Біологічні особливості Melilotus officinalіs (L)Pall. при вегетативному розмноженні

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ЦЕНТРАЛЬНИЙ БОТАНІЧНИЙ САД IМЕНІ М.М.ГРИШКА

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

03.00.05. - ботаніка

БІОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ MELILOTUS OFFICINALIS (L.)PALL. ПРИ ВЕГЕТАТИВНОМУ РОЗМНОЖЕННІ

Харченко Вiкторiя Євгенiвна

Київ - 1999

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В Україні існує ряд проблем економічного та екологічного характеру, одним із напрямків вирішення яких є використання у господарствах нових перспективних культур. Меlilotus officinalis (L.)Pall. - цінна кормова, фітомеліоративна, парозамінююча, антирадіоактивна, медоносна та лікарська рослина (Артюков, 1973, Польовий, 1989). У культурі M. officinalis за короткий термін можна отримати високі стабільні врожаї кормової маси та насіння, крім того рослини можуть бути використані на зелений корм та водночас діють, як добриво, бо здатні накопичувати азот (до 150-200 кг/га) (Суворов, 1962, Сметанин, 1987). Вміст протеїну в кормовій масі на суху речовину становить 160 - 190 г/кг (Масалимов, 1991). Крім того, це високовітамінна рослина. Так, у перерахунку на суху речовину вміст аскорбінової кислоти складає 827 мг/100г., каротину - 199 мкг/г., вітаміну Е - 205 мкг/ г, вітамінів В1 - 9 мкг/г, та В2 - 1 мкг/г (Боготова, 1983). M. officinalis невибагливий до родючості грунтів, перешкоджає їх ерозії, яка на території України щорічно збільшується на 100 - 120 тис. га (Шикула, 1998). Однак розповсюдження M. officinalis у господарствах країни надто обмежене, що пояснюється дефіцитом насіння та недосконалістю районованих сортів, які мають ряд недоліків: грубі стебла, низьку облистненість та ін. (Сагалбеков, 1984).

Селекційні роботи стримуються недостатньою вивченістю біологічних особливотей цієї рослини. Крім того M. officinalis є дворічним ксеногамним ентомофілом, й більшість зразків із заданими ознаками поступово втрачає їх частину у зв'язку з перехресним запиленням з природними формами. Таким чином, економічно доцільним було проведення робіт, спрямованих на прискорене збільшення в популяціях кількості рослин з цінними ознаками та підвищення ймовірності утворення нових форм та сортів.

Вегетативне розмноження дозволяє швидко отримувати велику кількість рослин без зміни генотипу. Для деяких представників родини Fabaceaе (Mеdicago sativa, Vicіa faba та ін.) вже розроблені методики вегетативного розмноження (Пастолатий, 1970, Новожилов, 1987). Тому для прискорення салекції M. officinalіs доцільним було проведення наукових досліджень по вивченню біологічних особливостей цієї рослини при вегетатвному розмноженні. Збагачення сортового асортименту M. officinalіs має забеспечити збільшення посівної площі, під цією культурою, що сприятиме поліпшенню екологічного стану грунтів України за рахунок зниження інтенсивності ерозійних процесів, та рівня їхньої радіоактивності, збільшенню виробництва рослинного білка тощо.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження з питань вивчення біологічних особливостей вегетативного розмноження M. officinalіs було складовою частиною тематичного плану кафедри ботаніки та екології Луганського державног аграрного університету по виконанню державного плану в 1991-1999 р.р. проекту “Корми і кормовий білок" НТП “Продовольство-95“ (номер державної реєстрації UAO 1002374 P).

Мета і задачі дослідження. Мета досліджень полягала у розробці методів прискореного збільшення в популяціях M. officinalіs кількості форм з ціними ознаками на основі вегетативного розмноження, враховуючи особливості онтогенезу даної рослини, для підвищення ймовірності створення та збереження сортів з бажаними ознаками.

