Стерилизация питательных сред

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство образования и науки РФ

ФГАОУ ВПО «Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина»

Кафедра «Технологии органического синтеза»

РЕФЕРАТ

на тему: «Стерилизация питательных сред»

Выполнила: студент гр х-400803

Кожевникова М.В.

Проверила: Берсенева В.С.

Екатеринбург 2013

Содержание

Введение

Питательные среды и их классификация

Заключение

Библиографический список

Введение

Микробы, как любые другие живые организмы свое развитие и рост, обновление строительного материала, обеспечение энергетических процессов осуществляют за счёт постоянного обмена веществ с окружающей его внешней средой, т.е. путём питания и дыхания. Типы питания, дыхания (аэробы и анаэробы), индукцию и активность ферментов, токсинов, пигментов, рост и размножение являются основными физиологическими параметрами, которые учитывают при разработке составов питательных сред и условий культивирования микробов in vitro.

Культивировать микроорганизмы - это значит искусственно создавать условия для их роста и размножения in vitro, взаимосвязанных, но не обязательно сопряжённых процесса. Для культивирования in vitro необходимы субстраты, которые микроорганизмы могут использовать в качестве питательных веществ для своего роста и размножения. Такие питательные субстраты - плотные или жидкие - называют культуральными или питательными средами. Для обеспечения правильного протекания процесса питательную среду необходимо предварительно обработать(стерилизовать). В данном реферате рассмотрены общее понятия питательная среда, тип питательных сред и способы и аппарты для их стерилизации.

Питательные среды и их классификация

Питательная среда -- вещество или смесь веществ, применяемая для культивирования макро- и микроорганизмов. Существует множество стандартных биологических питательных сред.

Требования, предъявляемые к средам

- быть питательными, то есть содержать в легко усвояемом виде все вещества, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей. При культивировании ряда микроорганизмов в среды вносят факторы роста -- витамины, некоторые аминокислоты, которые клетка не может синтезировать.

- иметь оптимальную концентрацию водородных ионов -- pH, так как только при оптимальной реакции среды, влияющей на проницаемость оболочки, микроорганизмы могут усваивать питательные вещества.

Для большинства патогенных бактерий оптимальна слабощелочная среда (pH 7,2-7,4). Исключение составляют холерный вибрион -- его оптимум находится в щелочной зоне (pH 8,5-9,0) и возбудитель туберкулёза, нуждающийся в слабокислой реакции (pH 6,2-6,8).

Чтобы во время роста микроорганизмов кислые или щелочные продукты их жизнедеятельности не изменили pH, средым должны обладать буферностью, то есть содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена.

- быть изотоничными для микробной клетки; то есть осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. Для большинства микроорганизмов оптимальная среда, соответствующая 0,5 % раствору натрия хлорида.

- быть стерильными, так как посторонние микробы препятствуют росту изучаемого микроба, определению его свойств и изменяют свойства среды.

- плотные средым должны быть влажными и иметь оптимальную для микроорганизмов консистенцию.

- обладать определённым окислительно -- восстановительным потенциалом, то есть соотношением веществ, отдающих и принимающих электроны, выражаемым индексом RH₂. Например, анаэробы размножаются при RH₂, не выше 5, а аэробы -- при RH₂ не ниже 10.

- быть по возможности унифицированным, то есть содержать постоянное количество отдельных ингредиентов.

Желательно, чтобы средым были прозрачными -- удобнее следить за ростом культур, легче заметить загрязнение среды посторонними микроорганизмами. аппарат стерилизация питательная среда

Классификация

- По исходным компонентам:

- натуральные среды -- готовят из продуктов животного и растительного происхождения(мясо, костная и рыбная мука, кормовые дрожжи, сгустки крови и др.)

- синтетические среды -- готовят из определённых химически чистых органических и неорганических соединений, взятых в точно указанных концентрациях и растворённых в дважды дистиллированной воде.

- По консистенции (степени плотности):

- жидкие

- полужидкие

- плотные

Плотные и полужидкие среды готовят из жидких, к которым прибавляют агар-агар или желатин. Кроме того, в качестве плотных сред применяют свёрнутую сыворотку крови, свёрнутые яйца, картофель, среды с силикагелем. Некоторые микроорганизмы используют желатин как питательное вещество -- при их росте среда разжижается.

- По составу:

- простые: мясопептонный бульон(МПБ), мясопептонный агар (МПА), , питательный желатин,

- сложные -- готовят прибавляя к простым средам кровь, сыворотку, углеводы и другие вещества.

