Вікові особливості впливу ішемії на структурно-функціональний стан мітохондрій і перекисне окислення ліпідів серця щурів

Размещено на http://www.allbest.ru

ХАРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

03.00.04 - біохімія

Вікові особливості впливу ішемії на структурно-функціональний стан мітохондрій і перекисне окислення ліпідів серця щурів

Дзюба Вікторія Миколаївна

Харків - 1998

Робота виконана в науково-дослідному інституті біології Харківського державного університету Міністерства освіти України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Лемешко Віктор Васильович, директор науково-

дослідного інституту біології Харківського

державного університету Міністерства освіти України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Петренко Олександр Юрійович, провідний науковий

співробітник відділу експериментальної кріомеди-

цини інституту проблем кріобіології і кріомедицини

НАН України

доктор біологічних наук, професор

Жегунов Генадій Федорович, завідувач кафедрою

медичної біології, паразитології та генетики

Харківського державного медичного університету

Міністерства охорони здоров'я України

Провідна установа: Інститут геронтології (лабораторія молекулярної

генетики) АМН України, м.Київ.

Захист відбудеться "16" грудня 1998 р. о 15¹⁵ годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради К 64.051.17 при Харківському державному університеті Міністерства освіти України за адресою:

310077, м. Харків, м. Свободи, 4, ауд. ІІІ-15.

З дисертацією можна ознайомитися у Центральній науковій бібліотеці

Харківського державного університету Міністерства освіти України за адресою: 310077, м. Харків, м. Свободи, 4.

Автореферат розісланий "13" листопада 1998 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник Падалко В.І.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Серцево-судинні захворювання знаходяться на одному з перших місць в структурі захворювання та смертності населення в більшості країн світу [Лон Р.М., 1992]. Цей факт поряд з поширенням операційних втручань, які потребують тимчасового припинення кровообігу в органах, а також усе більш часте використання трансплантації органів, роблять розуміння молекулярних механізмів ішемічного пошкодження органів однією з найактуальніших проблем сучасної науки. Актуальність проблеми також зумовлюється необхідністю розробки нових засобів запобігання ішемічного пошкодження тканин.

В літературі є достатньо велика кількість даних відносно впливу ішемії на структурно-функціональний стан міокарду [Лемешко В.В. и др., 1986; Биленко М.В., 1989; Kleber A.G., 1990; Downey J.M., 1990; Coudray C. et al., 1995; Tanі M. et al., 1997]. Незважаючи на це, механізми ішемічного пошкодження, причинно-наслідний зв'язок між багатьма патогенетичними факторами та вікові особливості ішемічного пошкодження органів і тканин залишаються на сьогоднішній день недостатньо вивченими.

Одну з головних ролей у механізмі ішемічного та реперфузійного пошкодження тканин більшість дослідників приділяють вільнорадикальному перекисному окисленню ліпідів (ПОЛ), хоча дані відносно інтенсивності ПОЛ і стану ферментативної антиоксидантної системи серця при ішемії достатньо суперечні. Зокрема, існують дані, що свідчать, як про посилену генерацію вільних радикалів [Surі R.K. et al., 1996] і зниження активності антиоксидантних ферментів [Sіmmons T.W. et al., 1989; Porreca E. et al., 1994] при ішемії, так і про відсутність змін окислювального та антиоксидантного статусу серця [Jі L.L. et al., 1994; Coudray C. et al., 1995] при цьому виді патології.

В літературі немає також чіткої відповіді на питання про першорядне значення пошкодження різних субклітинних структур в ішемічному порушенні функцій клітин і тканин [Hoffsteіn S. et al., 1975; Nayler W.G., 1982; Демуров Е.А. и др., 1985]. Велику увагу в цьому плані привертають до себе мітохондрії [Schmіedl A. et al., 1990; Veіtch K. et al., 1992; Mіller T.W. et al., 1995], оскільки вони є основним споживачем кисню та одночасно головним джерелом енергії в клітині.

Виходячи зі сказаного вище та приймаючи до уваги раніш проведені дослідження в нашій та інших лабораторіях [Лемешко В.В. и др., 1989; Stіo M. et al., 1994] відносно впливу старіння тварин на рівень енергетичного обміну та ліпоперекисний потенціал міокарду, нам уявлялося важливим проведення порівняльного аналізу змін інтенсивності ПОЛ, його ферментативної регуляції та структур-но-функціонального стану мітохондрій міокарду молодих і старих щурів при ішемії.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планами науково-дослідних робіт: "Установити роль ферментативної регуляції перекисного окислення ліпідів в механізмах вікової перебудови та ішемічного пошкодження мембран міокарду та інших тканин" (N держ. реєстрації 0187.0009268, Харків: 1990), "Вивчення вікових особливостей ішемічного пошкодження тканин і розробка критеріїв пошуку нових кардіо- і геропротекторів" (N держ. реєстрації 01.9.10036893, Харків: 1993), "Дослідження ліпоперекисного механізму ішемічного пошкодження біомембран і розробка нових мембранопротекторів" (N держ. реєстрації UA 01008697P, Харків: 1996).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було з'ясування вікових закономірностей зміни структурно-функціонального стану мітохондрій, інтенсивності ПОЛ і його регуляції при тотальній ішемії та ішемії -реперфузії серця щурів.