Реалізація поставленої мети вимагала розв'язання таких завдань: виявити особливості сезонного розвитку колекційних сорто-зразків в умовах центральної та південно-східної України; вивчити особливості укорінення живців та шляхи оптимізації цього процесу; проаналізувати кореляцію ознак, що характеризують коренеутворювання на живцях; вивчити розвиток рослин, що були розмножені вегетативно; визначити можливості інтенсифікації вегетативного розмноження за рахунок застосування вимушеного періоду спокою у рослин першого року життя; визначити умови введення в культуру in vitro за допомогою оптимізації умов отримання калюсних культур з листових, сім'ядольних, гiпокотилевих експлантiв і латеральних бруньок, вивчити залежність морфогенезу латеральних бруньок в культурі від співвідношення фітогормонів у поживних середовищах; розробити рекомендації по збереженню та прискоренню розмноження цінних генотипів.

Наукова новизна одержаних результатів. Дослідні рослини M. officinalіs сортозразків к-36672, к-36673, к-36674, к-36675, к-36676, к-36680 з колекції Всеросійського інституту рослинництва імені М.І.Вавілова в умовах центральної та південно-східної України у перший рік життя не переходять до масового цвітіння. Були розроблені шляхи інтенсифікації робіт спрямованих на підвищення ймовірності створення та збереження сортів із бажаними ознаками за рахунок застосування вимушеного періоду спокою рослин першого року життя. В результаті вивчення розвитку рослин M. officinalіs першого року життя розмножених вегетативно встановлено, що з-за недорозвитку зимуючих органів ці рослини не здатні переносити осінньо-зимовий період та утворювати насіння. Для прискореного переходу рослин першого року життя, що були розмножені вегетативно, до цвітіння було запропоновано застосування фотоіндукції, на протязі вимушеного періоду спокою. Були розроблені умови введення M. officinalіs в культуру in vitro, також система індукції калюсогенезу на листкових, сім'ядольних, гiпокотілевих експлантах та латеральних бруньках. Виявлено залежність процесів морфогенезу в культурі латеральних бруньок від співвідношення фітогормонів у поживних середовищах.

Практичне значення отриманих результатів. Матеріали дисертації, були використані співробітниками кафедри ботаніки та екології на експериментальній базі Луганського державного аграрного університету при отриманні нового сорту: Буркун жовтий Луганський малокумариновий, який заявлено у Державну комісію по сортовипробуванню для занесення у сортовий реєстр України на 1999 рік. Розроблений комплекс методів вегетативного розмноження та фотоіндукції під час вимушеного періоду спокою може бути використаний при розмноженні цінних генотипів інших культур з близькими біологічними особливостями. За результатами досліджень по утворенню калусних культур з листяних, сім'ядольних, гiпокотилевих експлантів та латеральних бруньок було отримано вихідний матеріал для селекції та скорочено тривалість селекційного процесу M. officinalіs. Крім того, запропоновані методи культивування та регенерації рослин можуть бути застосовані для клонування цінних генотипів, самоклональних варіантів та мутантних форм, а також дорощування гібридних зародків.

Особистий внесок здобувача в результаті досліджень, що викладені в дисертації та публікаціях (самостійно або в співавторстві), полягає в участі в розробці програм та методик досліджень, організації й проведенні дослідження біологічних особливостей вегетативного розмноження M. officinalіs.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертації були викладені на наукових конференціях Луганського державного аграрного університету та Кіровоградського державного педагогічного університету в 1993-1999р.р.

Структура та обсяг дисертації: Дисертація складається із вступу, 3 розділів та висновків. Робота викладена на 110 сторінках тексту, включає 8 таблиць, 10 рисунків. Список використаних джерел наукової літератури містить 196 найменувань, у тому числі зарубіжних авторів - 36.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

вегетативний рослина біологічний селекційний

Наведено огляд літератури з питань морфо-фізіологічних особливостей та онтогенезу М. officinalis.

Розглядаються методи вегетативного розмноження рослин, які поширено застосовувати для збереження цінних генотипних ознак.

