Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ

УДК 577. 217. 32

УДК 577. 217. 337.2

Єгорова Світлана Павлівна

ТИРОЗИЛ-тРНК СИНТЕТАЗА ІЗ ЕКСТРЕМАЛЬНОГО ТЕРМОФІЛА THERMUS THERMOPHILUS HB -27: ФІЗИКО-ХІМІЧНА ХAРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТА І ВЗАЄМОДІЯ З тРНКTyr

03. 00. 03 - молекулярна біологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 1999р.

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі ензимології білкового синтеза Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Науковий керівник доктор біологічних наук Тукало Михайло Арсентійович, ІМБіГ НАН України, зав. Відділом.

Офіційні опоненти доктор біологічних наук, профессор Виноградова Руфіна Петрівна, Київський Університет ім. Тараса Шевченка, кафедра біохімії, кандидат біологічних наук Петрушенко Зоя Михайлівна, ІМБіГ НАН України, старший науковий співробітник.

Провідна установа Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, відділ структури і функції білків і пептидів.

Захист відбудеться " 18 " травня 1999 року о 1000 годині на засіданні Cпеціалізованої Вченої Ради Д 262.37.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 252143, м.Київ - 143, вул.Заболотного, 150( зал засідань ).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Автореферат розісланий " 15 " квітня 1999 року.

Вчений секретар Cпеціалізованої Вченої Ради, кандидат біологічних наук Лукаш Л.Л.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Аміноацил-тРНК синтетази (АР Сази) представляють групу ферментів, які відіграють важливу роль в реалізації генетичної інформації. Особливий інтерес викликає вивчення АРСаз із екстремальних термофільних бактерій, які живуть при температурах 60 - 85 ? С і характеризуються дивовижною термостабільністю.

Прокаріотична тирозил-тРНК синтетаза належить до 1-го структурного класу АРСаз.

У випадку прокаріот тРНКTyr має довгу варіабельну гілку. Незважаючи на те, що прокаріотична тирРС із Bacillus stearotermophilus являється однією із перших АРСаз, вивчених методом рентгеноструктурного аналізу [ Briсk, 1989 ], інформація про структуру С-кінцевого домена білка відсутня і спроби отримати кристали комплекса тРНКTyr-тирРС були невдалими. Проведені раніше біохімічні та генетичні дослідження не дозволили однозначно визначити тип взаємодії пари тРНКTyr-тирРС. Висновок про характер взаємодії даної пари тРНК-АРСаза , зроблений на основі структурної моделі комплекса тРНКTyr-тирРС

[ Bedouelle, 1990 ], не узгоджується з концепцією про існування в двох структурних класах АРСаз двох різних типів взаємодії з тРНК. Тому безперечний інтерес представляє з'ясування характеру взаємодії даної пари тРНКTyr-тирРС. Проведення порівняльного вивчення ділянок взаємодії тРНКTyr із екстремального термофіла T.thermophilus і мезофіла E.coli з гомологічними АРСазами дозволить, по-перше, визначити характер взаємодії даних пар тРНК-АРСаза в розчині, і, по-друге, оцінити, наскільки адекватно ці дві пари тРНК-АРСаза взаємодіють в розчині, і тому наскільки будуть коректні висновки, зроблені на основі подальших структурних досліджень тирРС із T.thermophilus , яка може виявитися більш перспективною у цьому відношенні, так як є більш термостабільною, у порівнянні з аналогічним мезофільним ферментом.

Мета і завдання досліджень. Основна мета даної роботи полягала в дослідженні фізико-хімічних властивостей та особливостей функцінування тирозил-тРНК синтетази із екстремального термофіла T.thermophilus HB-27, і визначенні ділянок взаємодії тРНКTyr із T.thermophilus і E.coli з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами в розчині.

Для досягнення цієї мети необхідно було вирішення таких завдань:

Розробити схему виділення індивідуальних препаратів тирозил-, серил- і треоніл- тРНК синтетаз із T.thermophilus і виділити високоочищений препарат тирозил-РНК синтетази із E.coli.

Провести порівняльне вивчення фізико-хімічних і каталітичних властивостей термофільної і мезофільної тирозил-тРНК синтетаз.

Визначити нуклеотидну послідовність тРНКTyr із T.thermophilus.

Визначити ділянки взаємодії тРНКTyr з термофільною і мезофільною тирозил-тРНК синтетазами методами хімічної модифікації і нуклеазного гідроліза.

