Выбор фермента рестрикции

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Выбор фермента рестрикции

Обсуждаемые молекулярные основы вариабельности членов семейств ГВР заключаются в разном количестве повторяющихся единиц в каждом ГВР-локусе. Чтобы выявить вариации подобного рода с возможно большим разрешением, необходимо гидролизовать ДНК ферментом рестрикции, который расщепляет достаточно часто, но не нарушает целостности повторяющихся единиц ГВР. Для обсуждаемых ГВР удобно использовать рестриктазы HinW, Mbol, AluA и Haelll.

В некоторых случаях встречаются фрагменты с такими близкими значениями Ш, что их нельзя разрешить на картине фореза. Тогда полезно повторить эксперимент с использованием другого фермента. При этом имеет место «перетасовка» рестриктов ГВР, что дает нам лишний шанс разделить сомнительные полосы. Когда используется фермент рестрикции, узнающий четырехнуклеотидную последовательность, эффект «перетасовки» обычно едва заметен, особенно для высокомолекулярных фрагментов, так как вклад в величину этих фрагментов фланкирующих последовательностей невелик, независимо от того, какой фермент используется. Тем не менее, некоторые полосы можно идентифицировать благодаря тому, что их подвижность по другим ферментам будет лишь немного изменена. Для достижения эффекта «перетасовки» наиболее подходящим считают фермент рестрикции Haelll.

Для каждой рестриктазы существуют оптимальные условия реакции (температура, состав буфера), которые приводятся в описании, прилагаемом фирмой-изготовителем. Например, фирма Ферментас предлагает для работы со своими рестриктазами пять буферных растворов - B (голубой), G (зеленый), O (оранжевый), R (красный) и Y (желтый).

Если необходимо подобрать условия гидролиза ДНК обеими рестриктазами одновременно, это можно сделать на основании данных об активности каждой из рестриктаз во всех пяти буферных системах (взятых из каталога фирмы, см. таблицу) или воспользоваться программой DoubleDigest™, которую можно найти на сайте www.fermentas.com. Эта программа рекомендует 2хY (Tango) буфер (двухкратный желтый буфер) для одновременного гидролиза NcoI и BglII. В нем обе рестриктазы имеют 100% активность.

Единица активности рестриктазы - это количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК в реакционной смеси 50 мкл при оптимальных условиях (обычно при 37 ^оС) за час. Рестриктазы хранятся при -20 ^оС в буфере с 50% глицерина. Ферменты, вынутые из морозильной камеры, следует держать только во льду и не дольше, чем это необходимо. Объем добавляемых рестриктаз не должен превышать 1/10 от объема реакционной смеси, иначе избыток глицерина ингибирует реакцию.

Электрофорез в агарозном геле и выделение фрагментов ДНК из геля.

Приготовление образцов ДНК для электрофореза.

ДНК, получаемая обычным способом, обладает достаточно хорошим качеством для проведения анализа методом геномной дактилоскопии. Наилучшие результаты получают, если на дорожку приходится 1-5 мкг ДНК. Поскольку имеет значение не только присутствие, но и интенсивность отдельной полосы, важно достичь равномерного распределения материала между всеми дорожками геля. Хорошо известно, что измерения оптической плотности растворов ДНК дают ненадежные значения концентраций, которые могут рассматриваться только как грубые оценки. Для проверки полноты рестрикции и правильности нанесения необходимо поставить контрольный форез с аликвотами гидролизата ДНК и на основе этого подобрать оптимальное количество наносимой пробы.

Иногда для уменьшения наносимого объема бывает нужно осадить ДНК из рестрикционной смеси, но обычно в этой процедуре все же нет необходимости: хорошие результаты получаются и без этапа очистки. Если образец был осажден, очень важно промыть его 70%-ным этанолом для удаления избытка соли, которая нарушает подвижность фрагмента ДНК; важно также высушить осадок под вакуумом перед растворением» иначе присутствие следов этанола вызовет флотацию материала из лунок при нанесении.

