Классификация микроорганизмов и пропионовокислое брожение

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Контрольная работа

по микробиологии

Классификация микроорганизмов и пропионовокислое брожение

Раздел первый

микроорганизм бактерия пропионовокислое брожение

1.1 Мир микроорганизмов, общие признаки и их разнообразие

Вселенная состоит из живой и неживой материи. Наша планета Земля населена огромным количеством разнообразных живых существ, которые совместно с продуктами своей жизнедеятельности составляют биосферу. Представителей живой природы, начиная от сложных организмов -- человека и млекопитающих животных -- и кончая простейшими формами жизни -- микробами, условно можно разделить на две большие группы: макромир и микромир. К макромиру относятся все те представители живой материи, которых мы видим невооруженным глазом. Это все виды животных, птиц, растений, насекомых, гельминтов и т. д. К микромиру относятся многочисленные микроорганизмы, а также более просто устроенные формы живой материи, такие как вирусы и прионы, которые невидимы невооруженным глазом, но которых можно наблюдать с помощью оптических приборов -- микроскопов; лишь некоторые из них, например плесневые грибы и нитчатые бактерии, являются многоклеточными организмами, достигающими иногда таких размеров, что бывают видимы даже невооруженным глазом. По сложности организации и процессов жизнедеятельности микромир подразделяется на большие группы (царства). Так, к микромиру относятся бактерии, дрожи, грибы, простейшие (протозоа), вирусы и прионы. Они различаются по размерам и сложности строения, по биологической организации, физиологии, биохимии и генетике; по паразитизму и экологии, т.е. распространенности в природе и среде обитания, а также по патогенности (т.е. болезнетворности) для человека, животных и растений и по ряду других специальных свойств.

· Значение микроорганизмов:

Микроорганизмы обитают почти повсеместно, где есть вода, включая горячие источники, дно мирового океана, а также глубоко внутри земной коры. Они являются важным звеном в обмене веществ в экосистемах, в основном выполняя роль редуцентов, но в некоторых экосистемах они -- единственные производители биомассы -- продуценты.

Микроорганизмы, обитающие в различных средах, участвуют в круговороте серы, железа, фосфора и других элементов, осуществляют разложение органических веществ животного, растительного происхождения, а также абиогенного происхождения (метан, парафины), обеспечивают самоочищение воды в водоемах.

Впрочем, не все виды микроорганизмов приносят человеку пользу. Весьма многочисленное количество видов микроорганизмов является условно-патогенной или патогенной для человека и животных. Некоторые микроорганизмы вызывают порчу сельскохозяйственной продукции, обедняют почву азотом, вызывают загрязнение водоемов, накопление в продуктах питания ядовитых веществ (например, микробных токсинов).

При участии микроорганизмов происходит разложение различных органических веществ в почвах и водоемах, они обусловливают круговорот веществ и энергии в природе; от их деятельности зависит плодородие почв, формирование каменного угля и нефти. Микроорганизмы участвуют в выветривании горных пород и прочих природных процессах.

Многие микроорганизмы используют в промышленном и сельскохозяйственном производстве (виноделие, хлебопечение, получение витаминов и ферментов, пищевых и кормовых белков, антибиотиков).

· среда обитания:

Микроорганизмы отличаются хорошей приспособляемостью к действию факторов внешней среды. Различные микроорганизмы могут расти при температуре от ?6° до +50--75°. Рекорд выживаемости при повышенной температуре поставили археи, некоторые изученные культуры которых растут на питательных средах свыше 110 °C, например, Methanopyrus kandleri (штамм 116) растёт при 122 °C, рекордно высокой температуре для всех известных организмов.

В природе среда обитания с такой температурой существует под давлением в горячих вулканических источниках на дне океанов (Черные курильщики).

Известны микроорганизмы, процветающие при гибельных для многоклеточных существ уровнях ионизирующего излучения, в широком интервале значений рН, при 25 % концентрации хлорида натрия, в условиях различного содержания кислорода вплоть до полного его отсутствия (Анаэробные микроорганизмы).

В то же время, патогенные микроорганизмы вызывают болезни человека, животных и растений.

Наиболее общепризнанные теории о происхождении жизни на Земле предполагают, что протомикроорганизмы были первыми живыми организмами, появившимися в процессе эволюции.

· классификация:

По сложности строения и возникновению все микроорганизмы подразделяют на три группы:

-высшие протисты (водоросли, грибы, простейшие);

-низшие протисты (эубактерии, архебактерии, риккетсии и сине-зелёные водоросли)

-неклеточные формы (прионы, вироиды и вирусы).

Одни из них представляют собой одноклеточные сложно устроенные организмы. Это бактерии, грибы, простейшие. К этим представителям микромира применим термин «микроорганизмы», так как они представляют собой самостоятельные, способные к автономному существованию организмы. Микроорганизмы различаются по сложности строения и проявлению жизненных функций. Так, ядро бактерии не имеет ядерной оболочки, поэтому их называют прокариотами (от греч. кагуоп -- ядро); другие (грибы, простейшие) имеют очерченное ядро, поэтому их называют эукариотами.

Микроскопические грибы и дрожжи отнесены к низшим растениям, протозоа -- к одноклеточным животным организмам. Предполагают, что различные группы бактерий имеют разное происхождение, поэтому бактерии выделены в самостоятельную группу простейших существ как связующее звено между растительным и животным миром.

Более простые представители микромира вирусы и прионы по существу -- это частицы (вирусы) и инфекционные макромолекулы (прионы) или нуклеиновые кислоты (инфекционные ДНК и РНК). Они не являются организмами в полном смысле этого слова, так как не имеют свойственных клеткам структур (органелл), не обладают собственным обменом веществ, а живут и размножаются в клетках животных, человека, растений, бактерий, используя для своей жизнедеятельности ресурсы и обменные процессы этих клеток. Поэтому они являются внутриклеточными паразитами и не способны существовать вне живой клетки. В связи с этим вирусы, прионы и инфекционные нуклеиновые кислоты нельзя называть микроорганизмами, правильнее их именовать микробами.