Дослідження проводились на кафедрі ботаніки та екології Луганського державного аграрного університету у 1991-1994 роках та на кафедрі природничо-математичних дисциплін Кіровоградського державного педагогічного університету у 1994-1999 роках. Об`єктами досліджень були сортозразки буркуну жовтого малокумаринового к-36672, к-36673, к-36674, к-36675, к-36676, к-36680, отримані з колекційного фонду Всеросійського інституту рослинництва. Було встановлено особливості сезонного розвитку дослідних сортозразків у конкретних умовах місця проведення дослідів.

Вегетативне розмноження вивчалось шляхом експериментів по укоренінню зелених живців та введенню експлантів M. officinalis в культуру in vitro.

Вивчення біологічних особливостей M. officinalis при вегетативному розмноженні проводили на рослинах сортозразку к-36672, оскільки при проведенні селекційних робіт співробітники кафедри ботаніки та екології Луганського державного аграрного університету були найбільш зацікавлені саме його господарсько-цінними ознаками. Оцінку вмісту кумарину проводили за методом хроматографії; потужність розвиненої кореневої системи, яка утворилась на живцях, вивчали за методом Турецької (1968). Розвиток морфофізіологічних пристосувань до перенесення зимових умов у рослин M. officinalis першого року життя та їх регенерантів оцінювали за допомогою методики, розробленої на кафедрі ботаніки та екології Луганського державного аграрного університету. Вивчення морфологічних особливостей кореневої системи при укоріненні живців на піску проводили за методом Ротмістрова (1965). Роботи по введенню експлантів M. officinalis в культуру in vitro проводили у лабораторіях культури ізольованих тканин у асептичних умовах за загальноприйнятою методикою роботи з культурою тканин.

Ініціацію переходу рослин M. officinalis першого року життя до цвітіння проводили за методом фотоіндукції.

Досліди закладали згідно з загальноприйнятими методиками проведення біологічних експериментів (Доспєхов, 1979). Роз-міщення варіантів досліду проводили шляхом рендомізації. Кожен дослід мав чотирикратну повторюваність. Кількісні показники опрацьовували за допомогою варіаційно-статистичних методів. Вірогідність визначали за критерієм суттєвості Стьюдента та н.і.р., які отримували при проведенні дисперсного та кореляційного аналізів (Лакин, 1990). Усі математичні розрахунки виконувались за допомогою програм статистичного аналізу Arm statistic та Microsoft Excel` 97 на комп'ютері Pentium II-586.

В процесі вивчення особливостей сезонного розвитку дослідних сортозразків відповідно до географічного положення та агрокліматичних умов місця проведення дослідів було встановлено, що на відміну від наведених в каталозі ВІР даних, дослідні рослини у перший рік життя до масового цвітіння не переходили. Визначені розбіжності пов`язані з різною тривалістю світлового дня в Санкт-Петербурзі (місцезнаходження ВІР) та на території центральної та південно-східної України (місце проведення дослідів).

В ході досліджень було розроблено новий підхід до розмноження дворічних ксеногамних кормових рослин помірної зони на основі застосування вегетативного розмноження та фотоіндукції до регенерантів з рослин першого року життя протягом осінньо-зимового періоду, на основі чого скорочується період збільшення в популяціях кількості рослин з цінними генотипними ознаками (на 1 рік). Дослідження особливостей вегетативного розмноження M. officinalis зеленими живцями з рослин першого та другого років життя полягало у визначенні особливостей регенерації коренів. Коренеутворення на живцях починалось у перший тиждень від часу клонування та тривало близько 5 тижнів. Ефективність укорінення живців M. officinalis оцінювали як відношення кількості живців, що утворили корені, до їх загальної кількості. Дисперсний аналіз результатів досліду свідчив про перевищення стандартного (Fst={2,0;2,2;3,3}) критерію суттєвості над фактичним (F=1,3). Тому ми вважаємо, що вік життя рослин на момент клонування мало впливає на ефективність укорінення. Слід відзначити, що у зелених живців з рослин M. officinalis першого року життя коренеутворення проходило швидше та з меншою інтенсивністю, ніж у живців з рослин другого року життя ( табл. 3.1).