Виходячи з мети, були визначені наступні задачі:

1. Вивчити вікові особливості впливу тотальної та перерваної ішемії серця щурів на інтенсивність ПОЛ.

2. Дослідити вікові особливості впливу ішемії на стан ферментативної антиоксидантної системи міокарду щурів.

3. Вивчити вікові особливості впливу тотальної ішемії на структур-но-функціональний стан мітохондрій серця.

4. Оцінити протиішемічну дію ряду природних метаболітів з метою розробки засобу захисту міокарду від ішемічного пошкодження.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше досліджено вікові зміни інтенсивності ПОЛ та його регуляції, пошкодження сарколеми та порушення структурно-функціонального стану мітохондрій у динаміці ішемічного пошкодження міокарду щурів і встановлено, що активація ПОЛ відбувається перед порушенням цілістності сарколеми та структури і функції мітохондрій і є складовою частиною механізму пошкодження мембран кардіоміоцитів. Виявлено, що найбільшу чутливість до ішемічного пошкодження виявляє міокард старих щурів.

На підставі дослідження протиішемічних властивостей ряду природних метаболітів розроблено середовище для запобігання ішемічного пошкодження тканин під час трансплантації органів, яке суттєво зменшує пошкодження мембран кардіоміоцитів, накопичення продуктів ПОЛ та поліпшує відновлення скорочувальної активності серця після ішемії - реперфузії (А.с. SU 1632427 А1, А 61 К 9/08).

Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених досліджень дозволяють глибше зрозуміти причинно-наслідний зв'язок між різними патогенетичними факторами, які призводять до незворотнього пошкодження серця при ішемії, і поширити існуючі уявлення про механізми реакції клітин міокарду на ішемічний вплив.

На основі одержаних даних відносно протиішемічних властивостей природних метаболітів розроблено середовище для попередження ішемічного пошкодження органів, яке може бути використаним в експериментальній і клінічній кардіології (А.с. SU 1632427 А1, А 61 К 9/08).

Особистий внесок здобувача. При виконанні дисертаційної роботи автор особисто вибрав та критично оцінив приступну літературу за темою дослідження. Під час виконання експериментальної частини роботи дослідження стосовно інтенсивності процесів ПОЛ та структур-но-функціонального стану мітохондрій частково були проведені спільно зі співробітниками НДІ біології ХДУ к.б.н. Нікітченко Ю.В. та к.б.н. Удовіковою О.А., що знайшло відображення у спільних публікаціях. Винесені на захист положення і результати одержані дисертантом самостійно. Дисертантом разом з науковим керівником проведено аналіз одержаних результатів і зроблені висновки по роботі.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідалися на ІІ національному конгресі геронтологів і геріатрів України (м.Київ, 1994 р.), на науково-практичній конференції "Наукові досягнення і проблеми виробництва лікарських засобів" (м.Харків, 1995 р.), на конференції молодих учених біологічного факультету і НДІ біології (м.Харків, 1997 р.), на ІІІ міжнародному сімпозіумі "Біологічні механізми старіння" (м.Харків, 1998 р.).

Публікації. Основні положення роботи опубліковані у 17 наукових роботах, серед яких 4 статті та 1 авторське свідоцтво.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури з проблеми, 3 розділів, що відображують результати власних досліджень, висновків та списку використаних джерел, який містить 239 джерел. Роботу викладено на 128 сторінках машинопису, ілюстровано 11 рисунками і 21 таблицею.

Матеріали і методи дослідження

У дослідах використовували щурів лінії Вістар 1-, 3-, 12- і 24-місячного віку. ішемічний щур серце мітохондрія

Ішемічне пошкодження клітин серця вивчали на двох моделях: тотальної ішемії і перерваної ішемії ізольованого серця, перфузованого середовищем Хенкса без глюкози за схемою "19 хвилин ішемії - 1 хвилина реперфузії". При вивченні протиішемічних властивостей природних метаболітів досліджувану речовину додавали у визначеній концентрації в середовище перфузії серця.