Таким образом, к микромиру относятся как сложно устроенные одноклеточные организмы (бактерии, грибы, простейшие), так и простейшие формы жизни (вирусы, прионы, инфекционные нуклеиновые кислоты), не являющиеся организмами в полном смысле этого слова. Следовательно, объединяющим термином для всех живых форм микромира (бактерий, грибов, простейших, вирусов, прионов) будет термин «микробы».

1.2 Принципы классификации бактерий

микроорганизм бактерия пропионовокислый брожение

С 1 января 1980 г. для микроорганизмов принята Единая международная классификация, в основе которой лежит система Берги.

Основными ступенями всех классификаций являются: царство -- класс -- порядок -- семейство -- род -- вид. Главной классификационной категорией является вид -- совокупность организмов, имеющих общее происхождение, сходные морфологические, физиологические признаки и обмен веществ.

Внутри вида существуют варианты: морфоварианты, или морфовары, отличающиеся по морфологии; биовары -- по биологическим свойствам, хемовары -- по ферментативной активности, серовары -- по антигенной структуре, фагова-ры -- по чувствительности к фагам.

Мир микроорганизмов на основании особенностей организации клеток, прежде всего генетического аппарата, они подразделяются на эукариот и прокариот.

Прокариоты, или бактерии, объединяют только микроформы. Организация их клеток более простая, чем у эукариот. Ядро прокариот, называемое нуклеоидом, не окружено мембраной и представлено одной кольцевой молекулой ДНК. Эндоплазматический ретикулум, митохондрии и другие обособленные органеллы, свойственные эукариотам, у прокариот отсутствуют, а их функции выполняет клеточная мембрана.

Бактерии (от лат. bacteria -- палочка) -- это одноклеточные организмы, лишенные хлорофилла. По биологическим свойствам -- прокариоты. Размеры от 0,1 до 0,15 микрометра до 16--28 мкм. Размеры и форма бактерий непостоянны и меняются от влияния среды обитания.

В классификации бактерий существуют два направления. Первое -- это построение системы на основе филогенетических данных, полученных путем комплексного, всестороннего изучения организмов. Второе -- каталогизация форм -- производится на основе какого-либо одного или нескольких признаков, часто случайных, не связанных между собой.

· Первое направление.

Бактерии делятся на два царства: эубактерии и архебактерии (рис.1).

С помощью способа окраски, впервые предложенного в 1884 г. Кристианом Грамом, бактерии могут быть разделены на две группы: грамположительные и грамотрицательные. Грамположительные организмы способны связывать некоторые анилиновые красители, такие, как кристаллический фиолетовый, и после обработки иодом, а затем спиртом (или ацетоном) сохранять комплекс иод-краситель. Те же бактерии, у которых под влиянием этилового спирта этот комплекс разрушается (клетки обесцвечиваются), относятся к грамотрицательным.

Рис. 1. Царства бактерий.

· второе направление

По внешнему виду бактерии делятся на 4 формы: шаровидные (кокки), палочковидные (бактерии, бациллы и клос-тридии), извитые (вибрионы, спириллы, спирохеты) и нитевидные (хламидобактерии) (рис.2).

Рис. 2. Бактерии:

1-6 -- различные виды шарообразных бактерий; 7-9 -- палочковидные бактерии; 10-12 -- извитые и нитевидные формы бактерий

1. Кокки (от лат. coccus -- зерно) -- шарообразный микроорганизм, бывает сферической, эллипсовидной, бобовидной и ланцетовидной формы. По расположению, характеру деления и биологическим свойствам кокки подразделяются на микрококки, диплококки, стрептококки, тетракокки, сар-цины, стафилококки.

Микрококки характеризуются одиночным, парным или беспорядочным расположением клеток. Они являются сап-рофитами, обитателями воды, воздуха.

Диплококки (от лат. diplodocus -- двойной) делятся в одной плоскости и образуют кокки, соединенные по две особи. К диплококкам относятся менингококки -- возбудители эпидемического менингита и гонококки -- возбудители гонореи и бленнореи.

Стрептококки (от лат. streptococcus -- витой), делящиеся в одной плоскости, располагаются цепочками различной длины. Имеются патогенные для человека стрептококки, вызывающие различные заболевания.

Тетракокки (от лат. tetra-- четыре), располагающиеся по 4, делятся в двух взаимноперпендикулярных плоскостях.

Редко встречаются в качестве возбудителей болезней у человека.

Сардины (от лат. saris -- связываю) -- кокковые формы, которые делятся в трех взаимно перпендикулярных плоскостях и выглядят в виде тюков по 8--16 и более клеток. Часто встречаются в воздухе. Болезнетворных форм нет.

Стафилококки (от лат. staphylococcus) -- гроздевидно расположенные кокки, делящиеся в различных плоскостях; располагаются неправильными скоплениями.

Некоторые виды вызывают у человека и животных заболевания.

2. Палочковидные формы подразделяются на бактерии, бациллы и клостридии.

Средние размеры от 1 до 6 мкм в длину и 0,5--2 мкм в ширину.

К бактериям относятся палочковидные микроорганизмы, как правило, не образующие спор (кишечная палочка, брюшнотифозная, паратифозные, дизентерийные, дифтерийные, туберкулезные и др.).

К бациллам (от лат. bacillus -- палочка) и клостридиям (от лат. closter -- веретено) принадлежат микробы, в большинстве своем образующие споры (сенная, сибиреязвенная, столбнячная, возбудители анаэробной инфекции).

По форме палочковидные бактерии бывают короткими (туляремийная), длинными (сибиреязвенная) с закругленными и заостренными концами.

