Використання прийомів генетичної інженерії і клітинної біології для отримання нових форм у видів з родини бобових і деяких інших рослин

З проведених експериментів можна зробити висновок, що процес регенерації як шляхом органогенезу у гороху і цукрового буряка, так і шляхом соматичного ембріогенезу у конюшини бере свій початок на стадії утворення дрібноклітинних структур, що визначаються як проембріональний комплекс, де очевидно і відбувається активізація певних генів, що відповідають за механізми морфогенезу. Саме на цій фазі повинно відбуватися накопичення специфічних матричних РНК, які можуть бути ключем для пошуку генів, залучених до процесу регенерації. Тобто процеси, що приводять у подальшому до утворення нормальної рослини з соматичних клітин, відбуваються головним чином на стадії утворення проембріональних груп клітин. Надалі, розвиток цих клітин може йти як по шляху соматичного ембріогенезу, так і по шляху органогенезу в залежності від генетичних і фізіологічних чинників.

АСИМЕТРИЧНА СОМАТИЧНА ГІБРИДИЗАЦІЯ ЯК ОДИН ІЗ СПОСОБІВ ПЕРЕНОСУ ГЕНЕТИЧНОЇ ІНФОРМАЦІЇ МІЖ РОСЛИНАМИ

Отримання соматичних гібридів між видами з родини бобових з використанням гамма-опромінення. Незважаючи на успіхи, яких досягнула в останній час генетична інженерія як підхід, заснований на методах введення в рослинну клітину спеціально створених векторних молекул ДНК, не можна недооцінювати можливостей клітинної інженерії рослин. Разом з тим необхідно відзначити, що поділ на генетичну і клітинну інженерію рослин є досить умовним, і в світовій науковій практиці вони розглядаються як цілісна система нових підходів під загальною назвою генетична інженерія рослин.

В наших експериментах по асиметричній соматичній гібридизації між видами з родини бобових, що розпочалися в 1987 році, були розроблені методи соматичної гібридизації з використанням гамма-опромінення одного з партнерів, і як результат були відібрані гібридні клони і регенеровані гібридні рослини.

Для індукції злиття протопластів між різноманітними видами з роду Medicago, а також між конюшиною (Trifolium pratense L.) і люцерною мінливою (M. varia L.) за основу було взято метод, розроблений для злиття мезофільних протопластів у N. plumbaginifolia згідно якому суміш протопластів обробляється на протязі 20 хв розчином 40% ПЕГа 4000, що містить високу концентрацію іонів Са2+ і рН рівний 9.5-10. Застосування цього методу сприяло як отриманню в достатній кількості продуктів злиття так і достатнього відсотку виживання гетерокаріонів і батьківських протопластів.

В результаті проведених експериментів, після злиття мезофільних протопластів M. sativa, сорт "Веселоподолянська" з опроміненими дозою 300Гр мезофільними протопластами M. varia, що несуть ген стійкості до канаміцинсульфату, були відібрані гібридні клітинні клони. У деяких з цих клонів вдалося індукувати утворення ембріоподібних структур, а в одному випадку були отримані рослини-регенеранти (Кучук та інш., 1991). Можна припустити, що отримані гібридні клони містять в своєму геномі гени M. varia, що обумовлюють регенераційну здатність, адже для колоній, отриманих з протопластів люцерни сорту “Веселоподолянська”, жодної регенераційної події отримати не вдалося. Проведений хромосомний аналіз показав, що відібраний гібрид несе октоплоідний набір хромосом з 3-4 додатковими хромосомами.

Нажаль у люцерни важко диференціювати хромосоми батьків, однак результати, опубліковані стосовно асиметричної соматичної гібридизації у видів роду Nicotiana, а також між Nicotiana і Atropa, свідчать, що в таких комбінаціях здебільшого відбираються гібриди з подвоєним набором хромосом реципієнта і деяким числом хромосом донора. В наших експериментах ми використали батьківські види з тетраплоїдним числом хромосом 2n=32, що призвело до отримання гібриду з октоплоїдним набором з додатковою кількістю хромосом донора.

Морфологія отриманих рослин істотно відрізнялася від обох батьків. Так, більшість листків була ненормальної редукованої форми. Рослини мали сильно укорочені міжвузля, і у них спостерігалося ускладнення коренеутворення в культурі in vitro. Такий фенотип міг бути результатом як певної несумісності геномів реципієнта і опроміненого донора, так, можливо, і слідством тривалого вирощування гібридних клітинних культур перш ніж вдалося індукувати регенерацію у отриманого гібридного клітинного клону.