Аналіз пошкодження мітохондрій серця проводили в системі гомогенату тканини. Швидкість дихання і окислювального фосфорилювання визначали полярографічним методом [Кондрашева М.Н. и др., 1973]. По кривих споживання кисню розраховували швидкість дихання в метаболічних станах 3 і 4 за Чансом (V₃ і V₄), в роз'єднаному стані (V_3р) і дихальний контроль (ДК). АТФазну активність гомогенатів серця вимірювали потенціометричним методом [Болдырев А.А., 1977]. Високоамплітудне набухання мітохондрій реєстрували по зміненню оптичної щільності при довжині хвилі 610 нм [Удовикова Е.А., 1994].

Інтенсивність перекисного окислення ліпідів оцінювали по інтенсивності хемілюмінесценції (ХЛМ) і швидкості накопичення малонового діальдегіду (МДА) як описано в роботі [Лемешко В.В. и др., 1987]. Вміст гідроперекисів ліпідів у гомогенатах серця визначали за методом Ohkawa et al. з деякими модифікаціями [Лемешко В.В. и др., 1986].

Глутатіонпероксидазну активність вимірювали спектрофотометрично в спряженій глутатіонредуктазній реакції за методом Paglіa et al. з деякими модифікаціями [Лемешко В.В. и др., 1987]. Глутатіон-S-трансферазну активність вимірювали спектрофотометрично при 340 нм [Jones M. et al., 1980] з 1-хлор-2,4-дінітробензолом в якості субстрату. Глутатіонредуктазну активність визначали флуориметрично за зменшенням рівню NADPH [Герасимов А.М. и др., 1976]. Лактатдегідрогеназну активність в перфузатах ішемізованих і контрольних сердець вимірювали за методом [Иванов И.И. и др., 1974], реєструючи флуориметрично відновлення NAD⁺. Глюкозо-6-фосфатдегідрогеназну активність вимірювали флуориметрично по швидкості відновлення NADP⁺ [Baquer N.Z. et al., 1967]. NADP⁺-залежну малатдегідрогеназну активність визначали флуориметрично по швидкості відновлення NADP⁺ [Усатенко М.С. и др., 1974]. NADP⁺-залежну ізоцитратдегідрогеназну активність визначали флуориметрично по швидкості відновлення NADP⁺ [Bauman D.E. et al., 1970]. Супероксиддисмутазну (СОД) активність визначали спектрофотометрично за методом Frіdovіch у модифікації Ланкіна [Ланкин В.З. и др., 1976]. Каталазну активність визначали спектрофотометрично при 240 нм [Marklund S. et al., 1981]. Рівень неорганічного фосфату (Фн) визначали як описано [Рыбальченко В.К. и др., 1988].

Екстрагування ліпідів із мембран міокарду проводили як описано [Folch J. et al., 1957]. Вміст загальних ліпідів визначали за мето-дом [March J.B. et al., 1966]. Антиокислювальну активність екстраго-ваних ліпідів визначали як описано в роботі [Клебанов Г.И. и др., 1988].

Вміст білку в зразках визначали за методом Лоурі і співавт. у модифікації Міллера [Mіller G.L., 1959].

Статистичну обробку результатів проводили за методом Стьюден-та-Фішера [Терентьев П.В. и др., 1977].

Основні результати дослідження

Вплив ішемії серця на інтенсивність перекисного окислення ліпідів і його ферментативну регуляцію у щурів різного віку. Дослідження інтенсивності ПОЛ, яку характеризували по накопиченню МДА і інтенсивності хемілюмінесценції, в гомогенатах серця щурів різного віку показало, що в контролі спостерігалось істотне зниження з віком інтенсивності аскорбатіндукованого ПОЛ. Ці результати узгоджуються з раніш одержаними в нашій лабораторії даними [Лемешко В.В. и др., 1987]. Динаміка швидкості накопичення МДА була якісно схожою з динамікою зміни інтенсивності хемілюмінесценції.

Після 3 годин перерваної ішемії інтенсивність аскорбат-індукованого ПОЛ різко збільшувалася відносно контролю: в 1,4 - 1,5 рази - у 1-місячних і більш ніж у 5 разів - у 12- і 24-місячних щурів. Схожі вікові особливості впливу ішемії на інтенсивність ПОЛ були показані і для печінки [Никитченко Ю.В. и др., 1997].

Для з'ясування вікових особливостей пошкодження тканин при ішемії є важливим питання про те, в якій мірі більш висока інтенсивність ПОЛ у серці молодих щурів у контролі відбивається на ступеню ішемічного пошкодження мембран. Критерієм ішемічного пошкодження мембран кардіоміоцитів може бути вихід лактатдегідрогенази (ЛДГ) із ізольованого перфузованого серця [Coudray C. et al., 1995]. Встановлено, що динаміка виходу ЛДГ у молодих і старих щурів помітно відрізняються. У ранні строки ішемії - реперфузії (20 - 40 хвилин) ступінь пошкодження мембран кардіоміоцитів був у 1,5 - 2,2 рази вище у 1-місячних щурів, ніж у 24-місячних, тоді як при більш тривалій ішемії - реперфузії (100 хвилин) - у старих вище в 1,7 рази у порівнянні з молодими нестаттєвозрілими тваринами. Максимальний вихід ферменту із сердець тварин усіх досліджених груп відбувався між 80 і 100 хвилинами перерваної ішемії.