По взаимному расположению палочковидные формы распределяются на три подгруппы:

-- диплобактерии и диплобациллы, располагающиеся попарно по длине (бактерии пневмонии);

-- стрептобактерии (возбудитель мягкого шанкра) и стреп-тобациллы (бациллы сибирской язвы);

-- бактерии и бациллы, которые располагаются без определенной системы (большинство палочковидных форм).

Встречаются бактерии с булавовидными утолщениями на концах -- возбудитель дифтерии, некоторые имеют ветвления -- микробактерии туберкулеза и лепры. Общее число палочковидных форм бактерий больше, чем корковидных.

3. К извитым формам бактерий относятся вибрионы, спириллы и спирохеты.

Вибрионы (от лат. vibrio -- изгибаюсь -- клетки, изгиб которых равен 14 завитка спирали, имеющие вид запятой). Типичный представитель -- холерный вибрион и водные вибрионы.

Спириллы (от лат. spira -- изгиб) -- имеют изгибы с одним или несколькими оборотами спирали. Из патогенных известен один вид spirillum minor -- возбудитель содоку, способный вызывать у человека болезнь, передающуюся через укус крыс и других грызунов.

Спирохеты (от лат. spirochaeta -- бактерия в виде изогнутого длинного винта -- штопорообразная форма. Размеры от 0,3--1,5 мкм в ширину и 7--500 мкм в длину). В семейство входят сапрофиты и патогенные виды. Они обитают в загрязненных водоемах, на мертвых субстратах. К патогенным относятся три рода: Treponema, Leptospira, Borrelia.

Все микробы обладают полиморфизмом, т. е. индивидуальной изменчивостью форм под влиянием различных факторов -- температуры, питательной среды, концентрации солей, кислотности, продуктов метаболизма, дезинфицирующих агентов, лекарственных препаратов.

Способность микробов изменяться учитывается в лабораторной диагностике инфекционных болезней, при изготовлении биологических препаратов, применяемых для профилактических и лечебных целей.

1.3 Бинарная номенклатура

Для обозначения микроорганизмов принята общебиологическая бинарная (двойная) номенклатура. Первое название обозначает род и пишется с прописной буквы. Второе название обозначает вид и пишется со строчной буквы. Например, Staphylococcus aureus -- стафилококк золотистый, S. aureus.

Имя рода всегда пишется с большой буквы, имя вида (видовой эпитет) -- всегда с маленькой (даже если происходит от имени собственного). В тексте биномен, как правило, пишется курсивом. Имя вида (видовой эпитет) не следует приводить отдельно от имени рода, поскольку без имени рода оно лишено смысла. В некоторых случаях допускается сокращение имени рода до одной буквы или стандартного сокращения.

Раздел второй

2.1 Дыхание микробов. Механизм и типы дыхания

Дыхание - биологический процесс окисления различных органических веществ, при котором происходит перенос протонов и электронов от субстрата (донора) к кислороду (акцептору) и образование молекул АТФ.

Под дыханием понимают совокупность биохимических процессов, в результате которых освобождается энергия, необходимая для жизнедеятельности микроорганизмов.

По источникам энергии микроорганизмы делят на:

фототрофы - используют энергию солнечного света благодаря пигментам, близким к хлорофиллу (пурпурные серобактерии)

хемотрофы - получают энергию за счет окисления неорганических и органических соединений (чаще глюкозу - нитрифицирующие бактерии)

Все микробы по типу дыхания подразделяются на облигатные аэробы, микроаэрофилы, факультативные анаэробы, облигатные анаэробы.

Рис. 3. Дыхание микробов.

Облигатные (строгие) аэробы развиваются при наличии в атмосфере 20% кислорода (микобактерии туберкулеза), содержат ферменты, с помощью которых осуществляется перенос водорода от окисляемого субстрата к кислороду воздуха.

Микроаэрофилы нуждаются в значительно меньшем количестве кислорода, и его высокая концентрация хотя и не убивает, но задерживает их рост (актиноисцеты, бруцеллы, лептоспиры).

Факультативные анаэробы могут размножаться как в присутствии, так и в отсутствие кислорода (большинство патогенных и сапрофитных микробов -- возбудители брюшного тифа, паратифов, кишечная палочка).

Облигатные анаэробы -- микробы, для которых наличие молекулярного кислорода является губительным (клостридии столбняка, ботулизма).

Аэробы в процессе дыхания окисляют различные органические вещества (углеводы, белки, жиры, спирты, органические кислоты и пр.).

Дыхание у анаэробов происходит путем ферментации субстрата с образованием небольшого количества энергии. Процессы разложения органических веществ в безкислородных условиях, сопровождающиеся выделением энергии, называют брожением. В зависимости от участия определенных механизмов различают следующие виды брожения: спиртовое, осуществляемое дрожжами, молочно-кислое, вызываемое молочно-кислыми бактериями, масляно-кислое и пр.

Процесс дыхания заключается в том, что углеводы (или белки, жиры и другие запасные вещества клетки) разлагаются, окисляясь кислородом воздуха, до углекислого газа и воды. Выделяющаяся при этом энергия расходуется на поддержание жизнедеятельности организмов, рост и размножение. Бактерии вследствие ничтожно малых размеров своего тела не могут накапливать значительного количества запасных веществ. Поэтому они используют в основном питательные соединения среды.

В общем виде дыхание можно представить следующим уравнением:

С6Н12О6 + 602 = 6С02 + 6Н20 + 2,87-106 дж.

глюкоза кислород углекислый газ вода энергия

За этой простой формулой скрывается сложная цепь химических реакций, каждая из которых катализируется специфическим ферментом.