Таблиця 3.1 Залежність динамічних та біометричних характеристик коренеутворення на зелених живцях М. officinalis від віку рослин на момент клонування (в середньому за 4 роки).

Примітка. *Різниця між варiантiв дослiду статистично вiрогiдна за критерiєм Стьюдента при рiвнi значущостi p<0.05.

Загальна кількість коренів, що утворювались на живцях з рослин другого року життя, була на 57.1% більшою, ніж на живцях з рослин першого року життя.

Дисперсний аналіз результатів досліду свідчив про перевищення фактичного критерію суттєвості над стандартним (Fst={2,0;2,2;3,3}) при порівнянні варіантів досліду: за періодом коренеутворення на живцях (Fф=4.5), за кількістю коренів (Fф=46.3) та загальною тривалістю коренеутворення (Fф=4.1). Таким чином, рік життя рослини як фактор досліду мав високо вірогідну впливовість (р <0,05) на зазначені показники.

Кореляційний аналіз результатів досліду свідчив про наявність вірогідних зв'язків між біометричними та динамічними характеристиками коренеутворення. На основі цього в обох варіантах досліду було визначено вірогідну позитивну залежність періоду до початку коренеутворення від періоду до початку калюсоутворення (r1=+0.91; r2=+0,86), негативну залежність кількості коренів на живцях від періодів до початку калюсоутворення (r1=-0,58; r2=-0,49) та коренеутворення (r1=-0,56; r2=-0,44), а також позитивну залежність швидкості росту коренів від періодів до початку калюсоутворення (r1=+0,42; r2=+0,35) та коренеутворення (r1=+0.51; r2=+0,46).

Таким чином, збільшення кількості коренів у живців з рослин другого року життя порівняно з живцями з рослин першого року життя була зумовлена збільшенням тривалості періодів до початку процесів коренеутворення.

Регенерація коренів на живцях з рослин M. officinalis проходила за двома типами: через калюс на мiсцi зрiзу та через внутрiшнi тканини на стеблі. Слід відзначити, що регенерація коренів через внутрішні тканини виявилася менш ефективною, ніж через калюс у живців з рослин як першого, так і другого років життя (відповідно на 53% та 45%).

Коефіцієнт вегетативної репродукції, отриманий на основі кількості живців, що дали корені, складав 1:65.1±11.2. При урахуванні насінної продуктивності з клону одного стебла отримували в середньому 65.1±5.6г насіння. Таким чином, коефіцієнт розмноження становив 1:29,6±2.6.

В ході дослідження особливостей розвитку морфо-фізіологічних пристосувань до перенесення несприятливих умов осінньо-зимового періоду у рослин M. officinalis першого року життя, які були розмножені вегетативно, встановлено, що деформація провідних елементів кореня не відбувалась з причини незначного накопичення крохмалю в запасаючій паренхімі, тому, стеблова частина, яка несе пазушні бруньки, залишалась на поверхні ґрунту. Аналіз будови пазушних бруньок нижнього міжвузля свідчив про відсутність змін, які мали б забезпечити їх захист від несприятливих умов осінньо-зимового періоду. Таким чином, одержати насіння з рослин M. officinalis, які були розмножені вегетативно, у перший рік життя в польових умовах виявилося неможливим.

В ході досліджень було встановлено, що у разі освітлення рослин M. officinalis першого року життя в режимі (18 годин на добу) цвітіння починалось в середньому через 38.0 ± 5.0 днів. Рослини першого року життя, утворені з насіння та розмножені вегетативно, які переходили до цвітіння під впливом фотоіндукції, за періодом та інтенсивністю зазначеного процесу вірогідно не відрізнялись. Під час спостережень за дослідними рослинами M. officinalis шляхом кореляційного аналізу була визначена залежність кількості суцвіть на рослині від вихідної висоти рослини на момент початку фотоіндукції (r=+0.73).

