность процессов перекисного окисления липидов в мозге сусликов в динамике зимней спячки

Размещено на http://www.allbest.ru/

Интенсивность процессов перекисного окисления липидов в мозге сусликов в динамике зимней спячки

Абдуллаев В.Р.

Зимняя спячка млекопитающих является природной адаптацией к низким температурам окружающей среды. Гибернация сопровождается значительным снижением температуры тела, сердечных ритмов, потребления кислорода, уровня метаболизма, и других физиологических и биохимических параметров (Wang, Lee, 1996; Geiser, 2004). При этом биохимические процессы в организме зимоспящих животных перестраиваются так, что даже при очень низкой температуре тела поддерживается определенный гомеостаз (Carey et al., 2003).

Зимняя спячка грызунов является прерывистым процессом. Каждые 10-15 дней животные пробуждаются и через короткое время (2-24 ч.) снова входят в спячку и выход из нее являются потенциально опасными периодами (Toien et al., 2001). Именно в эти периоды у животных происходит резкая смена одного метаболического состояния на другое. Изменение физиологического состояния животного в эти периоды сопровождается ишемией, реперфузией, повышением потребления кислорода, интенсификацией работы многих ферментных комплексов (Hermes-Lima, Zenteno-Savin, 2002; Storey, Storey, 2004). В результате этого в тканях зимоспящих животных интенсифицируются процессы образования активных форм кислорода (АФК) (Toien et al., 2001).

Несмотря на потенциальную возможность активации процессов образования активных форм кислорода, в тканях зимоспящих животных не возникают патологические изменения (Frerichs et al., 1994; Frerichs, Hallenbeck, 1998). Отсюда можно предположить, что ткани гибернирующих животных обладают устойчивостью к свободнорадикальным процессам. Однако, в настоящее время не вполне понятно, каким образом регулируются свободнорадикальные процессы в тканях гетеротермных животных в период зимней спячки. грызун гибернация липид антиоксидант

В связи с вышеизложенным в задачу нашего исследования входило установление закономерностей изменения интенсивности процессов перекисного окисления, липидов (ПОЛ) и активность антиоксидантной защиты головного мозга сусликов при гибернации.

Объект и методы исследования. Эксперименты проведены на 30 малых сусликах (Citellus pygmaeus Pallas) (массой 200-250 г), являющийся типичным представителем зимоспящих животных (Калабухов, 1985). Грызунов отлавливали в районе Буйнакского перевала (Республика Дагестан) весенний период и до наступления холодов содержали в обычных условиях вивария на смешанном растительно-зерновом рационе. Для индукции зимней спячки сусликов переводили в темное и неотапливаемое помещение.

Известно, что биохимические процессы, происходящие в организме зимоспя-щих, зависят от глубины и длительности периода спячки (Лапинский, Невретдинова,. 1991; Wang, Lee, 1996). В связи с этим исследовали животных в динамике зимней спячки в следующие сроки:

1) Перед спячкой в начале октября;

2) Кратковременная спячка (температура тела 10-12°С);

3) Через 1 месяц с момента впадения в спячку (температура тела 5-8°С);

4) Через 3 месяца с момента впадения в спячку (температура тела 3-4°С);

5) Через 6 месяцев с момента впадения в спячку (температура тела 14-15°С);

6) Через 14 дней после окончательного пробуждения от 6-ти месячной зимней спячки.

Об интенсивности пероксидации липидов в головном мозге судили по содержанию одного из промежуточных продуктов ПОЛ - малонового диальдегида (МДА). Содержание МДА в головном мозге определяли по реакции с тиобарбитуровой кислотой (Стальная, Горишвили., 1977). О содержании изолированных двойных связей и диеновых конъюгатов в гептановых и изопропанольных экстрактах липидов мозга судили по поглощению в ультрафиолетовой области спектра (Волчегарский и др., 1989).