Ферментативные реакции, происходящие в процессе дыхания, в настоящее время хорошо изучены. Схема реакций оказалась универсальной, т. е. в принципе одинаковой у животных, растений и многих микроорганизмов, в том числе бактерий. Процесс дыхания при окислении глюкозы складывается из следующих основных этапов (рис. 4).

Рис. 4. Роль пировнноградной кислоты в процессах дыхания и брожения.:

Сначала происходит образование фосфорных эфиров глюкозы -- моноaктивированная глюкоза в форме дифосфата далее расщепляется на два триозофосфата (трехуглеродные соединения): фосфоглицериновый альдегид и диоксиацетон-фосфат, которые могут обратимо превращаться друг в друга.



Рис. 5. Схема гликолитического пути расщепления углеводов.

Далее в обмен вступает фосфоглицериновый альдегид, он окисляется в дифосфо-глицериновую кислоту. Назначение этого процесса заключается в отщеплении атомов водорода от окисляемого субстрата и переносе водорода с помощью специфических окислительных ферментов к кислороду воздуха (см. рис. 4, 5).

Рис. 6. Цикл трикарбоновых кислот. Стрелками пок-но направление, а номерами - порядок реакций.

Водород от фосфоглицеринового альдегида присоединяется к ферменту -- никотин-амиддинуклеотиду (НАД); при этом альдегид окисляется до кислоты и выделяется энергия. Часть этой энергии тратится на образование АТФ; при этом присоединяется фосфорная кислота к аденозиндифосфат у-- АДФ. При гидролизе АТФ энергия освобождается и может быть затрачена на различные процессы синтеза белка и другие нужды клетки.

Фосфоглицериыовая кислота окисляется до пировиноградной кислоты. При этом также образуется АТФ, т. е. запасается энергия.

На этом завершается первая -- анаэробная -- стадия процесса дыхания, которая носит название гликолитического пути (пути Эмбдена -- Мейергофа -- Парнаса.) Для осуществления этих реакций кислород не требуется. Образовавшаяся пировиноградная кислота является интереснейшим и очень важным соединением. Пути расщепления глюкозы в процессе дыхания и многих брожений, вплоть до образования пировиноградной кислоты, идут совершенно одинаково, что впервые было установлено русским биохимиком С. П. Костычевым. Пировиноградная кислота является тем центральным пунктом, от которого расходятся пути дыхания и брожений, откуда начинается специфическая для данного процесса цепь ферментативных превращений - специфическая цепь химических реакций (рис. 5).

В процессе дыхания пировиноградная кислота вступает в цикл трикарбоновых кислот (рис. 6). Это сложный замкнутый круг превращений, в результате которых образуются органические кислоты с 4, 5 и 6 атомами углерода (яблочная, молочная, фумаровая, а-кетоглутаровая и лимонная) и отщепляется углекислота.

Прежде всего от пировиноградной кислоты, содержащей три атома углерода, отщепляется СО2 -- образуется уксусная кислота, которая с коферментом А образует активное соединение -- ацетилкоэнзим А. Он передает остаток уксусной кислоты (ацетил) на щавелевоуксусную кислоту {4 атома углерода), и образуется лимонная кислота (6 атомов углерода). Лимонная кислота претерпевает несколько превращений, в результате выделяется С02 и образуется пяти-углеродное соединение -- а-кетоглутаровая кислота. От нее тоже отщепляется С02 (третья молекула углекислого газа), и образуется янтарная кислота (4 атома углерода), которая затем превращается в фумаровую, яблочную и, наконец, щавелевоуксусную кислоту.

На этом цикл замыкается. Щавелевоуксусная кислота снова может вступить в цикл.

Таким образом, в цикл вступает трехуглеродная пировиноградная кислота, и по ходу превращений выделяются 3 молекулы С02.

Водород пировиноградной кислоты, освобождающийся при дегидрировании в аэробных условиях, не остается свободным -- он поступает в дыхательную цепь (так же, как водород глицеринового альдегида, отнятый при превращении его в глицериновую кислоту). Это -- цепь окислительных ферментов.

Ферменты, которые первыми берут на себя водород от окисляемого субстрата, называются первичными дегидрогеназами.

В их состав входят ди- или трипиридин-нуклеотиды: НАД или НАДФ и специфический белок. Механизм присоединения водорода -- один и тот же:

Окисляемое вещество -- Н2 + НАД -> окисленное вещество + НАД*Н2

Водород, полученный дегидрогеназой, затем присоединяется к следующей ферментной системе -- флавиновым ферментам (ФМН или ФАД).

От флавиновых ферментов электроны попадают на цитохромы -- железосодержащие протеиды (сложные белки). По цепи цитохромов передается не атом водорода, а только электроны. При этом происходит изменение валентности железа: Fe++ -- e->Fe++

Заключительная реакция дыхания -- это присоединение протона и электрона к кислороду воздуха и образование воды. Но прежде происходит активирование молекулы кислорода под действием фермента цитохромоксидазы. Активирование сводится к тому, что кислород приобретает отрицательный заряд за счет присоединения электрона окисляемого вещества. К активированному кислороду присоединяется водород (протон), образуя воду.

Кроме упомянутой цепи переносчиков электронов и водорода, известны и другие. Процесс этот гораздо более сложен, чем изложенная схема.

Биологический смысл этих превращений заключается в окислении веществ и образовании энергии, В результате окисления молекулы сахара (глюкозы) в АТФ запасается 12,6-1053ж энергии, в самой молекуле сахара содержится 28,6-106 дж, следовательно, полезно используется 44% энергии. Это очень высокий коэффициент полезного действия, если сравнить его с к. п. д. современных машин.