З метою з'ясування послідовності і причинно-наслідного зв'язку між окремими ланками ішемічного пошкодження кардіоміоцитів здавалося важливим дослідження зміни інтенсивності ПОЛ при перерваній ішемії різної тривалості. Установлено, що вже 20-хвилинна ішемія призводила до збільшення інтенсивності ХЛМ у 12-місячних щурів більш, ніж у 2 рази відносно контролю. У 1-місячних щурів відносні зміни були значно нижчими. При порівнянні даних по виходу ЛДГ і інтенсивності ХЛМ можна зробити висновок, що активація ПОЛ при ішемії серця значно передує і, очевидно, в значній мірі зумовлює пошкодження сарколеми.

Активацію вільнорадикального окислення ліпідів при ішемії тканин часто пов'язують з послабленням антиоксидантного захисту [Меерсон Ф.З., 1984; Биленко М.В., 1989; Kіrshenbaum L.A. et al., 1993; Porreca E. et al., 1994]. В літературі є достатньо переконливі дані, які свідчать, що при ішемії зменшується вміст практично всіх жиро- і водорозчинних антиоксидантів [Yoshіda S. et al., 1982; Меерсон Ф.З.,1984; Биленко М.В., 1989; ]. Нами також встановлено зниження антиокислювальної активності ліпідів мембран ( що є показником стану неферментативної антиоксидантної системи) вже на 40 хв ішемії серця, яке при перерваній ішемії було більш вираженим, ніж при тотальній. Відносно стану ферментативної антиоксидантної системи при ішемії міокарду дані літератури достатньо суперечні.

Одержані в результаті дослідження впливу ішемії на ферментативну антиоксидантну систему міокарду щурів дані (табл.2) свідчать, що в контролі глутатіонпероксидазна і глутатіон-S-трансферазна активності у старих щурів були вірогідно вище, ніж у молодих тварин. Ці результати узгоджуються з раніш одержаними в нашій лабораторії [Лемешко В.В. и др., 1987] і можуть пояснювати виявлене зниження ліпоперекисного потенціалу міокарду з віком тварин. 30-хвилинна тотальна ішемія не призводила до вірогідної зміни активності досліджуваних ферментів в жодній віковій групі. 120-хвилинна ішемія викликала збільшення СОД активності у 3-місячних щурів в 1,6 рази у порівнянні з контролем і 30-хвилинною ішемією. При цьому у молодих тварин спостерігалося також істотне збільшення глутатіонпероксидазної активності і тенденція до збільшення каталазної активності. У старих тварин ішемія практично не призводила до зміни активності вивчених антиоксидантних ферментів. При дослідженні впливу ішемії на глутатіонредуктазну, ізоцитрат-, малат- і глюкозо-6-фосфатдегідрогеназну активності міокарду щурів встановлено, що 30-хвилинна ішемія не призводила до зміни вивчених активностей у щурів 3- і 24-місячного віку. А при більш тривалій ішемії (120 хв) спостерігалося вірогідне збільшення ізоцитратдегідрогеназної активності в міокарді 3-місячних щурів.

В даній роботі було також досліджено вплив відносно більш жорсткого ішемічного пошкодження, а саме ішемії-реперфузії, на стан ферментативної антиоксидантної системи і встановлено, що вже на 40 хв перерваної ішемії спостерігалася тенденція до збільшення СОД і глутатіонпероксидазної (з гідроперекисом кумола) активностей і збільшення каталазної і Se-залежної глутатіонпероксидазної активностей в 1,5 і 1,3 рази, відповідно, у відношенні до контролю. Глутатіон-S-трансферазна активність при перерваній ішемії, як і при тотальній, істотно не змінювалась на ранній стадії ішемії. При збільшенні часу ішемії до 60 хв спостерігалося подальше збільшення каталазної активності тоді, як Se-залежна глутатіонпероксидазна активність знижувалась до рівню контроля. Активність ферментів, які забезпечують відновлювальними еквівалентами глутатіонзалежну антиоксидантну систему серця, на ранній стадії перерваної ішемії істотно не змінювалась. При більш тривалій ішемії глутатіонредуктазна активність знижувалась в 1,5 рази, а ізоцитратдегідрогеназна - збільшувалась в 1,2 рази у порівнянні з контролем.

Одержані результати дозволяють зробити висновок, що активності вивчених антиоксидантних ферментів в серці на ранній стадії ішемії не змінюються чи навіть збільшуються.