Наукова новизна роботи. Вперше виділено високоочищені препарати тирозил-, серил- і треоніл- тРНК синтетаз із T.thermophilus. Показано, що ці ферменти мають олігомерну структуру типу 2 з молекулярною масою субодиниці 50, 46 і 74 кДа, відповідно. Оптимізовано метод виділення тирозил-тРНК синтетази із E.coli. Вперше здійснена фізико-хімічна характеристика тирозил-тРНК синтетази із екстремального термофіла T.thermophilus HB-27 і з'ясовані особливості функцінування термофільної тирозил-тРНК синтетази. На основі одержаних експериментальних даних ми припускаємо, що при переході від мезофільного способу життя до термофільного підвищена термостабільність термофільної тирозил-тРНК синтетази досягається в результаті зміни амінокислотного складу шляхом підвищення вмісту гідрофобних амінокислотних залишків, в основному Pro і Leu, а також захистом фермента низькомолекулярними субстратами - АТР, АТР і L- тирозином.

Вперше визначена нуклеотидна послідовність тРНКTyr із T.thermophilus. Встановлено, що ступінь її гомології з тРНКTyr із E.coli складає 52 %.

Вперше визначені ділянки взаємодії тРНКTyr з термофільною і мезофільною тирозил-тРНК синтетазами в розчині методами хімічної модифікації і нуклеазного гідроліза. Порівняння ділянок взаємодії термофільної і мезофільної тРНКTyr з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами показало, що вони в основному співпадають і розміщені в чотирьох, дещо віддалених одна від одної, ділянках первинної структури тРНКTyr. Їх розміщення на моделі просторової структури тРНК 2-го класу однозначно вказує на те, що тирозил-тРНК синтетаза взаємодіє з тРНКTyr зі сторони варіабельної гілки.

Практичне значення роботи. В даній роботі представлено нові ефективні і доступні в практичній лабораторній роботі методи одержання індивідуальних препаратів тирозил-, серил- і треоніл-тРНК синтетаз із T.thermophilus. Результати проведених досліджень мають теоретичне значення для розуміння взаємозв'язку структури, функції і термостабільності термофільної тирозил-тРНК синтетази. Дана дисертація являється суттєвим вкладом в з'ясування типу взаємодії тРНКTyr,яка має довгу варіабельну гілку з мезофільною і термофільною тирозил-тРНК синтетазами в розчині. Отримані результати являються основою для проведення структурних досліджень як тирозил-тРНК синтетази, так і комплексу тРНКTyr-тирозил-тРНК синтетаза.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу ензимології білкового синтеза Інституту молекулярної біології і генетики НАН України. Робота також виконувалась при підтримці гранту № 75195-548201 " The structural basis for the recognition of aminoacyl-tRNA synthetases for their cognate amino acid and tRNA " Howard Hughes Medical Institute.

Особистий внесок здобувача. Робота виконана особисто автором під керівництвом доктора біологічних наук Тукало М. А. , а також у тісному співробітництві при отриманні індивідуальних препаратів термофільних аміноацил-тРНК синтетаз з к.б.н. Яремчук Г. Д., з якою автор має спільні публікації. Бактеріальна маса T.thermophilus HB -27 культивована в

Інституті фізіології і біохімії мікроорганізмів РАН, м. Пущино , Російська Федерація. Препарат сумарної тРНК із E.coli отриманий із ВНІЇ прикладної біохімії, м. Олайне, Латвія. Пострибосомальний супернатант E.coli, який мав у своєму складі тирРС, був люб'язно наданий Лаврик О.І. з Інституту біоорганічної хімії СВ РАН, м. Новосибірськ, Російська Федерація. Амінокислотний склад тирРС із T.thermophilus був визначений Назимовим І.В. в Інституті біоорганічної хімії ім. Шемякіна М.М. і Овчинникова Ю.А., м. Москва. Індивідуальна тРНКTyr із T.thermophilus була люб'язно надана н. с. Крикливим І.А. , ІМБіГ НАН України.

Апробація роботи. Матеріали дисертації доповідались та обговорювались на Всесоюзному симпозіумі по хімії білка ( Тбілісі, 1990 ), Міжнародній конференції

" Термофіли : наука і техногія " ( Рек'явик , Ісландія, 1992 ), XVII Міжнародній робочій нараді по тРНК (Чіба, Японія, 1997 ).