В процессе дыхания образуется огромное количество энергии. Если вся она выделилась бы сразу, то клетка перестала бы существовать. Но этого не происходит, потому что энергия выделяется не вся сразу, а ступенчато, небольшими порциями. Выделение энергии небольшими дозами обусловлено тем, что дыхание представляет собой многоступенчатый процесс, на отдельных этапах которого образуются различные промежуточные продукты (с разной длиной углеродной цепочки) и выделяется энергия. Выделяющаяся энергия не расходуется в виде тепла, а запасается в универсальном макроэргическом соединении -- АТФ. При расщеплении АТФ энергия может использоваться в любых процессах, необходимых для поддержания жизнедеятельности организма: на синтез различных органических веществ, механическую работу, поддержание осмотического давления протоплазмы и т. д.

Дыхание является процессом, дающим энергию, однако его биологическое значение этим не ограничивается. В результате химических реакций, сопровождающих дыхание, образуется большое количество промежуточных соединений. Из этих соединений, имеющих различное количество углеродных атомов, могут синтезироваться самые разнообразные вещества клетки: аминокислоты, жирные кислоты, жиры, белки, витамины.

Поэтому обмен углеводов определяет остальные обмены веществ (белков, жиров). В этом его огромное значение.

С процессом дыхания, его химическими реакциями связано одно из удивительных свойств микробов -- способность испускать видимый свет -- люминесцировать.

Известно, что ряд живых организмов, в том числе бактерии, могут испускать видимый свет. Люминесценция, вызываемая микроорганизмами, известна уже в течение столетий. Скопление люминесцирующих бактерий, находящихся в симбиозе с мелкими морскими животными, иногда приводит к свечению моря; с люминесценцией встречались также при росте некоторых бактерий на мясе и т. д.

К основным компонентам, взаимодействие между которыми приводит к испусканию света, относятся восстановленные формы ФМН или НАД, молекулярный кислород, фермент люцифераза и окисляемое соединение -- люциферин. Предполагается, что восстановленные НАД или ФМН реагируют с люциферазой, кислородом и люциферином, в результате чего электроны в некоторых молекулах переходят в возбужденное состояние и возвращение этих электронов на основной уровень сопровождается испусканием света. Люминесценцию у микробов рассматривают как «расточительный процесс», так как при этом энергетическая эффективность дыхания снижается.

С выделением большого количества тепла при дыхании некоторых микроорганизмов связаны процессы самовозгорания торфа, навоза, влажного сена и хлопка.

2.2 Методы создания анаэробных условий

В зависимости от способа создания безвоздушной среды, все методы создания анаэробных условий для культивирования бактерий делят на физические, химические и биологические.

Особняком стоит метод Китта-Тароцци, сочетающий в себе физические, химические и биологические способы создания безвоздушной среды обитания микроорганизмов.

Воздух, точнее кислород воздуха, можно удалить из среды культивирования бактерий физическими методами.

· Можно использовать анаэростат - сосуд с герметической крышкой, из которого отсасывают воздух насосом. В такой сосуд помещают чашки Петри с посевами и после откачивания воздуха ставят (если он по своим размерам позволяет это сделать - такие небольшие анаэростаты называются микроанаэростатами) в термостат, где происходит культивирование бактерий.

· Существуют, по сути, разновидности анаэростатов, в которых удаленный воздух замещается каким-нибудь инертным газом, например - в аппарате Кипа - водородом.

· Один из наиболее распространенных способов создания анаэробных условий при культивировании бактерий используется в так называемых трубках Виньяль-Вийона. Этот метод прост в осуществлении и не требует какой-либо особой аппаратуры. В трубках Виньяль-Вийона осуществляется глубинное культивирование бактерий. Для этого бактериальная культура разводится в расплавленной и охлажденной питательной среде (в пробирках или пипетках - отсюда и название «трубки») с таким расчетом, чтобы бактериальные клетки находились на значительном удалении одна от другой. При застывании питательной среды бактериальные клетки оказываются «замурованными» в ее толще и при культивировании каждая из них формирует отдельную колонию (естественно, без доступа кислорода воздуха).

· Анаэробные условия для культивирования бактерии создаются и в случае их засева уколом в высокий столбик полужидкого агара. Место укола тут же затягивается и бактерии растут в толще питательной среды.

· Удалить воздух, растворенный в жидкой питательной среде, можно с помощью кипячения. При нагревании жидкости растворенный в ней воздух выходит в атмосферу, что мы и наблюдаем в виде «бурления». Такой процесс называется регенерацией питательной среды. Чтобы впоследствии при медленном охлаждении воздух вновь не растворился в питательном бульоне, его охлаждают очень быстро (например, под струей холодной воды).

· Чтобы свести к минимуму диффузию атмосферного воздуха в питательную среду, ее поверхность покрывают слоем жидкого масла (например, вазелинового). В этом случае говорят о «культивировании под слоем масла».

· При глубинном культивировании бывает трудно получить доступ к нужной колонии и извлечь ее из толщи питательной среды. Облегчает эту задачу метод Перетца: в чашку Петри заливается расплавленная и охлажденная питательная агаризованная среда, смешанная с бактериальной культурой, на поверхность которой осторожно помещается предметное стекло, которое слегка вдавливают в питательный агар. Те колонии, которые вырастают непосредственно под этим стеклом, после снятия последнего становятся легко доступными.

Химические методы создания анаэробных условий для культивирования бактерий делятся на две группы.

1. Для связывания кислорода воздуха можно провести в замкнутом объеме (например, в эксикаторе с притертой крышкой) химическую реакцию, которая протекает с поглощением воздуха.

· В методе Аристовского с этой целью используются сыпучие ингредиенты. В развитие этого метода современная микробиологическая промышленность выпускает специальные наборы, с помощью которых можно создать газовую смесь, как с полным отсутствием кислорода, так и с присутствием его, а также углекислого газа и азота, в определенных концентрациях, необходимых для культивирования бактерий с «нестандартными» требованиями к условиям аэрации.

· В методе Омелянского с этой целью используются жидкие ингредиенты (пирогаллол и едкое кали).