Об антиокислительной активности (АОА) гидрофильных компонентов головного мозга судили по кинетике окисления восстановленной формы 2,6-дихлорфенолиндофенола кислородом воздуха в присутствии и отсутствии биологического материала (Семёнов, Ярош, 1985). Метод определения активности СОД основан на способности фермента ингибировать процесс восстановления нитро-синего тетразолия в условиях генерации супероксидного анион-радикала (Fried, 1975). Об активности каталазы судили по скорости убыли перекиси водорода в среде инкубации (Королюк и др., 1990).

Результаты исследования и их обсуждение. По нашим данным перед залеганием в зимнюю спячку в полярных липидах коры головного мозга сусликов достоверно повышается уровень изолированных двойных связей. Параллельно с повышением ненасыщенности липидов происходит существенное увеличение (на 75%) содержания первичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов (ДК). Однако это не приводит к повышению уровня промежуточного продукта ПОЛ - МДА (табл. 1).

Таблица 1.Содержание изолированных двойных связей и продуктов ПОЛ в головном мозге сусликов на этапах зимней спячки (n=10)

Примечание: Здесь и в таблицах 2 звёздочки означают достоверные различия по отношению к контролю (Р < 0.05).

Кратковременная зимняя спячка сопровождается достоверным падением в головном мозге уровня изолированных двойных связей, одновременно снижается содержание ДК и МДА. Через месяц после впадения животных в спячку в головном мозге сусликов содержание изолированных двойных связей и МДА снижается, а ДК повышается. В головном мозге сусликов при 3-х месячной спячки резко повышается содержание изолированных двойных связей и ДК по сравнению с контрольными животными. При этом содержание МДА в головном мозге существенно не изменяется. Содержание изолированных двойных связей и продуктов ПОЛ в головном мозге сусликов остается высоким и после 6-ти месячной спячки, а также после окончательного пробуждения животных (табл.1).

Отсутствие прямой зависимости между содержанием изолированных двойных связей, диеновых конъюгатов и МДА в коре головного мозга сусликов в состоянии гибернации можно объяснить процессами, сопровождающимися обрывом цепи ПОЛ на его различных участках и соотношением интенсивности образования продуктов ПОЛ и их утилизацией или восстановлением (Костюк, 1985; Antunes et al., 1994).

Свободные радикалы и продукты ПОЛ играют в клетке роль сигнальных молекул как непосредственно, так и опосредовано. Изменение в экспрессии генов на разных этапах баута во время зимней спячки указывает на регулируемость величины сигнала (Bitting et al., 1999; O'Hara et al., 1999; Lee et al., 2002). Основная роль в регуляции величины сигнала во время зимней спячки ложится на антиоксидантную систему организма. Известно, что для реализации сигнала достаточны субтоксические концентрации 10-9 - 10-12М АФК. Выход за пределы физиологических концентраций АФК сопровождается окислительным стрессом и влечёт за собой индукцию факторов генного ответа, отвечающих за синтез тех или иных апоптозных или антиапоптозных белков (Carey et al., 2003).

В связи с этим представляется важным исследование активности антиоксидантной системы в коре головного мозга в период гибернации.

Таблица 2. Активность компонентов антиоксидантной защиты головного мозга сусликов на этапах зимней спячки (n= 10)

Как видно из табл. 2, осенью, перед погружением в спячку, в коре головного мозга сусликов активность СОД снижается в 2 раза, активность каталазы возрастает в 2,5 раза. Известно, что перед впадением в спячку интенсивность метаболизма снижается до падения температуры тела (Geiser, 1988; Armitage et al., 2003; Geiser, 2004). Видимо, активность СОД на данном этапе регулируется интенсивностью метаболизма, в частности, интенсивностью дыхания, которая является основным источником супероксидного радикала. Известно, что синтез СОД активируется при повышении уровня супероксидного радикала. Повышение активности каталазы адекватно уровню пероксида водорода, который в свою очередь подавляет активность CuZn-СОД (Lievre et al., 2001). За увеличение концентрации H2O2 в нервной ткани отвечают многочисленные процессы, но основные из них - электронтранспортная цепь митохондрий и метаболизм нейромедиаторов. Как сообщается в работе Э. Каденаса и К. Дейвиса (Cadenas, Davies, 2000), скорость образования и концентрация H2O2, создаваемая при работе митохондриальной моноаминооксидазы, на порядок выше, чем при работе СОД. На высокий уровень этих процессов в период спячки указывает динамика изменений нейромедиаторов в различных структурах мозга и в спинномозговой жидкости (Reid et al., 1992; Michaelidis et al., 2002).