Публікації. По темі дисертації опубліковано 9 наукових робіт.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури ( 1 розділ ), експериментальної частини (2 розділа), заключення , висновків і списку цитованої літератури , який включає 171найменування. Робота викладена на 155 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 44 рисунками і 6 таблицями.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Для виділення препаратів білків та сумарної тРНК використовували біомасу T.thermophilus HB-27 і пострибосомальний супернатант E.coli MRE-600. Препарат сумарної тРНК отримували по методу [ Brungraber, 1962 ], з деякими модифікаціями, шляхом прямої депротеінізації клітин біомаси фенолом з подальшою хроматографією РНК на ДЕАЕ-целюлозі.

Гель-електрофорез білків в нативних умовах проводили по методу [ Hedrick, 1968 ], в денатуруючих умовах по методу [ Weber, 1969 ]. Концентрацію білків визначали по методу

[ Bradford, 1976 ], в грубих екстрактах по методу [ Warburg, 1941].

Активність термофільних синтетаз в реакції аміноацилування тРНК визначали в інкубаційній суміші об'ємом 50 мкл, що містила 100 мМ трис-HCl , рН 7,9, 10 мМ MgCl2, 3 мМ АТР, 5мг/мл сумарної тРНК E.coli, 0,2 мг/мл БСА, 0,2 мМ [14С]-тирозина або 0,3 мМ [14C]-серина або 0,4 мМ [14C]-треоніна, відповідно, і від 0,05 до 10 мкг білка ( в залежності від ступені очистки фермента ). Суміш інкубували 0,5 хв. при 55 С. Реакцію зупиняли додаванням 200 мкл охолодженної 10 %-ної ТХО. Утворені осади відмивали на міліпорових фільтрах 50 мл 5 %-ної ТХО.

Активність фермента в реакції АТР-РРі-обміну визначали по методу [ Waller, 1968 ] з деякими модифікаціями. Кінетичні властивості термофільної тирРС вивчали, змінюючи концентрацію одного субстрату при насичуючих концентраціях інших субстратів, при 37 ?С і 65 ?С. Величину Кm визначали по методу найменших квадратів з використанням комп'ютерної програми Enzfitter [ Leatherbarrow, 1990 ]. Криві термоінактивації мезофільного і термофільного ферментів отримані вимірюванням їх залишкової активності після реакції термоінактивації методом АТР-РРі-обміну. Криві термостабільності ферментів отримані вимірюванням їх залишкової активності після 5 хв. інкубації при різних температурах методом АТР-РРі-обміну.

Мічення тРНК по 3'- і 5'- кінцям проводили відповідно з роботами [ Silberklang , 1977; Vlassov , 1981 ]. Визначення нуклеотидної послідовності термофільної тРНК проводили відповідно з роботами [ Peattie, 1979; Donis-Keller, 1977 ]. Мінорні основи первинної структури тРНКTyr визначали за допомогою ВЕРХ [ Gehrke, 1989 ] з використанням колонки С18.

Ділянки контакту термофільної і мезофільної тРНКTyr з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами визначали методом захисту фосфатів тРНК АРСазами від алкілування нітрозоетилсечовиною відповідно [ Vlassov et al, 1981 ] і захистом фосфодиефірних зв'язків тРНК від гідроліза нуклеазами [ Василенко, 1978; Ehresmann, 1987 ]. Фрагменти міченої тРНК, отримані в результаті її гідроліза по модифікованим фосфатам або фосфодиефірних зв'язків, аналізували електрофорезом в поліакриламідному гелі в присутності 8 М сечовини. Інтенсивність електрофоретичних смуг, які відображають ступінь модифікації залишків фосфорної кислоти, визначали за допомогою скануючого денситометра.

РЕЗУЛЬТАТИ І ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Розроблення нових методів виділення тирозил-, серил- і треоніл-тРНК синтетаз із T.thermophilus, виділення тирозил-тРНК синтетази із E.coli і характеристика чистоти одержаних препаратів білків.