Коефіцієнт розмноження рослин M. officinalis першого року життя при застосуванні вегетативного розмноження та фотоіндукції становив 1:15.9±1.2.

З метою інтенсифікації вегетативного розмноження застосовували НОК, ІОК у концентраціях від 5 до 50 мг/л. у різних співвідношеннях. За показниками ефективності укорінення живців, залежно від періоду культивування та концентрації фітогормонів, дисперсний аналіз показав перевищення фактичного критерію суттєвості (F=7.2) над стандартним (Fst {2.0,2.2,3.3}). Таким чином, період культивування та концентрації фітогормонів мали вірогідний вплив на кількість укорінених живців M. officinalis. Слід відзначити, що максимальну кількість живців, на яких утворились корені протягом тижня культивування ( на 22.3%, порівнянно до контролю), відмічено у живців, оброблених розчином НОК (20мг/л), на другому тижні від початку досліду. Збільшення кількості укорінених живців M. officinalis при застосуванні НОК та ІОК у концентраціях від 5 до 50 мг/л виявлено не було.

НОК у концентрації 20мг/л - забезпечувала збільшення кількості коренів (у 2,2 рази), тобто сприяла розвитку більш потужної кореневої системи.

На піску кількість кореневих зачатків на живцях була меншою, ніж на воді (на 59,9%). Застосування НОК призводило до гальмування розвитку стеблової частини регенерантів (на 72,4%) та збільшенню періоду переходу до цвітіння (на 26,6%). Під впливом НОК залежність інтенсивності процесів утворення коренів на зелених живцях M. officinalis від тривалості періодів до початку калюсоутворення та коренеутворення мало простежувалась.

В результаті проведенних досліджень було встановлено, що стимулюючого ефекту на ефективність укорінювання живців M. officinalis ауксини не виявили, але сприяли розвитку більш потужної кореневої системи.

В результаті проведених дослідів було встановлено, що низькокумаринові та висококумаринові форми M. officinalis за ефективністю регенерації коренів на зелених живцях ( 56.7±11.1% та 63.3%) вірогідно не відрізнялись. Розчин солей за прописом Кнопу пригнічував рівень укорінення живців M. officinalis (на 23,3-30%). При культивуванні живців низькокумаринових форм M. officinalis на сольовому розчині Кнопу початок коренеутворення прискорювався (на 15%), а у висококумаринових форм затримувався (на 26,7%).

При необхідності швидкого розмноження цінних генотипів M.officinalis іноді доцільно застосовувати методи мікро-клонування. Присутність фітогормонів у поживному середовищі зумовлює характер морфогенезу на латеральних бруньках M. officinalis. Так, присутність БАП у концентрації 1.0 мг/л сприяє пагоногенезу, НОК у концентрації 1.0 мг/л сприяє ризогенезу, а використання обох фітогормонів у концентрації 0.5 мг/л сприяє калюсогенезу. Тип експланту зумовлює особливості проліферації калюсів. При проліферації калюсів має місце взаємодія впливу поживного середовища та типу експланту. При культивуванні експлантів M. officinalis поживне середовище МС має перевагу за інтенсивністю проліферації калюсів порівняно з В5.9.

ВИСНОВКИ

1. Комплекс методів, розроблений нами на основі вивчення біологічних особливостей розвитку M. officinalis та вегетативного розмноження M. officinalis, і спрямований на прискорення збільшення в популяціях кількості рослин з цінними генотипними ознаками, має велике практичне значення. Розроблені методи досліджень були використані співробітниками кафедри ботаніки та екології Лугансткого державного аграрного університету в роботах по створенню нового сорту: Буркун жовтий Луганський малокумариновий.

2. Проведені фенологічні спостереження за особливостями розвитку сортозразків к-36672, к-36673, к-36674, к-36675, к-36676, к-36680 Буркуну жовтого (які належали до американської екологічної групи та американського екотипу), отриманих з колекційного фонду ВІР, дозволили встановити, що агрокліматичні умови центральної та південно-східної України в цілому сприятливі для росту і розвитку дослідних рослин, але, на відміну від даних каталогу ВІР, масового цвітіння у рік посіву у них не відбувається.