- По назначению:

- основные -- служат для культивирования большинства патогенных микробов. МПБ, МПА, бульон и агар Хоттингера, пептонная вода.

- специальные -- служат для выделения и выращивания микроорганизмов, не растущих на простых средах.

- селективные (избирательные) -- служат для выделения определённого вида микробов, росту которых они благоприятствуют, задерживая или подавляя рост сопутствующих микроорганизмов. Среды становятся селлективными при добавлении к ним определённых антибиотиков, солей, изменения pH. Жидкие элективные среды называют средаминакопления.

- дифференциально-диагностические -- позволяют отличить один вид микробов от другого по ферментативной активности.

- консервирующие -- предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого материала.

Приготовление сред

Посуда для приготовления сред

Посуда для приготовления сред не должна содержать посторонних веществ, например щелочей, выделяемых некоторыми сортами стекла, или окислов железа, которые могут попасть в среду при варке её в ржавых кастрюлях. Лучше пользоваться стеклянной, эмалированной или алюминиевой посудой. Перед употреблением посуду необходимо тщательно вымыть, прополоскать и высушить. Новую стеклянную посуду предварительно кипятят 30 минут 1-2 % растворе хлороводородной кислоты, после чего в течение часа прополаскивают в проточной воде.

Сырьё

Исходным сырьём для приготовления большинства сред служат продукты животного и растительного происхождения, а также готовые полуфабрикаты.

Этапы приготовления

1. варка: среды варят на открытом огне, водяной бане, автоклаве или варочных котлах.

2. установление pH: ориентировочно производят с помощью индикаторной бумаги, для точного определения пользуются потенциометром или компаратором. При стерилизации pH снижается на 0,2, поэтому сначала готовят более щелочной раствор.

3. осветление производят, если при варке среды мутнеют или темнеют. Для этого используют белок куриного яйца или сыворотку крови.

4. фильтрация жидких и расплавленных желатиновых сред производят через влажный бумажный или матерчатый фильтры. Фильтрация агаровых сред затруднена -- они быстро застывают. Обычно их фильтруют через ватно-марлевый фильтр.

5. разливают среды не более чем на ? емкости, так как при стерилизации могут намокнуть пробки и среды утратят стерильность.

6. стерилизация: режим стерилизации зависит от состава среды и указан в её рецепте.

7. контроль

- для контроля стерильности среды ставят на 2 суток в термостат, после чего их просматривают.

- химический контроль окончательно устанавливает pH, содержание общего и амминого азота, пептона, хлоридов.

- для биологического контроля несколько образцов среды засевают специально подобранными культурами, и по их росту судят о питательных свойствах среды

Стерилизация питательных сред и аппаратура

Автоклавирование питательных сред для выращивания культур тканей проводят после их разлива в пробирки или колбы под давлением 0.7-0.8 атм. при температуре 115-120^оС в течение 15 - 30 минут, в зависимости от объема среды. Если в результате стерилизации среда помутнела, следовательно, неправильно выбран режим стерилизации.

При выделении микроорганизмов и сохранении чистых культур необходимо, чтобы среда не содержала никаких посторонних микробов, что достигается обеспложиванием или стерилизацией. Стерилизуют как среды, так и материалы, инструменты, аппараты, которыми пользуются при работе.

Стерилизация бывает:

- физическая

- химическая

Физическая стерилизация подразделяется на термическую и холодную. Термическая стерилизация - стерилизация под действием высоких температур, вызывающих денатурацию клеточных белков, разрушающих осмотический барьер клеток, нарушающих равновесие ферментативных реакций, что приводит к гибели клетки. Термическая стерилизация осуществляется различными способами:

1. Прокаливание в пламене горелки. Так стерилизуют бактериальные петли, иглы, кончики пинцетов, горлышки колб и пробирок, ватные пробки (кратковременно).

2. Кипячение. Производят в стерилизаторе. Стерилизуют шприцы, ножницы, скальпели, пинцеты, резиновые перчатки и резиновые пробки.

3. Стерилизация сухим жаром. Осуществляется в сушильных шкафах при температуре 160?С - 2 ч., 165?С - 1 ч., 180?С - 40 мин. Горячим воздухом чаще всего стерилизуют стеклянную посуду.

4. Стерилизация влажным жаром (текучим паром). Производится в аппарате Коха или в автоклаве при открытом выпускном кране. Таким образом, стерилизуют питательные среды, свойства которых изменяются при температурах выше 100?С. Обработку материала текучим паром используют для проведения дробной стерилизации (тиндализации) - трехкратной обработки питательной среды влажным жаром в течение одного часа при температуре 70 - 80?С интервалами 24 ч., во время которых поддерживается температура, благоприятная для прорастания спор. Проросшие из спор вегетативные клетки быстро погибают при очередном нагревании.