Таким чином, розглянуті дані свідчать, що вже на 20 хв ішемії спостерігається активація ПОЛ, яка відбувається перед пошкодженням мембран кардіоміоцитів. При цьому відносна активація ПОЛ і пошкодження сарколеми у відповідь на дію ішемії були більш вираженими у старих тварин. Відсутність істотної зміни ферментативної антиоксидантної системи при ішемії може свідчити про можливість ефективного протиішемічного захисту серця шляхом додаткового забезпечення цієї системи природними метаболітами, які підвищують рівень донорів відновлювальних еквівалентів (NADPH і GSH).

Вікові особливості впливу ішемії міокарду на структур-но-функціональний стан мітохондрій серця щурів. Одним з наслідків активації ПОЛ на ранній стадії ішемії може бути зміна структур-но-функціонального стану мітохондрій і, як результат, порушення енергозабезпечення міокарду. Дослідження впливу ішемії на дихання та окислювальне фосфорилювання мітохондрій серця молодих і старих щурів показало (табл. 3), що вже через 30 хв ішемії в мітохондріях міокарду старих (24 міс) щурів спостерігалося вірогідне зменшення швидкості дихання в стані 3 при окисленні сукцинату. Істотне зменшення даного параметру у молодих тварин відбувалося лише на 120 хв тотальної ішемії. Якісно схожим чином змінювалось і дихання в роз'єднаному стані (V_3р). V₄ істотно не змінювалась. Величина ДК у старих щурів вірогідно знижувалась на 30 хв, а у молодих - на 120 хв ішемії.

На відміну від сукцинату, при окисленні глутамату з малатом спостерігалося зменшення V₄ у порівнянні з контролем вже на 30 хв тотальної ішемії в 1,4 і 1,6 рази для 3- і 24-місячних щурів, відповідно. На 120 хв спостерігалося подальше зменшення цього параметру, причому більш виражене - у старих щурів. Характер відповіді V₃ и V_3р на дію ішемії при окисленні глутамату з малатом не відрізнявся якісно від такого при окисленні сукцинату. Зниження активності дихального ланцюгу мітохондрій при окисленні глутамату з малатом на більш ранній стадії ішемії серця, ніж при окисленні сукцинату, може бути поясненим більшою чутливістю до дії ішемії дихального комплексу NADH-дегідрогеназа - убіхінон [Rouslіn W., 1983].

Порушення дихання та окислювального фосфорилювання мітохондрій при ішемії може бути пов'язаним не тільки зі зниженням активності власно дихального ланцюгу мітохондрій, але і з пошкодженням безпосередньо АТФ-синтетазного комплексу.

Дійсно, із наведених в табл. 3 даних видно, що ДНФ-стимульована АТФазна активність гомогенату міокарду в середовищі інкубації без Mg²⁺ у старих тварин знижувалась вже на 30 хв тотальної ішемії. У молодих щурів вірогідне зниження даної активності спостерігалося лише на 120 хв ішемії. Активація роботи комплексу додаванням в середовище інкубації Mg²⁺ нівелювала вплив ішемії на дану активність у молодих щурів, у старих щурів залишалась лише тенденція до зниження тільки після 120 хв ішемії.

Чутливим показником зміни структурно-функціонального стану мітохондрій при ішемії [Лемешко В.В. и др., 1989] є коефіцієнт стимулювання АТФазної активності 2,4-дінітрофенолом. В усіх досліджених вікових групах спостерігалося вірогідне зменшення цього параметру вже на 30 хв ішемії, причому у старих тварин в 2,2 рази відносно контролю, а у молодих - тільки в 1,8 рази (в середовищі інкубації без Mg²⁺). Дослідження олігоміцинчутливої, саме мітохондріальної, АТФазної активності дозволило встановить, що її зміна при ішемії була якісно схожою зі зміною загальної ДНФ-стимульованої АТФазної активності, але більш вираженою. Олігоміцинрезистентна, не мітохондріальна, АТФазна активність складала лише одну п'яту частку від загальної ДНФ-стимульованої АТФазної активності і істотно не змінювалася при тотальній ішемії. Ці дані можуть свідчити про те, що мітохондріальна АТФаза вносить основний вклад в ДНФ-стимульовану АТФазну активність клітини і, очевидно, саме вона в першу чергу зазнає вплив ішемії.

Зміна функціонального стану мітохондрій при дії різних фізичних і хімічних факторів, а також при ряді патологічних становищ і, зокрема, при ішемії може призводити до високоамплітудного набухання органел, ступінь якого, як правило, залежить від інтенсивності і тривалості дії фактору чи важкості захворювання [Schmіedl A. et al., 1990].