2. Можно добавить в жидкую питательную среду вещества, связывающие кислород. Такие вещества называются редуцирующими. К ним относится, например, глюкоза, тиогликолевая кислота и ряд других.

В качестве биологического метода создания анаэробных условий для культивирования бактерий наиболее распространен (в различных модификациях) метод Фортнера. Принцип его состоит в том, что в замкнутом объеме (например, в парафинированной чашке Петри) одновременно культивируются анаэробы и так называемый «жадный аэроб» - вид бактерий, усиленно поглощающий при своем росте кислород. В качестве последнего наиболее часто используется энтеробактерия Serracia marcescens. Аэроб уничтожает весь кислород замкнутого объема, создавая тем самым условия для роста анаэроба.

Метод Китта-Тароцци заключается в использовании для культивирования анаэробов одноименной питательной среды. Среда Китта-Тароцци состоит из мясопептонного бульона, содержащего глюкозу (в качестве редуцирующего вещества), регенерированного и залитого слоем масла, на дно пробирки помещают кусочки паренхиматозного органа (чаще - печени) для адсорбции растворенного в мясопептонном бульоне воздуха.

Раздел третий

3.1 Определение пропионовокислого брожения

Пропионовокислое брожение -- тип брожения, осуществляемый пропионовокислыми бактеримии, который приводит к сбраживанием углеводов с образованием пропионовой кислоты CH3CH2COOH, углекислоты и воды.

Данный тип брожения происходит в анаэробных условиях под действием бактерий из рода Propionibacterium (при доступе кислорода пропионовокислые бактерии не сбраживают углеводы, а осуществляют окислительный процесс).

Пропионовые бактерии способны фиксировать CO2, при этом из пировиноградной кислоты и CO2 образуется щавелевоуксусная кислота, превращающаяся в янтарную к-ту, из которой декарбоксилированием образуется пропионовая кислота: Суммарно, можно так описать реакцию сбраживания глюкозы C6H12O6 при пропионовокислом брожении:

3C6H12O6 > 4CH3CH2COOH + 2CH3COOH + 2CO2^ + 2H2O + E

Таким образом, основными продуктами данного пропионовокислого брожения являются пропионовая кислота CH3CH2COOH, а также уксусная кислота CH3COOH, углекислый газ CO2 и вода H2O; кроме того выделяется энергия.

Побочными продуктами этого биохимического процесса, являются янтарная кислота, ацетоин, диацетил, другие летучие ароматические соединения - диметилсульфид, ацетальдегид, пропионовый альдегид, этанол и пропанол.

Восстановление пирувата идет по метилмалонил-КоА-пути, названному так по характерному промежуточному продукту (метилмалонил-КоА). При этом пируват сначала карбоксилируется до оксалацетата, который последовательно восстанавливается до сукцината через малат и фумарат. На уровне метилмалонил-КоА, образующегося из активизированного сукцината (сукцинил-КоА), происходит декарбоксилирование и образование пропионил-КоА, а затем - пропионата как продукта брожения.

3.2 Химизм (пропионовокислого брожения)

В пропионовокислом брожении мы имеем дело с карбоксилированием пирувата , приводящим к возникновению нового акцептора водорода - ЩУК (см. "Гетеротрофная ассимиляция углекислоты"). Восстановление пировиноградной кислоты в пропионовую у пропионовокислых бактерий протекает следующим образом (рис. 7). Пировиноградная кислота карбоксилируется в реакции, катализируемой биотинзависимым ферментом, у которого биотин выполняет функцию переносчика СО2. Донором СО2-группы служит метилмалонил-КоA . В результате реакции транс-карбоксилирования образуются ЩУК и пропионил-КоA ( рис. 7 ).

Рис. 7. Превращение пировиноградной кислоты в пропионовую при пропионовокислом брожении:

Ф1 - метилмалонил-КоA-карбоксилтрансфераза; Ф2 - малатдегидрогеназа; Ф3 - фумараза; Ф4 - фумаратредуктаза; Ф5 - КоA-трансфераза; Ф6 - метилмалонил-КоA-мутаза.

Рассмотрим теперь дальнейшую судьбу каждого из двух продуктов реакции, а также вопрос о происхождении одного из субстратов реакции - метилмалонил-КоА. (Основным источником пировиноградной кислоты служит процесс гликолитического расщепления гексоз или окислительные превращения, если в качестве субстрата брожения используют, например, диоксиацетон или глицерин).

Рис. 8. Цикл трикарбоновых кислот и глиоксилатный шунт:

Ф1 - цитратсинтаза (конденсирующий фермент); Ф2 - аконитаза; Ф3 - изоцитратдегидрогеназа; Ф4 - альфа-кетоглутаратдегидрогеназа; Ф5 - сукцилтиокиназа; Ф6 - сукцинатдегидрогеназа; Ф7 - фумараза; Ф8 - малатдегидрогеназа; Ф9 - изоцитратлиаза; Ф10 - малатсинтетаза.

Включение углеродных атомов ацетильного остатка в молекулу лимонной кислоты помечено звездочками. Пунктирными линиями изображены реакции глиоксилатного шунта.

ЩУК в результате трех ферментативных этапов (аналогичных реакциям 6, 7, 8 цикла трикарбоновых кислот, см. рис. 8) превращается в янтарную кислоту:

СООН-СН2-СО-СООН + НАД*Н2 переходит обратимо при участии малатдегидрогеназы в

СООН-СН2-СНОН-СООН + НАД+;

СООН-СН2-СНОН-СООН переходит обратимо при участии фумаразы в

СООН-СН=СН-СООН + Н2О;

СООН-СН=СН-СООН + ФАД*Н2 переходит обратимо при участии фумаратредуктазы в

СООН-СН2-СН2-СООН + ФАД+, где

СООН-СН2-СО-СООН - ЩУК,

СООН-СН2-СНОН-СООН - яблочная кислота,

СООН-СН=СН-СООН - фумаровая кислота и

СООН-СН2-СН2-СООН - янтарная кислота.