Розроблено новий метод виділення термофільної тирРС, який складається з таких стадій: фракцінування пострибосомального супернатанту сульфатом амонія, хроматографія на ДЕАЕ-сефарозі, гідрофобна хроматографія на полівініловому сорбенті Toyopearl HW-65, хроматографія на оксиапатиті, рехроматографія на Toyopearl HW-65, хроматографія на гепарин-сефарозі. За основу виділення термофільних серил- і треоніл-тРНК синтетаз була прийнята схема , описана для очистки тирРС. Виділення високоочищених препаратів серРС і треРС було викликано необхідністю використання гетерологічних АРСаз як контроля на специфічність утворення комплекса тРНК-синтетаза в експериментах по визначенню ділянок взаємодії тРНКTyr з термофільною і мезофільною тирозил-тРНК синтетазами. Виділення тирРС із E.coli проводили за такою оптимізованою схемою: фракцінування пострибосомального супернатанта сульфатом амонія, хроматографії на ДЕАЕ-целюлозі, ДЕАЕ-сефарозі, оксиапатиті і гепарин-сефарозі.Чистота отриманих препаратів термофільних білків становила більш ніж 95 %, і 80 % у випадку мезофільної тирРС. Вихід тирозил-, серил- і треоніл-тРНК синтетаз становив 1,6 мг, 4 мг і 9 мг на 1 кг клітин T.thermophilus, відповідно.

Порівняльне вивчення фізико-хімічних властивостей тирозил-тРНК синтетаз із T.thermophilus і E.coli.

Для з'ясування структурних відмінностей, які забезпечують можливість термофільній тирРС функцінувати при підвищенних температурах, нами було проведено порівняння амінокислотних складів мезофільного [ Calendar, 1966 ] і термофільного ферментів. Було виявлено збільшення гідрофобних амінокислот у складі тирРС порівняно з мезофільним ферментом: 48 % і 40 % , відповідно. Білок із термофіла містить значно більшу кількість Pro, Arg, Leu і меншу кількість Asn +Asp, Lys ( Рис. 1 ). Отримані дані дозволили зробити нам припущення, що у випадку тирРС із T.thermophilus екстремальна термофільність фермента досягається помітною зміною амінокислотного складу шляхом збільшення гідрофобних амінокислотних залишків.

Порівняння оптимальних концентрацій KCl в реакції аміноацилування, яка каталізується термофільною і мезофільною синтетазами, виявило певні відмінності : 60-80 мМ і 20-40 мМ , відповідно ( Рис. 2 ). Крім цього, з підвищенням концентрації KCl від 0 до 300 мМ в реакції аміноацилування гетерологічної тРНКTyr, яка каталізується термофільною і мезофільною синтетазами, має місце значне зменшення рівня аміноацилування. На основі отриманих даних ми припускаємо, що оптимальні умови утворення продуктивного комплекса тРНК- синтетаза суттєво відрізняються для гомологічного і гетерологічного комплексів. Порівняння температурних оптимумів реакції аміноацилування гомологічної тРНКTyr, яка каталізується термофільною і мезофільною синтетазами, виявило значну різницю між ними: 75 С і 41 С, відповідно ( Рис. 3 ). У випадку реакції аміноацилування мезофільної тРНКTyr термофільною синтетазою, температурний оптимум мав місце при 50 С.

Вивчення каталітичних властивостей тирозил-тРНК синтетази із T.thermophilus.

При порівнянні каталітичних властивостей тирРС із мезофіла [ Calendar, 1966 ] і термофіла було виявлено, що термофільний фермент має підвищенну спорідненність до низькомолекулярних субстратів АТР і L-тирозина ( Табл.1 ). Значення Km для тРНКTyr із T.thermophilus і E.coli в реакції аміноацилування термофільним ферментом при 37 С і 65 С практично однакові. Але в реакції аміноацилування термофільної тРНКTyr при 65 С спостерігається збільшення Vmax в 4,3 раза на відміну від аміноацилування мезофільної тРНК при цій же температурі. Можливо, спроможність тирРС із T.thermophilus функцінувати при підвищених температурах досягається шляхом зміни каталітичних властивостей фермента. Нами було встановлено, що температурний оптимум реакції пірофосфатного обміну знаходиться в області 40 С для мезофільного фермента і 81 С для термофільного фермента ( Рис.4 ).

Також було проведено порівняння кінетики теплової інактивації тирРС із T.thermophilus і E.coli. Результати цих досліджень представлені на Рис.5. Отримані нами експериментально константи термоінактивації ясно свідчать про підвищену термостабільність структури термофільної тирРС порівняно з аналогічним мезофільним ферментом.

Температурні залежності швидкостей пірофосфатного обміну, аміноацилування і криві термостабільності обох ферментів представлені на Рис. 6. У випадку мезофільного фермента в області підвищених температур спостерігається чітка кореляція термостабільності і каталітичної активності як в реакції пірофосфатного обміну так і в реакції аміноацилування.