Проведені дослідження показали, що 30-хвилинна ішемія призводила до зменшення часу напівнабухання мітохондрій у старих щурів в 1,5 рази у порівнянні з контролем. У молодих щурів вірогідне зниження даного параметру спостерігалося лише на 120-й хв ішемії. Схожа вікова спрямованість зміни часу напівнабухання у відповідь на дію ішемії одержана раніш в нашій лабораторії також і для мітохондрій печінки щурів [Удовикова Е.А., 1994].

За думкою ряду авторів, однією з основних причин збільшення проникності внутрішньої мембрани мітохондрій і, як наслідок, розвитку набухання, є зміна структури мембрани за рахунок активації ПОЛ [Суслова А.И. и др., 1988; Carbonera D. et al., 1988], яка в наших дослідженнях спостерігалася вже на 20 хв ішемії. Причинами високо-амплітудного набухання мітохондрій можуть бути також внутріклітинний ацидоз, накопичення продуктів розпаду аденіннуклеотидів та інші фактори [Crompton M. et al., 1990]. Дійсно, нами виявлено, що вже на 10 хв тотальної ішемії міокарду щурів спостерігається вірогідне збільшення концентрації протонів і фосфата неорганічного.

Таким чином, наведені дані про структурно-функціональний стан мітохондрій серця молодих і старих щурів свідчать, що при тотальній ішемії серця щурів зміна інтенсивності дихання і окислювального фосфорилювання, АТФазної активності і ступеню високоамплітудного набухання мітохондрій була більш вираженою у старих тварин.

Слід відзначити, що виявлені вікові особливості дії ішемії на структурно-функціональний стан мітохондрій були якісно схожими з особливостями зміни інтенсивності ПОЛ. Не виключено, що активація ПОЛ на відносно ранній стадії ішемії може спричинювати порушення системи мітохондріального окислення. Іншою, і не менш важливою, причиною цього може бути недостатня забезпеченість міокарду при ішемії субстратами окислення.

Протиішемічна дія природних метаболітів. Розглянуті в попередньому розділі дані свідчать, що додаткове забезпечення серця природними метаболітами, які є субстратами мітохондріального окислення та джерелом відновлювальних еквівалентів для NADPH-GSH-залежної антиоксидантної системи, може бути ефективним засобом захисту міокарду від ішемічного пошкодження.

З цією метою в даній роботі було проведено дослідження протиішемічних властивостей ряду природних метаболітів. Протиішемічну дію досліджуваних речовин характеризували по їх здібності уповільнювати вихід ЛДГ із кардіоміоцитів при перерваній ішемії і зменшувати накопичення одного з кінцевих продуктів ПОЛ - МДА.

В результаті проведених експериментів було встановлено, що з усіх досліджених метаболітів, які відповідають за генерацію відновлювальних еквівалентів в клітині (ізоцитрат, глюкозо-6-фосфат, 6-фосфоглюконат, малат, GSH), найбільш ефективну протиішемічну дію мав ізоцитрат. Так, зокрема, додавання ізоцитрату в концентрації 5 мМ в середовище перфузії серця призводило до зменшення виходу ЛДГ із кардіоміоцитів на 100-й хв ішемії в 1,8 рази у порівнянні з контролем і зменшенню накопичення МДА через 3 години ішемії - реперфузії в 1,4 рази. Дані літератури про те, що основну роль в підтримуванні рівню NADPH у міокарді грає ізоцитратдегідрогеназа [Pfeіfer R. et al., 1986], дозволяють пояснити спостережену ефективну протиішемічну дію ізоцитрату.

Дослідження інших природних метаболітів (глюкозо-1-фосфат, глутамат, -кетоглутарат, сукцинат, піруват, глюкоза) дозволило встано-вити, що достатньо виразну протиішемічну дію мали глутамат, піруват і глюкоза, які при додаванні в середовище перфузії в концентрації 5 мМ зменшували вихід ЛДГ із кардіоміоцитів на 100-й хв ішемії - ре-перфузії в 1,6, 1,8 і 2,2 рази, відповідно, у порівнянні з контролем. Причому, усі досліджені природні метаболіти, які здатні ефективно уповільнювати вихід ЛДГ із кардіоміоцитів, істотно зменшували і накопичення МДА.

Одержані дані стали підставою для дослідження впливу комплексів із 2 чи 3 найбільш ефективних метаболітів на ступінь ішемічного пошкодження серця. Самим ефективним із них виявився комплекс, який складається із глутамату, ізоцитрату і пірувату у відповідних кількостях. Дані, наведені в табл. 4, свідчать, що комплекс метаболітів в концентрації 1,0, 2,5 і 5,0 мМ (кожного із метаболітів) вірогідно знижував вихід ЛДГ в перфузат. При цьому найбільш ефективним був комплекс метаболітів в концентрації 2,5 мМ. Так, на 100-й хв ішемії цей комплекс уповільнював вихід ЛДГ в 3,4 рази відносно контролю.