З практичної точки зору більш цікавою була друга гібридна комбінація між іншими видами з роду Medicago. Один з представників цього роду - люцерна хмелевидна (M. lupulina) здатна до самозапилення, що є дуже корисною ознакою з точки зору селекції люцерни за підвищеною продуктивністю насіння. В той же час люцерна хмелевидна взагалі не здатна до статевого схрещування з окультуреними видами люцерни, що не дозволяє залучати її до звичайних селекційних програм.

В проведених експериментах після злиття мезофільних протопластів M. borealis лінія 94 з опроміненими протопластами M. lupulina RiA4, ізольованими з отриманої раніше трансгенної канаміцинстійкої клітинної лінії, вдалося відібрати клітинні лінії в даній гібридній комбінації. Необхідно відзначити, що морфологія одержаних клонів була схожа скоріше на морфологію клітинних ліній M. borealis. Отримані асиметричні соматичні гібриди розвивалися у вигляді зелених клітинних ліній без будь-яких ознак коренеутвореня. Регенерація рослин у гібридних колоній була сильно ускладнена і нам не вдалося отримати у них нормальні пагони.

Вивчення за допомогою блотинг гібридизації за Саузерном успадкування рибосомальніх генів у отриманих гібридних клітинних ліній між M. borealis і M. lupulina показало, що у асиметричних соматичних гібридів ці гени присутні від обох партнерів.

Аналогічний аналіз був проведений для комбінації M. sativa+ M. varia. У випадку використання ендонуклеази рестрикції EcoRV не було визначено жодних відмінностей в спектрах гібридизації у цих двох видів. Проте у гібридних клонів відмічалося виникнення нових смуг гібридизації. Це явище може бути пояснене виникненням нових класів рибосомальних повторів у соматичних гібридів, що вже відзначалося раніше у соматичних гібридів між N. plumbaginifolia і Atropa belladonna.

Припущення про можливість перенесення генів, що регулюють здатність до регенерації в культурі in vitro, шляхом соматичної гібридизації між різноманітними видами з роду Medicago підтверджується також результатами, отриманими при гібридизації протопластів конюшини лугової, ізольованих з тривало культивованих клітинних культур, що втратили як здатність до регенерації, так і до синтезу хлорофілу, з опроміненими мезофільними протопластами M. varia, які мають ознаку стійкості до канаміцинсульфату, або без цієї ознаки. У гібридних ліній, позначених номерами 3 і 4, що були отримані після злиття протопластів конюшини з опроміненими мезофільними протопластами люцерни, які не несуть селективних ознак, було індуковано утворення ембріоноподібних структур, а після цього і пагонів. Певно гени, що визначають здатність до регенерації у люцерни, не зчеплені з генами стійкості до канаміцинсульфату, тому що після гібридизації протопластів конюшини з мезофільними канаміцинстійкими протопластами люцерни були отримані як зелені, так і хлорофілдефектні клони,стійкі до канаміцинсульфату. В той же час немає даних про вплив дози опромінення на сегрегацію цих ознак. Як при дозі опромінення потопластів люцерни в 1000 Гр, так і при дозі в 25 Гр були отримані канаміцинстійкі гібридні клони між конюшиною і люцерною, здатні до позеленіння.

Таблиця 3. Асиметричні соматичні гібриди, отримані в ІКБГІ між видами родів Medicago і Trifolium.

Необхідно відзначити, що здатність до регенерації у асиметричних соматичних гібридів в значній мірі була знижена у порівнянні з клітинами донора або реципієнта. Так, в експериментах після злиття мезофільних протопластів M. borealis, лінія 94, з опроміненими мезофільними протопластами M. varia, що несуть ген стійкості до канаміцинсульфату, відібрані гібридні клони не утворювали ембріоподібних структур. В той же час отримані з протопластів батьків клітинні лінії з достатньо високою ефективністю формували такі структури і утворювали нормальні рослини.

В результаті проведених експериментів були розроблені методи злиття протопластів у видів Medicago і Trifolium з застосуванням інактивації одного з партнерів за допомогою гамма-опромінення. Також була показана можливість переносу при асиметричній соматичній гібридизації у видів Medicago і Trifolium ознаки стійкості до канаміцинсульфату, вбудованого в геном донора шляхом генетичної інженерії. Крім того, була показана можливість переносу ознаки регенераційної здатності при асиметричній соматичній гібридизації у цих видів.

Отримані результати по асиметричній соматичній гібридизації у видів з родів Medicago і Trifolium відкривають нові перспективи в селекції цих важливих сільськогосподарських культур. Вони дозволяють одержувати новий вихідний селекційний матеріал з корисними генами, перенесеними з родів і видів, у яких звичайне схрещування обмежене або взагалі неможливо. Крім того, відкривається можливість використати дані підходи для отримання цибрідів у цих видів.