Самая низкая активность СОД в головном мозге сусликов наблюдается при кратковременной и месячной спячке (табл. 2). Резкое снижение активности СОД в мозге сусликов в начальных этапах спячки, видимо, обусловлено подавлением дыхания и гипоксическими явлениями (Frerichs, Hallenbeck, 1998). В головном мозге при гипоксии, несмотря на повышение содержания мРНК, отвечающей за синтез СОД, активность фермента достоверно снижается из-за высокого уровня гидроксильного радикала и пероксида водорода (Lievre et al., 2000).

По мере углубления гибернации активность СОД в головном мозге сусликов постепенно повышается, но остаётся значительно ниже контроля. Только к концу спячки, после 6-ти месяцев гибернации активность СОД существенно (96%) возрастает (табл. 2).

Конец 6-ти месячной спячки приходится на март и апрель. В это время суслики готовятся к выходу из спячки. Температура тела животных возрастает до 14-150С, они изменяют позу. Активация желез внутренней секреции и повышение концентрации гормонов в этот период способствует усилению обмена веществ (Ильясова, Колаева, 1985; Лапинский, Невретдинова, 1991). Как свидетельствуют наши данные (табл. 2), в отличии от СОД, активность каталазы в коре больших полушарий мозга сусликов повышается при подготовке к зимней спячке, а на этапах кратковременной, 1-, 3-х- и 6-ти месячной спячки снижается, но остается выше контрольного уровня. Высокая активность каталазы в период зимней спячки, видимо, необходима для поддержания низкой концентрации пероксида водорода в нервной ткани, что предотвращает образование высокореактивного гидроксильного радикала (Tarpey, Fridovich, 2001). Как было отмечено выше, конец сезона гибернации (6-ти месячная зимняя спячка) сопровождается максимальной активацией эндокринной системы, которая подготавливает организм к выходу животного из состояния спячки (Ильясова, Колаева, 1985; Дёмин и др., 1988). При этом частота дыхания и сердцебиения увеличиваются, усиливается кровоток в органах. Активация нейрональной NO-синтетазы усиливает кровоток именно тех участков мозга, которые наиболее активны и нуждаются в усилении обмена веществ. Супероксид, образующийся при этом, и продукт его взаимодействия с NO - пероксинитрит токсичны для железосодержащих ферментов (Brown, 1999; Rob et al., 1999), что может быть причиной снижения активности каталазы в данный период. Считают (Drew et al., 2004; Ma et al., 2004), что наряду с антиоксидантными ферментами важную роль в регуляции свободнорадикальных процессов, играют низкомолекулярные гидрофильные антиоксиданты. Исследование гидрофильных антиоксидантов в коре головного мозга сусликов показало (табл. 2), что их уровень перед погружением в спячку более чем в 2 раза превышает летний контрольный уровень. Высокая активность низкомолекулярных гидрофильных антиоксидантов сохраняется и вначале гибернации. Однако, после месячной спячки АОА гидрофильных компонентов мозга снижается до контрольного уровня.

Видно, что между активностью каталазы и активностью компонентов низкомолекулярных гидрофильных антиоксидантов в этот период имеется прямая зависимость. Такая зависимость, с одной стороны, указывает на интенсификацию процесса образования пероксида водорода, что может сопровождаться образованием гидроксильного радикала, с другой стороны на увеличение уровня компонентов низкомолекулярных гидрофильных антиоксидантов, в основном, аскорбиновой кислоты, которая эффективно обезвреживает гидроксильный радикал (Buettner 1993; Rice 2000). Судя по динамике продуктов ПОЛ и активности антиоксидантной системы, в том числе и по активности низкомолекулярных гидрофильных компонентов, можно заключить, что опасность оксидативных повреждений клеток мозга в начальные периоды спячки невысока. Динамика роста уровня низкомолекулярных гидрофильных антиоксидантов в коре больших полушарий мозга сусликов во время оцепенения можно объяснить целенаправленным поступлением аскорбиновой кислоты в мозг из крови и спинномозговой жидкости. Так, по мнению Тоена и сотр. (Toien et al., 2001), снижение уровня аскорбиновой кислоты в плазме крови спящих сусликов в процессе пробуждения связано не только с ее метаболизмом, но и с обратным захватом ее органами и тканями, что объясняет повышение уровня АОА в мозге на этапах зимней спячки. Компенсация нехватки аскорбата в тканях головного мозга за счет высокого уровня ее в плазме крови и спинномозговой жидкости, очевидно, имеет адаптивный характер.