Зниження каталітичної активності після 41 С і практично відсутність різниці між температурними оптимумами для гомологічної і гетерологічної тРНКTyr в реакції аміноацилування ми пояснюємо термоденатурацією фермента. Зовсім інша картина спостерігається у випадку термофільного фермента. Майже до 81 С тирРС була спроможна каталізувати пірофосфатний обмін. В той же час вже після 75 С спостерігалось зменшення швидкості реакції аміноацилування тРНКTyr. Очевидно, причиною того, що швидкість реакції аміноацилування падає при температурах вище за 75 С, є не термоінактивація тирРС, а термоденатурація тРНК. Порівнюючи криві термостабільності і швидкості пірофосфатного обміну, ми спостерігаємо протирічну картину: при досить швидкому падінні термостабільності фермента при підвищенні температури від 65 С до 92 С, швидкість пірофосфатного обміну, який каталізується термофільною синтетазою, досягає оптимума при 81 С і незначно зменшується ( всього на 6 % ) при 92 С.

Ми припускаємо, що в реакції пірофосфатного обміну при зв'язуванні фермента з АТР і амінокислотою конформація білка змінюється, стабілізується, що і є причиною збільшення активності фермента. Конформаційні зміни фермента, які стабілізують його структуру, при зв'язуванні з субстратом були продемонстровані A. Fersht для тирРС із B.stearothermophilus

Таким чином, ми вважаємо, що отримані докази на користь того, що в реакції пірофосфатного обміну при зв'язуванні фермента з АТР і амінокислотою відбувається зміна конформації білка, яка спрямована на стабілізацію його структури, причому утворення такого комплексу приводить до помітного збільшення термостабільності білкової молекули. Це припущення добре узгоджується з відміченими вище даними про підвищену спорідненість термофільного фермента до АТР і амінокислоти, і підтвержується в експериментах по вивченню захисту термофільної тирРС від термоінактивації цими субстратами. Було виявлено, що в присутності 2 мМ АТР або 2 мМ АТР і 2,5 мМ L-тирозина в інкубаційній суміші при термоінактивації фермент повністю зберігав свою каталітичну активність в послідуючій реакції аміноацилування ( Рис.7 ).

Визначення нуклеотидної послідовності тРНКTyr із T.thermophilus

Нуклеотидна послідовність тРНКTyr із T.thermophilus була визначена з використанням методів швидкого гель-секвенування, в основі яких лежить специфічна хімічна деградація [ Peattie,1979 ] і ферментативна деградація специфічними нуклеазами [ Donis-Keller, 1977; Ehresmann, 1987 ] полинуклеотидного ланцюга тРНК ( Рис. 8 ). Природа мінорних основ нуклеотидної послідовності тРНКTyr була визначена за допомогою ВЕРХ [ Gehrke, 1989 ] з використанням колонки С18 .

При порівнянні нуклеотидної послідовності з тРНКTyr із T.thermophilus з встановленою раніше структурою тРНКTyr із E.coli [ Sprinzl,1989 ] виявлено 52 % гомології. У складі термофільної тРНКTyr було виявлено дві модифіковані основи: m1A в Т-петлі і Gm в Д-петлі, комбінація яких, можливо, є причиною більш високої термостабільності цієї молекули [Watanabe, 1980 ]. Ми припускаємо, що виявлені структурні відмінності в тРНКTyr із термофіла забезпечують утворення продуктивного комплекса тРНК-синтетаза при підвищенних температурах.

Визначення ділянок взаємодії тРНКTyr із T.thermophilus і E.coli з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами

Ділянки взаємодії термофільної і мезофільної тРНКTyr з гомологічними АРСазами вивчали методами захисту фосфатів тРНК АРСазою від хімічної модифікації ( алкілування ) нітрозоетилсечовиною [ Vlassov, 1981 ] і методом захисту від нуклеазного гідроліза [Василенко, 1978; Ehresmann, 1987 ]. Хімічна модифікація тРНК в присутності АРСази проводилась в умовах стабілізації просторової структури тРНК [Vlassov, 1981 ], і умовах, які сприяють утворенню специфічного комплекса тРНК-білок: 50 мМ трис-HCl,pH 8,0,

5 мМ MgCl2, 2,5 мМ 2- меркаптоетанол. Після проведення реакції модифікації тРНК, молекулу гідролізували по алкілованим фосфатам. Отримані фрагменти розщепленої тРНК аналізували високовольтним електрофорезом в поліакриламідному гелі. Рухливість електрофоретичних смуг співвідносили з рухливістю фрагментів тРНК, отриманих в результаті часткового гідроліза тРНК РНКазою Т1. Інтенсивності електрофоретичних смуг, які відображають ступінь модифікації фосфатів, визначали за допомогою скануючого денситометра.