3. Доведено, що вік рослини на момент клонування не мав (56,7-63.3%) вірогідного впливу на ефективність регенерації коренів у зелених живців M. officinalis, але зумовлював динаміку, характер та потужність коренеутворення. Клонування рослин M. officinalis першого року життя доцільно проводити наприкінці червня, а рослин другого року життя - наприкінці травня.

4. Встановлено, що регенеранти рослин M. officinalis першого року життя не здатні переносити несприятливі умови осінньо-зимового періоду та давати відростання вегетативної маси навесні у зв'язку з недорозвитком зимуючих органів. Тому отримати насіння з них можливо лише у разі застосування додаткових заходів на основі фотоіндукції у розроблених нами умовах фоторежиму (18-24 години на добу).

5. Встановлено ступінь залежності потужності розвиненої кореневої системи, яка утворювалась на зелених живцях M. officinalis, та швидкості її розвитку від впливу фізіологічно-активних речовин групи ауксинів.

6. Досліджено, що у низькокумаринових та висококумаринових форм M. officinalis коренеутворення зелених живців проходить майже ідентично.

7. Застосування до зелених живців M. officinalis розчину НОК (у концентрації 20мг/л та з експозицією 5 годин) сприяє розвитку більш потужної кореневої системи, але не виявляє впливу на ефективність укорінення живців. На піску НОК впливає на збільшення кількості кореневих зачатків (на 17.9%).

8. Збільшення вмісту поживних речовин у середовищі (розчин Кнопа, пісок) знижує ефективність укорінення зелених живців M. officinalis.

9. При введенні рослин M. officinalis в культуру in vitro було встановлено, що присутність БАП у концентраціях від 0.5 до 1.0 мг/л сприяла пагоноутворенню на латеральних бруньках, НОК у концентраціях від 0.5 до 1.0 мг/л- ризогенезу, а обох фітогормонів одночасно у концентрації від 0.1 до 0.5 мг/л - калюсогенезу. Тип експланта та склад поживного середовища зумовлюють особливості проліферації калюсів. В ході досліджень було визначено, що поживне середовище МS, порівняно з В5.9, посилює інтенсивність калюсогенезу.

ПУБЛІКАЦІЇ

1.Харченко В.Є., Кiрпічов I.В. Вегетативне розмноження буркуну. // Степове землеробство.- 1995.- № 29. - С.78-80.

2.Харченко В.Є. Особливості вегетативного розмноження буркуну живцями з рослин першого та другого років розвитку // Степове землеробство.- 1996.- № 30.-С.58-60.

3.Харченко В.Є. Біологічні особливості і регенерація коренів на живцях високо- та низькокумаринових форм Melilotus officinalis (L.)Pall. // Зб. наук. праць ЛДАУ.- Луганськ.- 1999.-№4(11).-С.26-28.

4.Харченко В.Є. Застосування фотоперіодичної індукції цвітіння для інтенсифікації вегетативного розмноження цінних генотипів Melilotus officinalis (L.)Pall. // Зб. наук. праць ЛДАУ.- Луганськ.- 1999.-№4(11).-С.23-25.

5.Харченко В.Е. К вопросу о микроклональном размножении донника из пазушных почек.// Материалы отчетной научно-технической конференции сотрудников ЛСХИ.- Луганськ.- 1995.-С.48.

6.Харченко В.Е. Особенности регенерации кореней у облиственных черенков донника на песке.// Материалы отчетной научно-технической конференции сотрудников ЛСХИ.- Луганськ.- 1995. -С.49.

7.Харченко В.Е. Особенности вегетативного розмножения донника черенками с растений разных лет жизни // Материалы отчетной научно-технической конференции сотрудников ЛСХИ -Луганськ.- 1995. -С. 43.

Размещено на Allbest.ru