Продукты рестрикции анализируют или фракционируют с помощью электрофореза в агарозном геле. Для удобства нанесения на гель к образцу добавляют 4-х кратный раствор «краски», содержащий краситель бромфеноловый синий и 40% глицерина. Двуцепочечную ДНК прокрашивают флуоресцентным красителем бромистым этидием, молекулы которого интеркалируют между азотистыми основаниями ДНК. Визуализация полос происходит при облучении геля УФ светом (оптимальна длина волны 305-320 нм). В качестве маркера используют наборы фрагментов ДНК с известной длиной (например, маркер /PstI представляет собой смесь продуктов гидролиза ДНК фага лямбда рестриктазой PstI).

Оптимальные условия электрофореза для геля, используемого при геномной дактилоскопии, определяются требованиями к информативности получаемых отпечатков ДНК. Если данные необходимы для подтверждения структуры родословной или для окончательного уточнения картины в случае неудачно прошедшей гибридизации, или для сравнения образцов ДНК из разных тканей индивида, то желательно получить информацию о возможно большем числе полос, поддающихся разрешению. Для этих случаев наиболее удобно использовать 1%-ный агарозный гель и вести форез при 2 В/см в течение 48 ч с двумя сменами форезного буфера. Такие условия обеспечивают разрешение полос в диапазоне 2-25 т. п.н. Для сегрегационного анализа более важно достичь хорошего разделения наиболее высокомолекулярных гиперполиморфных фрагментов. В этом случае следует вести форез в 0,8%-ном геле при 1,5 В/см в течение 72 ч с пятью сменами форезного буфера. При этих условиях все фрагмент короче 3 т. п.н. выходят из геля, и в нем остаются оптимально разделенными более информативные длинные фрагменты, по которым наблюдается высокая степень гетероаиготности.

Лигирование обычно осуществляют с помощью фермента ДНК-лигазы фага Т4. Буфер для лигирования имеет следующий состав: 66 мМ Tris-HCl (pH 7.6), 5 mM MgCl₂, 5 mM DTT. ATP (0.5 mM) добавляется отдельно. При лигировании необходимы достаточно высокие концентрации ДНК (примерно 10 мкг/мл), причем молярная концентрация вставки должна быть в 5-10 раз выше, чем вектора.

Пример:

Рестрикция. Необходимые реагенты: Плазмиды pQE60, pSL1180/EGFP; 10 х Y буфер; Рестриктазы NcoI BglII; вода mQ (для приготовления всех растворов используется только специально очищенная вода mQ). Все растворы и ферменты следует держать во льду. Для линеаризации вектора в эп.пробирке смешивают растворы в следующем порядке: Вектор pQE60 - 1 мкг в 14 мкл воды 10 x Y буфер - 4 мкл NcoI - 1 мкл BglII -1 мкл. Итого - 20 мкл Для получения вставки смешивают: pSL1180/EGFP - 5 мкг в 14 мкл воды 10 x Y буфер - 4 мкл NcoI - 1 мкл BglII -1 мкл. Итого - 20 мкл Рестрикционные смеси инкубировать при при 37 ^оС 2 часа. После 1 часа инкубации аликвоты проанализировать с помощью аналитического гель-электрофореза.

Электрофорез в агарозном геле. Необходимые реагенты: Агароза; Буфер ТВЕ; Бромистый этидий (10 мг/мл); 4 х раствор для нанесения на гель («краска»); Маркер /PstI.

За время рестрикции следует залить 0.8% агарозный гель. Для этого в стеклянном стакане смешивают 400 мг агарозы с 50 мл буфера TBE, содержащего 1 мкг/мл бромистого этидия (осторожно - канцероген) и плавят в микроволновой печи 3-5 минут до полного растворения агарозы (следить, чтобы не было бурного кипения). Раствор остужают примерно до 50 ^оС и заливают в предварительно собранную кассету. Дают агарозе застыть в течении 15-30 минут, вынимают гребенку и помещают гель в электрофоретический холдер так, чтобы он полностью был залит буфером TBE, содержащим 1 мкг/мл бромистого этидия.