Следующая реакция заключается в переносе КоA-группы с пропионил- КоA на янтарную кислоту (сукцинат), в результате чего образуются сукцинил-КоА и пропионовая кислота :

СООН-СН2-СН2-СООН + СН3-СН2-CO~S-КоA переходит обратимо при участии КоA-трансферазы в

СООН-СН2-СН2-CO~S-КоА + СН3-СН2-СООН, где

СН3-СН2-CO~S-КоA - пропионил-КоA,

СООН-СН2-СН2-CO~S-КоA - сукцинил-КоA,

СН3-СН2-СООН - пропионовая кислота.

Образовавшаяся пропионовая кислота выводится из процесса и накапливается вне клетки. Сукцинил-КоA превращается в метилмалонил-КоA:

СООН-СН2-СН2-CO~S-КоA переходит обратимо при участии метилмалонил-КоA-мутазы в метилмалонил-КоA .

В состав кофермента метилмалонил-КоA-мутазы входит витамин В12. Перегруппировки типа, указанного в приведенном выше уравнении, характерны для реакций, катализируемых ферментами, содержащими витамин В12. В описанной выше реакции происходящие перемещения атомов в молекуле сводятся к двум типам: изменению углерод-углеродных связей и перераспределению водорода между углеродными атомами (рис. 9). Реакция, катализируемая мутазой, - ключевая в пропионовокислом брожении, так как в ней подготавливается субстрат, являющийся предшественником пропионовой кислоты.

Рис. 9. Реакция, катализируемая металмалонил-КоA-мутазой. Цифрами в кружочках пронумерованы атомы углерода.

Из схемы, представленной на рис. 7 , можно видеть, что образование пропионовой кислоты из пировиноградной - результат взаимосвязанного функционирования двух циклов: цикла переноса одноуглеродного фрагмента и цикла переноса кофермента A.

Кофермент A, принимающий активное участие в пропионовокислом брожении, относится к группе мононуклеотидов. Он содержит аденин, D-рибозу, пирофосфатную группу и пептидоподобное соединение, в состав которого входит пантотеновая кислота - еще один витамин группы В. Функция кофермента A заключается в переносе ацильных групп (RCO-). Ацильная форма КоA представляет собой тиоэфир. Тиоэфирная связь, образующаяся между карбоксильной группой кислоты и тиоловой группой КоА, является высокоэнергетической.

Итак, разобранный выше поток реакций приводит к синтезу пропионовой кислоты. Однако пропионовокислое брожение - более сложный процесс, поскольку наряду с пропионовой кислотой в качестве продуктов брожения образуются уксусная, янтарная кислоты и СО2. В схеме, изображенной на рис.7, янтарная кислота образуется как промежуточное соединение на пути, ведущем к синтезу пропионата; но она может накапливаться в среде и как конечный продукт. К образованию сукцината, количество которого зависит от содержания СО2 в среде, ведет последовательность реакций, начинающаяся с карбоксилирования ФЕП (рис. 10), в которой остаток фосфорной кислоты ФЕП переносится на неорганический фосфат, что приводит к образованию пирофосфата:

ФЕП + СО2 + Фн переходит обратимо в ЩУК + пирофосфат.

Рис. 10. Пути образования янтарной, уксусной кислот и СО2 пропионовыми бактериями:

Ф1 - ФЕП-карбокситрансфосфорилаза; Ф2 - пируватдегидрогеназа; Ф3 - фосфотрансацетилаза; Ф4 - ацетаткиназа.

Дальнейшие превращения ЩУК до янтарной кислоты аналогичны реакциям 2-4, изображенным на рис.7.

Многие пропионовые бактерии сбраживают глюкозу так, что на каждую молекулу пирувата, окисленную до уксусной кислоты и СО2, приходятся 2 молекулы пирувата, восстановленные до пропионовой кислоты. Путь превращения пирувата, приводящий к образованию уксусной кислоты и СО2, представлен на рис. 10. На этом пути имеют место окислительно- восстановительные реакции, идущие с вовлечением новых молекул НАД+. Пируват подвергается окислительному декарбоксилированию с участием кофермента A:

СН3-СО-СООН + НАД+ + КоA-SH переходит при участии пируватдегидрогеназы в

СН3-СО~S-КоA + СО2 + НАД*Н2, где

СН3-СО~S-КоA - ацетил-КоA.

Процесс катализируется пируватдегидрогеназным комплексом и практически необратим. В результате образуется ацетил-КоА, содержащий высокоэнергетическую тиоэфирную связь, ацетильная группа с которого переносится на неорганический фосфат, что приводит к образованию ацетилфосфата и регенерированию кофермента А:

СН3-СО~S-КоA + Фн переходит обратимо в

СН3СО~Ф + КоA-SH.

В этой реакции энергия, заключенная в тиоэфирной связи, реализуется в виде высокоэнергетической фосфатной связи ацетилфосфата.

И наконец, ацетилфосфат донирует фосфатную группу на АДФ с образованием АТФ и уксусной кислоты :

СН3-СО-О~Ф + АДФ переходит обратимо при участии ацетаткиназы в

АТФ + СН3-СООН, где СН3-СООН - ацетат.

Итак, на участке от пирувата до ацетата образуется 1 молекула НАД*Н2 и 1 молекула АТФ. Энергетическое значение для пропионовых бактерий этого участка метаболического пути очевидно и не требует обсуждения.

Кроме основных продуктов в разных количествах в культуральной жидкости пропионовых бактерий обнаружены молочная, муравьиная, изовалериановая кислоты, этиловый и пропиловый спирты, уксусный и пропионовый альдегиды, ацетоин, диацетил. Состав конечных продуктов брожения зависит от культуры бактерий, состава среды и условий культивирования. Это касается как видов накапливаемых продуктов, так и количественных соотношений между ними.