Ступінь захисної дії "потрійного" комплексу збільшувалася при доповнюванні його 5 мМ глюкози. В цьому випадку вихід ЛДГ в перфузат на 100-й хв перерваної ішемії знижувався в 1.3 рази додатково у відношенні до такого при використанні тільки "потрійного" комплексу і в 4,5 рази - у відношенні до контролю. Доповнений глюкозою комплекс метаболітів призводив до вірогідного зниження рівню МДА в 1,9 рази у порівнянні з контролем і в 1,4 рази у порівнянні з рівнем МДА, який зареєстровано для сердець, які перфузували з додаванням тільки глюкози. В наших дослідженнях також показано, що цей комплекс покращував поновлення скорочувальної активності серця на відносно ранній стадії ішемії-реперфузії і зменшував набряк міокарду.

Таким чином, проведені дослідження свідчать, що розроблений комплекс природних метаболітів (5 мМ глюкози і по 2,5 мМ ізоцитрату, і глутамату) значно уповільнює ішемічне пошкодження серця. На підставі цих даних була подана заявка на винахід і отримано авторське свідоцтво на середовище, яке попереджує ішемічне пошкодження тканин при трансплантації органів (А.с. SU 1632427 А1, А 61 К 9/08).

Висновки

1. Проведено порівняльний аналіз зміни інтенсивності перекисного окислення ліпідів, його ферментативної регуляції та структурно-функціонального стану мітохондрій в динаміці ішемічного пошкодження міокарду молодих і старих щурів і встановлено, що активація ПОЛ відбувається вже через 20 хвилин ішемії і передує порушенню бар'єрної функції сарколеми. В той же час активність ряду антиоксидантних ферментів в серці щурів на ранній стадії тотальної та перерваної ішемії не змінюється або навіть підвищується (суперок-сиддисмутазна при тотальній ішемії, каталазна і глутатіонпероксидазна - при перерваній ішемії).

2. Вікові особливості впливу ішемії на структурно-функціональний стан мітохондрій серця щурів виявлялися в наступному:

- в зниженні інтенсивності дихання в метаболічних станах 3 і 3р і дихального контролю при окисленні сукцинату та інтенсивності дихання в станах 3, 3р і 4 (за Чансом) при окисленні глутамату з малатом, яке у старих щурів спостерігалося на більш ранній стадії ішемії, ніж у молодих тварин;

- в зниженні загальної ДНФ-стимульованої та олігоміцинчутливої АТФазної активностей у 24-місячних щурів через 30 хвилин ішемії, а у 3-місячних - тільки через 120 хвилин ішемії;

- в зменшенні часу напівнабухання мітохондрій, яке у старих тва-рин відбувалося на більш ранній стадії ішемії, ніж у молодих щурів.

3. Встановлено, що відносна активація ПОЛ, пошкодження сарколеми і порушення структурно-функціонального стану мітохондрій серця були більш значними у старих, 24-місячних, щурів. Виходячи з особливостей змін досліджених процесів у динаміці ішемічного пошкодження, припускається, що порушення структурно-функціонального стану мітохондрій міокарду старих щурів на ранній стадії ішемії зумовлено більш вираженою активацією ПОЛ у старих тварин.

4. Досліджено протиішемічні властивості ряду природних метаболітів, які є донорами відновлювальних еквівалентів для ферментативної антиоксидантної системи і субстратами мітохондріального окислення, та на основі комплексу з найбільш ефективних метаболітів розроблено середовище для попередження ішемічного пошкодження тканин (А.с. SU 1632427 А1, А 61 К 9/08).

Список праць, що відображають основні положення дисертації

1. Лемешко В.В., Никитченко Ю.В., Троянова (Дзюба) В.Н., Маланда П., Белостоцкая Л.И. Особенности ишемического повреждения мембран и активация перекисного окисления липидов в миокарде крыс разного возраста // Укр. биохим. журн. - 1989. - Т. 61,N2. - С. 98-105.

2. Троянова (Дзюба) В.Н., Никитченко Ю.В., Лемешко В.В. Возрастные особенности повреждения мембран сердца крыс при эксперименталь-ной ишемии и возможность защиты природными метаболитами // Вест-ник Харьковского ун-та. - 1990. - N346. - С. 31-33.

3. Nіkіtchenko Yu.V., Dzuba V.N., Lemeshko V.V. Protectіve effect of some natural metabolіtes under іschemіa of rat hearts // School of Fundam. Med. J. - 1996. - V. 2, N1. - P. 24-27.