модифікований рослина регенераційний бобовий

ВИСНОВКИ

Апробовано систему генетичної трансформації шляхом електропорації протопластів. Отримано канаміцинстійкі рослини люцерни і клітинні лінії сої та гороху. Молекулярно-біологічний аналіз і аналіз активності ферменту неоміцинфосфотрансферази підтвердив трансгенну природу отриманих ліній.

Запропоновано і апробовано метод, що підвищує регенераційну здатність у люцерни і гороху шляхом генетичної трансформації мутантом “shooty” Agrobacterium tumefaciens pGV 2206. Отримано регенераційні лінії люцерни і гороху, що дозволяє використовувати їх для генетичної трансформації іншими генами.

Лінія трансгенного гороху з підвищеною здатністю до регенерації була використана для наступної трансформації векторними конструкціями, що несуть селективний ген стійкості до канаміцинсульфату. Отримано трансгенні пагони гороху, що несуть мобільний Ds-елемент кукурудзи. Показано можливість використання “подвійної трансформації” для отримання трансгенних ліній гороху з генами ,що цікавлять.

Запропоновано і апробовано метод генетичної трансформації гороху за допомогою неонкогенних штамів Agrobacterium tumefaciens. Отримано трансгенні лінії, що несуть ген стійкості до фосфінотріцину.

Розроблено спосіб утворення насіння у гороху в асептичній культурі. Запропоновано методику мікроклонального розмноження гороху, що дозволить клонувати до 500 000 генетично однорідних особин в рік.

У трансгенних ліній гороху шляхом індукції утворенння насіння в культурі in vitro отримано потомство. Молекулярно-біологічний аналіз підтвердив присутність послідовностей ДНК перенесеного гена в поколіннях генетично модифікованого гороху. Протопласти видів рослин з родини бобових, таких як конюшина, люцерна, соя, горох, люпин, голубиний горох, при використанні розроблених методів культивування здатні до утворення клітинних колоній з високим ступенем ефективності.

Запропоновано і апробовано протоколи регенерації рослин з клітинних ліній, отриманих з протопластів, що були виділені з комерційних сортів люцерни і конюшини. Регенерація рослин у конюшини може бути отримана як шляхом прямого, так і непрямого ембріогенезу, що підтверджено результатами гістологічного аналізу.

Розроблено методику культивування протопластів і регенерації рослин у Oenothera hookeri - модельного об'єкту для молекулярно-генетичних досліджень.

Отримано асиметричні соматичні гібриди між видами з родини бобових. Показано можливість використання перенесеного гена неоміцинфосфо-трансферази як генетичного маркера для відбору соматичних гібридів у видів з родини бобових.

CПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ

Кучук Н.В. Генетическая инженерия высших растений.// Київ “Наукова думка”.-1997.-152с.

Банникова М.А., Головко А.Э. Хведынич О.А., Кучук Н.В. Регенерация растений у сахарной свеклы (Beta vulgaris) в культуре in vitro, гистологическое изучение процессов регенерации.// Цитология и генетика.-1995.-29, N 6.-С. 14-22.

Зубко Е.И., Кучук Н.В., Туманова Л.Г., Виконская Н.А, Глеба Ю.Ю. Генетическая трансформация гороха, опосредованная Agrobacterium tumefaciens// Биополимеры и клетка.-1990.-6, N 3.-P.77-80.

Кириченко И.В., Кучук Н.В., Сахно Л.А., Глеба Ю.Ю. Индивидуальное культивирование растительных протопластов и клеток.// Докл. АН Украины.-1990.- N 3.-C. 63-65.

Кучук Н.В., Каневский И.Ф. Методы генетической трансформации растений.// Биотехнология.- 1987.- 3, N 3. - С. 365-369.

Кучук Н.В. Выделение и культивирование протопластов пяти видов семейства бобовых// Физиология растений.-1989.-3, N 4. -С.821-824.

Кучук Н.В., Шаховский А.М., Комарницкий И.К., Глеба Ю.Ю. Получение генетически трансформированных клеточных клонов сои путем электропорации протопластов.// Биотехнология.- 1990.- N 5.- C. 30-31.

Кучук Н.В., Шаховский А.М., Воронин В.К., Глеба Ю.Ю. Получение асимметричных соматических гибридов в роде Medicago.// Биополимеры и клетка.-1991.-7, N 4.- С. 54-60.