5. Стерилизация влажным жаром под давлением (автоклавирование).

Наиболее надежный и чаще всего применяемый способ стерилизации питательных сред. Основан на нагревании материала насыщенным водяным паром при давлении выше атмосферного. Время стерилизации 10 - 45 мин. Температура пара возрастает при повышении его давления:

Температура пара (?С)

112

121

128

132

Давление (атм.)

0,5

1

1,5

2

6. Неполная стерилизация (пастеризация). Достигается выдерживанием материала при 60?С в течение 30 мин, при 75?С -15 мин, при 90?С без выдержки. Широко применяется для частичной стерилизации легко портящихся пищевых продуктов (молоко, соки, сиропы). В почвенной микробиологии пастеризуют суспензии почв, чтобы освободить их от вегетативных клеток, но сохранить споры бактерий. Методы холодной стерилизации применяют в тех случаях, когда среды выдерживают нагревание.

Холодная стерилизация включает в себя:

1. Фильтрацию, которая заключается в пропускании жидкостей через специальные фильтры, имеющие мелкопористые перегородки и поэтому задерживающие клетки микроорганизмов. Причем здесь имеет место не только механическая задержка, но и адсорбция микроорганизмов на стенках, ограничивающих поры, вследствие того, что большинство микроорганизмов в водных суспензиях несет на своей поверхности отрицательный заряд, а фильтры изготавливаются из положительно заряженных материалов. Диаметр пор определяет область применения фильтров (фильтрующее и стерилизующее действие). Используют следующие типы фильтров:

- Мембранные фильтры (пористые диски из целлюлозы, коллодия, ацетата, толщиной около 0,1 мм с диаметром пор от 0, 35 до 1, 2 мкм).

- Фильтры Зейтца (диски из смеси асбеста с целлюлозой). С увеличением содержания целлюлозы пористость фильтра возрастает.

- Мелкопористые стеклянные фильтры (диски из фрагментов стекла,получаемые путем его сплавливания).

- Фарфоровые фильтры в виде полых свечей из каолина с примесью кварцевого песка (свечи Шамберлана), из инфузорной земли (свечи Беркефельда) и других материалов.

Фильтр, представляющий собой диск, закрепляется в специальном держателе (стеклянном, металлическом), который вставляется в приемник фильтрата (колба Бунзена). Свечи вставляют непосредственно в резиновую пробку приемника. Перед употреблением фильтры, их держатели и приемник фильтрата должны быть простерилизованы. Обычно фильтрование ускоряется путем создания на фильтре перепада давления, достигаемого либо приложением повышенного давления к находящейся над фильтром жидкости, либо откачиванием воздуха с помощью вакуумного насоса, присоединенного к приемнику фильтрата. Мембранные и асбестовые фильтры рассчитаны на одноразовое использование. Свечи после специальной обработки можно использовать повторно.

2. Стерилизацию облучением, основанную на летальном эффекте, которое оказывают на клетки микроорганизмов ультрафиолетовые, рентгеновские лучи и нейтроны. В лабораторных условиях обычно используют ультрафиолетовые лучи, источником которых являются специальные бактерицидные лампы. Излучателем в них служит электрическая дуга, возникающая в парах ртути низкого давления и испускающая линейчатый спектр в ультрафиолетовой области с длиной волны 260 нм. Бактерицидные лампы используют для частичной стерилизации открытых поверхностей и воздуха. Применение ультрафиолета ограничено из-за его малой проникающей способности. Вегетативные формы бактерий более чувствительны к УФ-облучению, чем споры.

3. Стерилизацию ультразвуком, создаваемым в жидкостях при помощи вибрирующих никелевых или кварцевых дисков. Разрушение клеток при ультразвуковом воздействии обусловлено возникновением вторичных явлений - кавитации. В результате действия звуковой волны высокой частоты образуются разрывы в жидкости, которые затем образуют пузырьки. При их захлопывании идет сильная гидравлическая волна, достигающая 10 атм., что приводит к механическому разрушению клеток. Бактерицидный эффект ультразвука снижается, если подавляется кавитация (разрыв жидкости), что происходит при дегазации, погружении объекта в гель или другую вязкую среду. Бактерицидный эффект ультразвука напротив усиливается при насыщении озвучиваемой эмульсии углекислотой, азотом, кислородом, воздухом, так как это усиливает кавитацию. К ультразвуку чувствительны все микроорганизмы, в том числе и споровые. Но по степени чувствительности они значительно отличаются. Химическая стерилизация представляет собой удаление или разрушение микроорганизмов, находящихся на неживых объектах или поверхностях, с помощью химических агентов, получивших название дезинфицирующих веществ. В качестве дезинфицирующих агентов применят галогены и их производные (гипохлорид натрия, хлорамины, спиртовой раствор йода), фенольные соединения, спирты, микробоцидные газы (формальдегид, окись этилена). Для консервации питательных сред, вакцин и сывороток используют хлороформ, толуол, эфир, формалин и др.