Для аналіза тРНКTyr- тирРС комплекса використовували ендонуклеазу V1 із отрути кобри, яка має яскраво виражену вибірковість у відношенні гідроліза двоспіральних ділянок тРНК , неспецифічну нуклеазу Р1, яка має вибірковість у відношенні односпіральних ділянок, а також специфічну нуклеазу PhyM, яка розщеплює зв'язки типу U-N і A-N . Гідроліз вели в умовах оптимальних як для комплексоутворення, так і для роботи нуклеаз: 25 мМ трис-HCl, pH 7,2, 10 мМ MgCl2, 2,5 мМ 2-меркаптоетанол. Отримані фрагменти тРНК аналізували високовольтним електрофорезом в поліакриламідному гелі. Результати експериментів по модифікації нітрозоетилсечовиною і нуклеазному гідролізу комплексів тРНКTyr-тирРС із T.thermophilus і E.coli представлені на рис. 9, 10, 11.

З даних малюнків видно, що термофільна тирРС захищає від алкілування ряд фосфатів тРНК, розміщених в чотирьох зонах: 3'-фосфати нуклеотидів 28, 29 5'- ділянки антикодонового стебла, 34, 36 антикодона, 45, 46, 47 варіабельної гілки, 68 3'- ділянки акцепторного стебла. Для мезофільної пари ці фосфати розміщені також в чотирьох зонах: 3'- фосфати нуклеотидів 29 5'- ділянки антикодонового стебла, 36 антикодона, 45, 46 варіабельної гілки, 67 3'- ділянки акцепторного стебла. Від гідролізу термофільної тРНКTyr нуклеазами гомологічна синтетаза захищає фосфодиефірні зв'язки між нуклеотидами 28 і 29, 29 і 30 5'- ділянки антикодонового стебла, 33 і 34, 34 і 35 антикодонової петлі, 47В і 47С, 47С і 47D варіабельної гілки, 68 і 69, 69 і 70, 70 і 71, 71 і 72, 72 і 73, 73 і 74 3'- ділянки акцепторного стебла. Для мезофільної пари тРНКTyr-синтетаза це фосфодиефірні зв'язки між нуклеотидами 29 і 30 5'- ділянки антикодонового стебла, 35 і 36, 36 і 37 антикодонової петлі, 47А і 47В, 47С і 47D варіабельної гілки, 67 і 68 3'- ділянки акцепторного стебла. В тРНКTyr із E.coli при утворенні комплекса з гомологічною синтетазою виявлена індукція додаткових розривів фосфодиефірних зв'язків ендонуклеазою V1 в 3'- ділянці антикодонового стебла і 5'- ділянці Т-стебла, що вказує на можливу зміну конформації тРНК при взаємодії з ферментом. Узагальнюючи результати, отримані з використанням двох різних методів на двох парах тРНКTyr-тирРС , можна зробити висновок, що в тРНКTyr із T.thermophilus і E.coli в контакті з гомологічною синтетазою знаходяться чотири, дещо віддалені одна від одної в первинній структурі тРНК, ділянки. Їх розміщення на моделі просторової структури тРНК 2-го класу [Brennan , 1976 ] однозначно вказує на те, що синтетаза взаємодіє з тРНК зі сторони варіабельної гілки. До аналогічного висновку прийшли Bedouelle та ін. при створені моделі комплекса тРНКTyr-тирРС [Bedouelle, 1980 ]. Але на цій моделі відсутня взаємодія варіабельної гілки тРНКTyr з синтетазою.

Крім цього, висновок про характер взаємодії акцепторного стебла тРНКTyr з каталітичним центром фермента входить в конфлікт з концепцією про існування в двох структурних класах синтетаз двох різних типів взаємодії з тРНК.

Очевидно, що дана дилема може бути вирішена лише вивченням структури комплекса тирРС- тРНКTyr методом рентгеноструктурного аналізу.

На даний час в відділі ензимології білкового синтеза ІМБіГ НАН України отримані кристали тирозил-тРНК синтетази з роздільною здатністю 3 A і кристали тРНКTyr-тирРС з роздільною здатністю 6 Е в лабораторних умовах.