4. Никитченко Ю.В., Дзюба В.Н., Лемешко В.В. Перекисное окисление липидов и его ферментативная регуляция при ишемии печени молодых и старых крыс // Биологический вестник. - 1997. - Т. 1, N1. -С. 23-29.

5. А.с. SU 1632427 А1, А 61 К 9/08. Среда для предотвращения ишеми-ческого повреждения тканей при трансплантации органов /Ю.В.Никит-ченко, В.Н.Троянова (Дзюба), В.В.Лемешко (СССР). - N 4443960/14; Заявлено 20.06.88; Опубл. 07.03.91, Бюл.N9. - 4 с.

6. Лемешко В.В., Никитченко Ю.В., Дзюба В.Н. Перекисное окисление липидов, его ферментативная регуляция и состояние митохондрий в динамике ишемии сердца и печени молодых и старых крыс // ІІ нац. конгр. геронт. и гериатр. Украины. - Киев, 1994. - С. 388.

7. Дзюба В.Н., Удовикова Е.А., Шмонина Т.А., Лемешко В.В. Влияние ишемии на структурно-функциональное состояние митохондрий и пере-кисное окисление липидов сердца молодых и старых крыс // ІІІ меж-дун. симп. "Биологические механизмы старения". - Харьков, 1998. - С. 20.

Анотація

Дзюба В.М. Вікові особливості впливу ішемії на структур-но-функціональний стан мітохондрій і перекисне окислення ліпідів серця щурів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Харківський державний університет, Харків, 1998.

Дисертацію присвячено дослідженню механізму ішемічного пошкодження серця щурів. В роботі вивчено вікові особливості зміни перекисного окислення ліпідів, його ферментативної регуляції та структури і функції мітохондрій серця щурів при ішемії органу. Встановлено, що активація ПОЛ при ішемії передує порушенню бар'єрної функції сарколеми і структурно-функціонального стану мітохондрій серця щурів. Показано, що серце старих щурів менш стійке до дії ішемії. Досліджено протиішемічну дію ряду природних метаболітів і на підставі одержаних даних розроблено середовище для попередження ішемічного пошкодження тканин при трансплантації органів.

Ключові слова: ішемія міокарду, перекисне окислення ліпідів, ферментативна антиоксидантна система, дихання і окислювальне фосфорилювання мітохондрій, високоамплітудне набухання мітохондрій, протиішемічний засіб.

Дзюба В.Н. Возрастные особенности влияния ишемии на структурно-функциональное состояние митохондрий и перекисное окисление липидов сердца крыс. -Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Харьковский государственный университет, Харьков, 1998.

Диссертация посвящена исследованию механизма ишемического повреждения сердца крыс. В работе изучены возрастные особенности изменения интенсивности перекисного окисления липидов, его ферментативной регуляции и структуры и функции митохондрий сердца крыс при ишемии органа. Установлено, что активация ПОЛ при ишемии предшествует нарушению барьерной функции сарколеммы и структурно-функционального состояния митохондрий сердца крыс. Показано, что сердце старых крыс менее устойчиво к действию ишемии. Исследовано противоишемическое действие ряда природных метаболитов и на основании полученных данных разработана среда для предотвращения ишемического повреждения тканей при трансплантации органов.

Ключевые слова: ишемия миокарда, перекисное окисление липидов, ферментативная антиоксидантная система, дыхание и окислительное фосфорилирование митохондрий, высокоамплитудное набухание митохондрий, противоишемическое средство.

Dzuba V.N. Age peculіarіtіes of іschemіa effect on mіtochondrіal structural-functіonal state and lіpіd peroxіdatіon of rat heart. - Manuscrіpt.

Thesіs for a candіdate's degree by specіalіty 03.00.04 -bіochemіstry. - Kharkov State Unіversіty, Kharkov, 1998.

The dіssertatіon іs devoted to іnvestіgatіon of mechanіsm of rat heart іschemіc іnjury. Age peculіarіtіes of changes of lіpіd peroxіdatіon, іts enzymatіc regulatіon and mіtochondrіa structure and functіon іn rat heart durіng myocardіal іschemіa were studіed. Іt was establіshed that lіpіd peroxіdatіon actіvatіon durіng іschemіa precedes the damage of sarcolemmal barrіer functіon and mіtochondrіal structural-functіonal state іn rat heart. Old rat heart has proved to be less stable to іschemіa effect. The antі-іschemіc effect of some natural metabolіtes was studіed and on the basіs of obtaіned data the medіum for tіssue іschemіc іnjury preventіon durіng organ transplantatіon has been worked out.

Key words: myocardіal іschemіa, lіpіd peroxіdatіon, enzymatіc antіoxіdant system, respіratіon and oxіdatіve phosphorylatіon of mіtochondrіa, hіgh amplіtude swellіng of mіtochondrіa, antі-іschemіc remedy.

Размещено на Allbest.ru