Рис.2 Стерилизатор паровой

В настоящее время доминирует термический метод стерилизации питательных сред. Холодная стерилизация (фильтрация) применяется для термолабильных компонентов. Эти среды не должны содержать нерастворимых веществ.

Наиболее часто применяемая принципиальная схема стерилизации включает подогрев среды острым паром (в стерилизационной колонке) с последующим ее выдерживанием при нужной температуре и охлаждением.

Время стерилизации среды (выдержку) регулируют путем изменения длины труб или количества пластинчатых теплообменников, температуру -- подачей пара на подогрев. Для сред, содержащих термолабильные компоненты, необходимое время выдержки составляет иногда 18--20 мин при сравнительно низкой температуре, что трудно реализовать в проточных выдерживателях. Например, при производстве кормового лизина в этом случае применяются многокорпусные объемные выдерживатели с перемешиванием (увеличением скорости потока) при передаче среды последовательно из корпуса в корпус.

Контрольно-измерительная и управляющая аппаратура линии стерилизации размещена на отдельном пульте управления или на общем пульте цеха ферментации.

Посевные питательные среды рекомендуется стерилизовать, а иногда приготавливать непосредственно в посевных ферментаторах. Последнее упрощает аппаратуру и уменьшает вероятность получения нестерильной культуры.

Стерилизация питательной среды для периодического процесса главной ферментации решается по-разному. Непрерывная стерилизация вне аппарата обеспечивает экономию тепла и минимум термической экспозиции питательных компонентов, хотя технически сложно осуществима и связана с повышенной вероятностью нестерильных операций, особенно на средах с нерастворимыми компонентами. Второй вариант -- подача среды, нагретой до температуры стерилизации, в рабочие ферментаторы с последующей ее выдержкой и охлаждением в аппарате -- более простой и надежный в отношении гарантий стерильности. Расход тепловой энергии и вероятность ухудшения свойств среды в результате длительного термического воздействия в этом случае возрастают.

При синтезе вторичных продуктов нередко необходимы более концентрированные среды для подпитки. Их стерилизация в принципе не отличается от таковой для основных сред. Однако обычно верхний предел допустимого содержания в них сухих веществ все же определяется техническими параметрами линии стерилизации (образование накипи, оседание и др.), а температура стерилизации и время выдержки -- составом среды (допустимая карамелизация и другие реакции компонентов среды).

Линии стерилизации сред для непрерывных процессов не отличаются от таковых для периодических.

Холодная стерилизация, как уже было отмечено, применяется в настоящее время только для термолабильных компонентов -- раствора мочевины, аммиачной воды и других корректирующих рН растворов -- для классической биотехнологии, ряда сложных сред -- для нетрадиционной биотехнологии. Основным аппаратом линии холодной стерилизации является мембранный фильтр. Ведущие иностранные фирмы «Полл корпорейшн», «Миллипор» и другие предлагают ряд мембран из полипропилена, целлюлозы, пористой нержавеющей стали, спеченной тканой проволочной сети, микроволохна, нейлона, эпоксидной смолой целлюлозы и других материалов. Мембраны чаще всего оформлены в виде фильтрующих патронов. Например, «Полл корпорейшн» наиболее часто предлагает патроны диаметром 70 мм, длиной 250--760 мм. Корпуса патронов изготавливаются из нержавеющей стали.

В линиях стерильных сред и других компонентов (а также для обвязки ферментаторов) в последних проектах применяется только сильфонная стальная нержавеющая арматура. В настоящее время стерильные сыпучие питательные среды реально используются при производстве ферментов поверхностным методом.

Заключение

В данном реферате было дано определение термину питательная среда и способы их стерилизации. Также рассмотрена аппаратура для стерилизации питательных сред.

Библиографический список

1. М.С. Поляк, В.И. Сухаревич, М.Э. Сухаревич «Питательные среды для медицинской микробиологии»

Размещено на Allbest.ru