ВИСНОВКИ

1. Виділена в високоочищеному стані і охарактеризована тирозил-тРНК синтетаза із T.thermophilus. Визначені ділянки взаємодії тРНКTyr із T.thermophilus і E.coli з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами.

2. Розроблені методи виділення тирозил-, серил- і треоніл-тРНК синтетаз із T.thermophilus, отримані в високоочищеному стані термофільні ферменти трьох специфічностей. Оптимізовано метод виділення тирозил-тРНК синтетази із E.coli.

3. Вивчені фізико-хімічні і каталітичні властивості тирозил-тРНК синтетази із T.thermophilus:

а) визначена молекулярна маса і олігомерна структура одержаних термофільних ферментів. По даним електрофорезу в ПААГ в нативних умовах молекулярна маса тирРС складає 100 кДа, серРС - 90 кДа, треРС - 148 кДа. Всі ці три фермента є структурними димерами 2 типу.

б) виявлено збільшення гідрофобних амінокислот у складі тирРС порівняно з мезофільним ферментом: 48 % і 40 % , відповідно. Білок із термофіла містить значно більшу кількість Pro, Arg, Leu і меншу кількість Asn+Asp, Lys. Отримані дані дозволили зробити нам припущення, що у випадку тирРС із T.thermophilus екстремальна термофільність фермента досягається помітною зміною амінокислотного складу шляхом збільшення гідрофобних амінокислотних залишків.

в) проведено порівняння кінетичних параметрів реакції аміноацилування, яка каталізується термофільною і мезофільною тирРС. Виявлено, що спорідненість низькомолекулярних субстратів L-тирозина і АТР вище у випадку термофільної тирРС.

г) встановлені константи термоінактивації тирРС із T.thermophilus і E.coli. Результати вивчення термоінактивації досліджуваних ферментів свідчать про підвищення термостабільності структури термофільної синтетази. Порівняння кривих температурної залежності термостабільності і пірофосфатного обміну тирРС із T.thermophilus вказує на значне збільшення термостабільності фермента в присутності низькомолекулярних субстратів АТР і L- тирозина. Виявлено захист тирРС від термоінактивації цими субстратами- АТР, АТР і L-тирозином.

4. Визначена нуклеотидна послідовність тРНКTyr із T.thermophilus методами швидкого гель-секвенування. Ступінь її гомології з мезофільною тРНКTyr становить 52 %.

5. Визначені ділянки взаємодії тРНКTyr із T.thermophilus і E.coli з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами методами хімічної модифікації і нуклеазного гідроліза. Показано, що тирозил-тРНК синтетази захищають гомологічні тРНКTyr від алкілування нітрозоетилсечовиною і гідроліза нуклеазами в районі 5'- ділянки антикодонового стебла, антикодона, 5'- ділянки варіабельного стебла і варіабельної петлі, 3'- ділянки акцепторного стебла. Розміщення цих ділянок на моделі просторової структури тРНК 2-го класу однозначно вказує на те, що синтетаза взаємодіє з тРНК зі сторони варіабельної гілки.

тирозил білок треоніл нуклеотидний

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ЩО ОПУБЛІКОВАНО ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Яремчук А.Д., Тукало М.А., Егорова С.П., Коноваленко А.В., Мацука Г.Х. Выделение тирозил-тРНК синтетазы из Thermus thermophilus HB-27 // Український біохімічний журнал - 1990.- Т.62.- № 2.- С. 97- 99.

2. Яремчук А.Д., Тукало М.А., КоноваленкоА.В., Егорова С.П., Мацука Г.Х. Выделение серил-тРНК синтетазы из Thermus thermophilus. // Биополимеры и клетка.-1989.-Т.5.- № 5.- С.83-86.

3. Яремчук А.Д., Тукало М.А., Егорова С.П., Мацука Г.Х. Выделение треонил-тРНК синтетазы из Thermus thermophilus. // Биополимеры и клетка.-1989.-Т. 5.- № 2.- С.102-103.

4. Егорова С.П., Яремчук А.Д., Тукало М.А. Сравнительное исследование физико-химических свойств тирозил-тРНК синтетаз из Thermus thermophilus и Escherichia coli. Биополимеры и клетка.- 1998.- Т.14.- №2.- C. 144-151.