Таким образом, достаточно высокий уровень активности ферментативной и неферментативной антиоксидантной системы в мозге сусликов в динамике зимней спячки способствует поддержанию концентрации различных форм АФК в нервной ткани на определенном уровне, регулируя процессы свободнорадикального окисления макромолекул и внутриклеточной сигнализации. Поэтому изменения в содержании продуктов ПОЛ и активности антиоксидантной системы головного мозга сусликов в период спячки можно характеризовать как адаптивные явления, в противном случае, повышение продуктов пероксидации липидов на отдельных этапах зимней спячки сопровождалось бы не только патологиями и нарушением цикла гибернации, но и гибелью животного.

Литература

1. Волчегарский И.А., Налимов А.Г., Яровинский Б.Г., Лившиц Р.И. Сопоставление различных подходов к определению продуктов ПОЛ в гептан-изопропанольных экстрактах крови // Вопр. Мед. хим. - 1998. Т.35. - С. 127-181.

2. Дёмин Н.У., Шортанова Т.Х., Эмирбеков Э.З. Нейрохимия зимней спячки млекопитающих. Л.: Наука, - 1998. - 137 с.

3. Ильясова К.Н., Колаева С.Г. Цитофизиология коры надпочечников зимоспящих. Сб. науч. труд. Л.: - Наука, - 1985. - С.80-83.

4. Калабухов Н.И. Зимняя спячка млекопитающих. М.: Наука, - 1985. -260 с.

5. Королюк М.А., Иванова Л.К., Майорова И.Г., Токарева В.А. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело - 1990. - №.4. - С.44-47

6. Костюк В.А. Устойчивость продуктов окисления липидов в печени крыс и пути их утилизации // Биохимия.-1985. -Т.51. -С.1392-1397.

7. Лапинский А.Г., Невретдинова З.Г. Тиреоидный статус и обмен липидов у суслика Citellus parryi при гибернации // -1991 Изв. АН. СССР. - №3. - С.398-409.

8. Семенов В.Л., Ярош А.М. Метод определения антиокисительной активности биологического материала // Укр. биох. журн. - 1985. - Т.57. -С.50-52.

9. Стальная И.Д., Горишвили Т.Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитурой кислоты // Современные методы в биохимии. - М., 1977. - С. 66-68.

10. Antunes F., Salvador A., Marinho H.S., Pinto R.E. A mathematical model for lipid peroxidation in inner mitochondrial membranes // Travaux de Laboratoire (Instituto Rocha Cabral). - 1994. XXXIV, suppl. T-I. - P.1-55.

11. Bitting L, Watson F.L, O'Hara B.F., Kilduff T.S., Heller H.C. HSP70 expression is increased during the day in a diurnal animal, the golden-mantled ground squirrel Spermophilus lateralis // Mol Cell Biochem. - 1999. - V.199. - P.25-34.

12. Brown G.C. Nitric oxide and mitochondrial respiration // Biochim. Biophys. Acta. - 1999. - V.1411. - P.351-369.

13. Cadenas E, Davies KJ. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging // Free Radic Biol Med. - 2000. - V.29. - P.222-230.

14. Carey H.V., Andrews M.T., Martin S.L. Mammalian hibernation: cellular and molecular responses to depressed metabolism and low temperature // Physiol. Rev. - 2003. - V.83. - P.1153-11581.