Кучук М.В., Глеба Ю.Ю. Цитофізіологія та клітинна інженерія рослин.// Укр. бот. журнал.- 1992.-49, N 2.- С. 89-92.

Кучук Н.В. Генетическая трансформация высших растений, опосредованная бактериями из рода Agrobacterium. //Усп. совр. биол.-1997. - 117, N 6-C. 645-658.

Кучук Н.В., Глеба Ю.Ю. Применение трансгенных растений для целей практической селекции.// Цитология и генетика.-1997.- 31, N 4.-С. 102-114.

Кучук М. Генетична інженерія - входження в біологічну еру.// Вісн. НАН України.-1998.-N 3-4.- С. 28-34.

Сорочинский Б.В., Прохневский А.И, Гродзинский Д.М., Кучук Н.В. Иммунофлюоресцентная микроскопия компонентов цитоскелета в клетках растений.// Цитология и генетика.-1990.-24, N 3. -C. 64-65.

Радионенко М.А., Хведынич О.А., Гудзь В.Н., Банникова В.П., Кучук Н.В. Развитие соматических заpодышей в каллусной культуpе клевеpа лугового (Trifolium pratense L.)// Цитология и генетика.-1994.- 28, N 5.- С. 15-20.

Рачек Л.И., Стоpоженко С.В., Кучук Н.В. Генетическая трансфоpмация гоpоха констpукцией, содеpжащей Ds-элемент кукуpузы, методом электpопоpации.// Цитология и генетика.-1994.-28, N 6.- С. 49-54.

Рачек Л.И., Стоpоженко С.В., Кучук Н.В. Получение и молекулярно-биологический анализ трансгенных растений гороха (Pisum sativum L.), содержащих Ds-элемент кукурузы.// Биополимеры и клетка.-1995.-11, N 3-4.- С. 82-87.

Kuchuk N., Komarnitski I., Shakhovsky A., Gleba Y. Genetic transformation of Medicago species by Agrobacterium tumefaciens and electroporation of protoplasts.// Plant Cell Rep.-1990.- 8.-P. 660-663.

Kuchuk N.V., Gleba Y.Y. The development of biotechnological approaches for improvement of grain legume species.// In: Proc. of 1 Eur. Conference on Grain Legumes.- France, Anger, 1-3 June 1992.- P. 121-122.

Kuchuk N., Herrmann R.G., Koop H.U. Plant regeneration from leaf protoplasts of evening primrose (Oenothera hookeri).//Plant Cell Rep. - 1998.- 17, No. 8. - P. 601-604.

Radionenko M. A., Kuchuk N.V., Khvedynich O.A., Gleba Y.Y. Direct somatic embryogenesis and plant regeneration from protoplasts of red clover (Trifolium pratense L.)// Plant Sci.-1994.- 97. - P. 75-81.

Sarangi B.K., Kuchuk N.V., Gleba Y.Y. Isolation and culture of protoplasts of pigeonpea (Cajanus cajan L.).// Plant Cell Rep. -1992.-11.-P. 462-465.

А.с. 1549995 СССР от 15.11.89. Кучук Н.В., Глеба Ю.Ю. Способ выделения и культивирования протопластов из растительных тканей сои.

Момот В.П., Кучук Н.В., Пастернак Т.П. Методы клеточной иненерии растений. - Препринт 88.2, г. Киев "Комиссия УССР по делам ЮНЕСКО", 1988, 23с.

АНАТАЦІЇ

Кучук М.В. Використання прийомів генетичної інженерії і клітинної біології для отримання нових форм у видів з родини бобових і деяких інших рослин.

Дисертація у вигляді рукопису на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальностями 03.00.22 “Клітинна біологія”, 03.00.15 “Генетика”. Інститут клітинної біології та генетичної інженерії, Київ 1998.

Розроблено методику культивування протопластів і регенерації рослин у люцерни, конюшини, гороху і у Oenothera hookeri. Протопласти сої, люпину, голубиного гороху при використанні розроблених методів культивування здатні до утворення клітинних колоній з високим ступенем ефективності. Отримано канаміцинстійкі рослини люцерни і клітинні лінії сої та гороху шляхом електропорації протопластів. Запропоновано метод, що підвищує ефективність трансформації у гороху та люцерни - “подвійна трансформація”, що включає 1) отримання лінії рослин, які здатні до регенерації в культурі in vitro, за рахунок трансформації мутантом “shooty” A. tumefaciens pGV2206; 2) - трансформація ліній, які здатні до регенерації, селективним геном. Таким шляхом було отримано регенераційні лінії люцерни і гороху і далі трансгенні рослини гороху з Ds транспозоном кукурудзи та з геном стійкості до фосфінотрицину. Присутність генів в геномі рослин було доказано за допомогою методів полімеразної ланцюгової реакції, блот-гібридизації за Саузерном, NPT II аналізу, аналізу GUS активності, імуноферментного аналізу (ELISA). Міжвидові соматичні гібриди Medicago sativa +M.varia і M.borealis+ M.lupulina були отримані за допомогою асиметричної гібридизації. Хромосомний аналіз та блот-гібридизація рибосомальної ДНК підтвердили гібридну природу отриманих ліній. Було проведено гістологічний аналіз процесу регенерації у конюшини, гороху та цукрового буряка.