По прошествии 1 часа обработки рестриктазами аликвоты реакционных смесей анализируют с помощью аналитического электрофореза. Для этого в предварительно маркированных пробирках смешивают 3 мкл из каждой рестрикционной смеси с 6 мкл воды и 3 мкл 4-кратного раствора для нанесения на гель («краски»). Рестрикционные смеси возвращают в термостат. В качестве контролей смешивают 0.3-0.5 мкг исходных плазмид с 6 мкл воды и 3 мкл «краски». Наносят в каждый слот агарозного геля по образцу, рядом наносят маркер молекулярного веса /PstI (8 мкл). Электрофорез проводят при токе 40 mA (напряжение 60 - 120 В) в течении 30-60 минут. За это время следует залить 0.8% препаративный гель.

Далее аналитический гель изучают в УФ-излучении. Вектор при расщеплении по полилинкеру переходит из кольцевой формы в линейную. ЭФ подвижность кольцевой формы слегка отличается от подвижности кольцевой суперскрученной и кольцевой релаксированной формы. Короткий фрагмент (прибл. 10 п.о.), вырезанный из полилинкера, на геле не виден. При обработке pSL1180/EGFP рестриктазами NcoI и BglII образуется вставка 720 п.о., кодирующая GFP, и линейная форма вектора. Длину вставки можно оценить с помощью маркера /PstI. Сфотографируйте гель. Идентифицируйте все фрагменты, убедитесь, что за 1 час гидролиз прошел достаточно полно.

По окончании 2 часов инкубации добавьте в каждую рестрикционную смесь по 4 мкл «краски» и нанесите на препаративный гель. Электрофорез проводят при токе 30-40 mA (напряжение 60-120 В) в течении 40-60 минут. Затем в УФ свете прокаленным чистым скальпелем вырезают нужные зоны (вектор и вставку) и помещают в предварительно взвешенные эп. пробирки. Надо стараться действовать быстро, чтобы не подвергать ДНК длительному облучению. электрофорез молекулярный дактилоскопия мембрана

Выделение фрагментов ДНК из геля. Необходимые реагенты: Буфер 1 (сорбционный буфер); Буфер 2 (промывочный буфер); Буфер 3 (буфер элюции);

Микроколонки, содержащие боросиликатную мембрану.

1. Добавьте к гелю буфер 1 из расчета 100-150 мкл на 100 мг агарозного геля и инкубируйте при 60-65 ⁰С до полного растворения геля (10-15 минут). В процессе инкубации рекомендуется через каждые 2 минуты перемешивать содержимое пробирки на вортексе.

2. Поместите микроколонку в центрифужную пробирку объемом 2 мл. Перенесите смесь, содержащую растворенный гель, в микроколонку и инкубируйте 1-2 минуты при комнатной температуре. Центрифугируйте при 12000 об/мин. в течении 10 минут.

3. Удалите проскок из центрифужной пробирки. Добавьте в микроколонку 700 мкл буфера 2 и центрифугируйте при 12000 об/мин. в течении 1 минуты.

4. Повторите промывку. Удалите проскок из центрифужной пробирки. Добавьте в микроколонку 700 мкл буфера 2 и центрифугируйте при 12000 об/мин. в течении 1 минуты.

5. Удалите проскок из центрифужной пробирки. Центрифугируйте при 12000 об/мин. в течении 3 минут.

6. Переместите микроколонку в микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 мл и добавьте в нее 50 мкл буфера 3. Проинкубируйте 2 минуты, затем центрифугируйте при 12000 об/мин. в течении 1 минуты.

7. Аликвоты (10 мкл) выделенных из геля фрагментов ДНК анализируйте электрофорезом в 0.8% агарозе. Попросите преподавателя оценить концентрацию вектора и вставки. Сфотографируйте гель. Лигирование. Необходимые реагенты: 10 х лигазный буфер; 10 мМ АТP; ДНК-лигаза Т4; Составьте лигазную смесь (все компоненты должны храниться во льду): Вектор - 30-100 нг Вставка - 50-300 нг Н₂О - до 16 мкл 10 х лигазный буфер - 2 мкл 10 мМ АТP - 1 мкл ДНК-лигаза Т4 (5 ед./мкл) - 1 мкл ИТОГО - 20 мкл

Перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре 2 часа.

Размещено на Allbest.ru