15. DrewK.L., Harris M.B., LaManna J.C., Smith M.A., Zhu X.W., Ma Y.L. Hypoxia tolerance in mammalian heterotherms // J Exp. Biol. -2004. - V. 207. - P.3155-3162.

16. Frerichs K.U., Hallenbeck J.M. Hibernation in ground squirrels induces state and species-specific tolerance to hypoxia and aglycemia: an in vitro study in hippocampal slices // J. Cereb. Blood Flow Metab. - 1998. - V.18. - P.168-175.

17. Frerichs K.U., Kennedy C. Sokoloff L., Hallenbeck J.M. Local cerebral blood flow during hibernation, a model of natural tolerance to "cerebral ischemia" // J. Cereb. Blood Flow Metab. - 1994. - V.14. - P.193-205.

18. Fried R.. Enzymatic and non-enzymatic assay of superoxide dismutase // Biochimie. - 1975. - V.57. - P.657-660.

19. Geiser F. Metabolic rate and body temperature reduction during hibernation and daily torpor // Annu. Rev. Physiol. - 2004. - V.66. - P.239-274.

20. Hermes-Lima M., Zenteno-Savin T. Anima response to drastic changes in oxygen availability and physiological oxidative stress // Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. - 2002. - V.133. - P. 537-556.

21. Lee M., Choi I., Park K. Activation on stress signaling molecules in bat brain during arousal from hibernation // J. Neurochem. - 2002. - V.82. - P.867-873.

22. Lievre V., Becuwe P., Bianchi A., Bossenmeyer-Pourie C., Koziel V., Franck P., Nicolas M.B., Dauca M., Vert P., Daval J.L. Intracellular generation of free radicals and modifications of detoxifying enzymes in cultured neurons from the developing rat forebrain in response to transient hypoxia // Neuroscience. - 2001. - V.105. - P.287-297.

23. Ma Y.L., Rice M.E., Chao M.L., Rivera P.M., Zhao H.W., Ross A.P., Zhu X., Smith M.A., Drew K.L., Ascorbate distribution during hibernation is independent of ascorbate redox state // Free Radic. Biol. Med. - 2004. - V.37. - P.511-520.

24. Michaelidis B., Loumbourdis N.S., Karaki E. Analysis of monoamines, adenosine and GABA in tissues of the land snail Helix lucorum and lizard Agama stellio during hibernation // J. Exp. Biol. - 2002. - V.205. - P. 1135-1143.

25. O'Hara B.F., Watson F.L., Srere H.K., Kumar H., Wiler S.W., Welch S.K., Bitting L., Heller H.C., Kilduff T.S. Gene expression in the brain across the hibernation cycle // J. Neurosci. - 1999. - V.19. - P.3781-3790.

26. Reid M.S., Kilduff T.S., Romero L.M., Florant G.L., Dement W.C., Heller H.C. Monoaminc and metabolite levels in the cerebrospinal fluid of hibernating and euthermic marmots // J. Sleep. Res. - 1992. - V.1. - P.45-50.

27. Robb S.J., Gaspers L.D., Wright K.J., Thomas A.P., Conor J.R. Influence of nitric oxide on cellular and mitochondrial integrity in oxidatively stressed astrocytes. // J. Neurosci. Res. - 1999. - V.56. - P.166-176.

28. Storey K.B., Storey J.M. Metabolic rate depression in animals: transcriptional and translational controls // Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. - 2004. - V.79. - P.207-233.

29. Tarpey M.M, Fridovich I. Methods of detection of vascular reactive species: nitric oxide, superoxide, hydrogen peroxide, and peroxynitrite // Circ Res. - 2001. - V. 89. - P.224-236.

30. Toien O., Drew K.L., Chao M.L., Rice M.E. Ascorbate dynamics and oxygen consumption during arousal from hibernation in Arctic ground squirrels // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. -2001. - V.281. - P.572-583.

31. Wang L.C.H., Lee T.F. Torpor and hibernation in mammals: metabolic, physiological and biochemical adaptations // Handbook of Physiology. Eds. M.J. Fregly, C.M. Blatteis. N.Y.: Oxford Univ. Press. - 1996. - P.507-531.

Размещено на Allbest.ru