Ключові слова: бобові, цукровий буряк, Oenothera, протопласт, регенерація рослин, генетична трансформація, соматична гібридизація.

Кучук Н.В. Использование приемов генетической инженерии и клеточной биологии для получения новых форм у видов из семейства бобовых и у некоторых других растений.

Диссертация в виде рукописи на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальностям 03.00.22 “Клеточная биология” и 03.00.15 “Генетика”, Институт клеточной биологии и генетической инженерии, Киев 1998.

Разработаны методы культивирования протопластов и регенерации растений у люцерны, клевера, гороха и у Oenothera hookeri.Протопласты сои, люпина, голубиного гороха способны с высокой эффективностью образовывать клеточные колонии при использовании разработанных методов культи-вирования. Путем электропорации протопластов получены канамицин-устойчивые растения люцерны и клеточные линии сои и гороха. Предложен метод, повышающий эффективность трансформации у гороха и люцерны - двойная трансформация. Суть метода заключается в следующем 1) получение регенерационноспособных линий путем трансформации мутантом “shooty” A. tumefaciens; 2) трансформация регенерационных линий селективным геном. Таким образом были получены регенерационные линии люцерны и гороха и в дальнейшем трансгеные растения гороха, как с Ds транспозоном кукурузы, так и с геном устойчивости к фосфинотрицину. Присутствие генов в геноме растений было доказано с использованием методов полимеразной цепной реакции, блот-гибридизации по Саузерну, анализа активности NPTII, анализа GUS активности, иммуноферментного анализа (ELISA). Межвидовые соматические гибриды Medicago sativa+M.varia и M.borealis+ M.lupulina были получены с помощью асимметричной гибридизации. Хромосомный анализ и блот-гибридизация рибо-сомальной ДНК подтвердили гибридную природу полученных линий. Был проведен гистологический анализ процесса регенерации у клевера, гороха и сахарной свеклы.

Ключевые слова: бобовые, сахарная свекла, Oenothera, протопласт, реге-нерация растений, генетическая трансформация, соматическая гибридизация.

Kuchuk N.V. “Application of genetic engineering and cell biology approaches to produce new forms of species from Leguminosae family as well as of some other plants.”

Dissertation thesis as manuscript is presented for academic degree the doctor of biological sciences in fields 03.00.22 “Cell biology” and 03.00.15 “ Genetics”.

Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, Kiev, 1998.

Methods of protoplast cultivation and plant regeneration have been developed for alfalfa, clover and pea and for Oenothera hookeri. Protoplasts isolated from soybean, lupine and “pigeonpea” have been cultivated with high efficiency. But, only callus has been obtained. Protoplast electroporation has been successfully applied to produce transgenic alfalfa plants as well as soybean and pea calli by using kanamycine as selectable agent. To produce transgenic alfalfa and pea plants double transformation system has been developed. The adopted approach involves two transformation steps: 1) production of regenerable legume lines through transformation with "shooty" mutant of A.tumefaciens pGV2206; 2) transformation of these regenerable legume lines with the gene construct containing selectable genes. Regenerable transgenic alfalfa and pea lines have been obtained using the developed approach. Transgenic pea plants carried of maize Ds trasposon as well as phosphinotricine resistant plants have been produced. The presence of transferred genes in the genomes of produced plants has been confirmed by PCR, Southern blot hybridization, NPTII activity analysis, ELISA analysis, GUS activity analysis. Interspecific hybrid Medicago sativa+M.varia plants and M.borealis+ M.lupulina calli have been developed using the asymmetric somatic hybridization. Chromosome number analysis and Southern blot hybridization of ribosomal DNA have confirmed the hybrid nature of lines developed. Processes of plant regeneration of clover, pea and sugar beet have been studied with histological analysis.

Key words: legumes, sugarbeet, Oenothera, protoplast, plant regeneration, genetic transformation, somatic hybridization,

Размещено на Allbest.ru