3.3 Возбудители (пропионовокислые бактерии)

В эту группу, объединяемую в род Propionibacterium, входят грамположительные, неподвижные, не образующие спор палочковидные бактерии, размножающиеся бинарным делением. В зависимости от условий культивирования и цикла развития форма клетки может меняться до кокковидной, изогнутой или булавовидной. Типовой вид - Propionibacterium freudenreichii .

Большинство пропионовокислых бактерий - аэротолерантные анаэробы , получающие энергию в процессе брожения , основным продуктом которого является пропионовая кислота . Аэротолерантность их обусловлена наличием полностью сформированной ферментной системы защиты от токсических форм кислорода (супероксидный анион, перекись водорода). У пропионовокислых бактерий обнаружены супероксиддисмутазная, каталазная и пероксидазная активности. Внутри группы отношение к О2 различно. Некоторые виды могут расти в аэробных условиях.

Брожение не исчерпывает всех возможностей получения энергии этой группой эубактерии. Хотя гликолитическое расщепление глюкозы с образованием в качестве обязательного промежуточного соединения пировиноградной кислот ы является основным путем разложения глюкозы, кроме этого пути в группе пропионовых бактерий обнаружен окислительный пентозофосфатный путь , реакции ЦТК , активное " флавиновое дыхание " и окислительное фосфорилирование , сопряженное с электронтранспортной системой. Вклад каждого из этих путей в общий энергетический метаболизм зависит как от вида бактерий, так и от конкретных внешних условий.

Эволюция пропионовых бактерий определенно шла по пути приспособления к аэробным условиям. У некоторых видов обнаружен "эффект Пастера": в присутствии кислорода воздуха происходит переключение с брожения на дыхание.

Пропионовые бактерии могут синтезировать гемсодержащие белки. В их клетках обнаружены цитохромы.

Важную роль в аэробном метаболизме пропионовых бактерий играет "флавиновое дыхание", которому приписывают основную связь этих бактерий с молекулярным кислородом. В процессе флавинового дыхания происходит перенос двух электронов с флавопротеинов на О2, сопровождающийся образованием перекиси водорода, которая разлагается бактериальной каталазой и пероксидазой. Однако флавиновое дыхание не связано с получением клеткой энергии.

Транспорт электронов в дыхательной цепи некоторых пропионовых бактерий сопровождается образованием АТФ, что может указывать на подключение к этому процессу цитохромов, однако эффективность окислительного фосфорилирования низка. Последнее, вероятно, объясняется несовершенством механизмов сопряжения. В то время как в аэробных условиях конечным акцептором электронов с НАД*Н2 является О2, в анаэробных условиях им может быть нитрат, фумарат.

Таким образом, в группе пропионовых бактерий мы сталкиваемся с большим разнообразием энергетических возможностей. В целом у пропионовых бактерий достаточно четко просматриваются две тенденции: с одной стороны, усовершенствование основного анаэробного способа получения энергии, с другой - попытки приспособления и, более того, рационального использования молекулярного кислорода.

Конструктивный метаболизм пропионовых бактерий претерпел дальнейшую эволюцию в сторону большей независимости от органических соединений внешней среды. Пропионовые бактерии характеризуются хорошо развитыми биосинтетическими способностями и могут расти на простой синтетической среде с аммонийным азотом в качестве единственного источника азота при добавлении к среде пантотеновой кислоты и биотина, а для некоторых видов и тиамина. У ряда пропионовых бактерий обнаружена способность к азотфиксации.

Местообитание пропионовых бактерий - кишечный тракт жвачных животных, молоко, твердые сыры, в приготовлении которых они принимают участие.

Применение в пищевой промышленности.

После молочнокислого брожения , когда лактоза превращена в молочную кислоту, начинают размножаться пропионовые бактерии, сбраживающие молочную кислоту с образованием уксусной и пропионовой кислот. Эти кислоты придают сырам специфический острый вкус. Пропионовые бактерии используют в микробиологической промышленности в качестве продуцентов витамина В12.

Пропионовокислое брожение применяется пищевой промышленности, например в хлебопечении для фунгицидного воздействия при закваске теста. Пропионовокислое брожение также используется в сыроделии. Летучие кислоты (пропионовая и уксусная), образующиеся в результате данного брожения, придают сырам кисловато-острый вкус, а выделяющийся в виде пузырьков углекислый газ образует «глазки» в сыре.

Список литературы

1. Емцев В.Т. Микробиология/ В.Т. Емцев, Е.Н. Мишустин. - М.: Агропромиздат, 1993

2. Теппер Е.З. Практикум по микробиологии /Е.З. Теппер, В.К. Шильникова, Г.И. Переверзева. - М.: Агропромиздат, 1987

3. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1992.376с.

4. Стейниер Р., Эдельберг Э., Ингрэм Дж. Мир микробов. М.: Мир, 1979. Т. 1-3.

5. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир, 1987. 563с.

6. Громов Б.Д., Павленко Г.В. Экология бактерий. Л.: Изд-во Лен. ун-та, 1989.246с.

7. Жизнь микробов в экстремальных условиях. М.: Мир, 1982. 520с.

8. Кондратьева Е.Н. Автотрофные прокариоты. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1996.302с.

9. Метаболизм микроорганизмов. Под ред. Н.С. Егорова. М.: Изд-во Моск.ун-та, 1986.256с.

10. Методы общей бактериологии. Под ред. Ф. Герхарда. М.: Мир, 1984. Т. 1-3.

11. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир, 1978.331с.

12. Промышленная микробиология. Под ред. Н.С. Егорова. М.: Высш.шк, 1989.686с.

Размещено на Allbest.ru

...