5. Егорова С. П., Яремчук А. Д., Крикливый И. А., Тукало М. А. Сравнительный анализ участков взаимодействия тРНКTyr из Thermus thermophilus и Esсherichia coli с гомологичными аминоацил-тРНК синтетазами методами химической модификации и нуклеазного гидролиза. Биоорганическая химия.- 1998.- Т.24.- № 8.- С. 593-600.

6. Яремчук А.Д., Тукало М.А., Егорова С.П., Мацука Г.Х. Структурно-функциональное исследование аминоацил-тРНК синтетаз из экстремального термофила Thermus thermophilus. // Всесоюзный симпозиум по химии белка , Тбилиси - 1990. - С.116.

7. Егорова С. П., Яремчук А.Д., Тукало М.А., Мацука Г.Х. Выделение тирозил-тРНК синтетазы из Thermus thermophilus и взаимодействие с тРНКTyr. Всесоюзный симпозиум по химии белка , Тбилиси - 1990. - C.135.

8. A. Yaremchuk, S. Egorova, V. Mel'nik, N. Mal'chenko, M.-T. Dauverggne, R. Leberman, M. Tukalo. Properties and structure of the aminoacyl-tRNA synthetases from Thermus thermophilus. // Abstr. of International conference Thermophiles: science and technology, Reykjavik.- 1992.- P. 107.

9. A.Yaremchuk, S.Egorova, I.Kriklivyi, S.Cusack and M.Tukalo. Studies on the complex between tyrosyl-tRNA synthetase and tRNAtyr from Thermus thermophilus. // Abstr. of 17th International tRNA Workshop, Kazusa Akademia Park, Chiba, Japan. - 1997. - P.4.

АНОТАЦІЇ

Єгорова С.П. Тирозил-тРНК синтетаза із екстремального термофіла Thermus thermophilus HB-27: фізико-хімічна характеристика фермента і взаємодія з тРНКTyr .- Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 - молекулярна біологія. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 1999.

Досліджено взаємозв'язок термостабільності і особливостей структури і функцінування тирозил-тРНК синтетази із екстремального термофіла T.thermophilus, і взаємодію тРНКTyr з тирРС із T.thermophilus і E.coli у розчині. Виявлено підвищення вмісту гідрофобних амінокислотних залишків, в основному Pro і Leu, в амінокислотному складі термофільної тирРС. Виявлено, що спорідненість низькомолекулярних субстратів L-тирозина і АТР вище у випадку термофільної тирРС порівняно з мезофільним ферментом. Виявлено захист тирРС від термоінактивації цими субстратами- АТР, АТР і L-тирозином.

Визначені ділянки взаємодії тРНКTyr із T.thermophilus і E.coli з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами в розчині методами хімічної модифікації і нуклеазного гідроліза.

Показано, що тирРС захищає гомологічну тРНКTyr від алкілування нітрозоетилсечовиною і гідроліза нуклеазами в районі 5'- ділянки антикодонового стебла, антикодона, 5'- ділянки варіабельної гілки і варіабельної петлі, 3'- ділянки акцепторного стебла.

Розміщення цих ділянок на моделі просторової структури тРНК 2-го класу однозначно вказує на те, що синтетаза взаємодіє з тРНК зі сторони варіабельного гілки.

Ключові слова: аміноацил-тРНК синтетаза, тРНК, РНК-білкові взаємодії.

Егорова С.П. Тирозил-тРНК синтетаза из экстремального термофила Thermus thermophilus HB-27: физико- химическая характеристика фермента и взаимодействие с тРНКTyr .- Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология. Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 1999.

Исследована взаимосвязь термостабильности и особенностей структуры и функционирования тирРС из экстремального термофила T.thermophilus, и взаимодействие тРНКTyr из T.thermophilus и E.coli c гомологичными аминоацил-тРНК синтетазами в растворе. В результате проведенных исследований впервые получены в высокоочищеном состоянии тирозил-, серил- и треонил-тРНК синтетазы из T.thermophilus. Показано, что эти ферменты имеют олигомерную структуру типа 2 с молекулярной массой субъединицы 50кДа, 46кДа и 74кДа, соответственнно. Модифицирован метод выделения тирозил-тРНК синтетазы из E.coli. Впервые изучены физико-химические и каталитические свойства тирозил-тРНК синтетазы из T.thermophilus. Для выяснения структурных различий, обеспечивающих возможность термофильной тирозил-тРНК синтетазе функционировать при повышенных температурах, было проведено сравнение аминокислотных составов термофильного и мезофильного ферментов. Выявлено увеличение содержания гидрофобных аминокислот в составе термофильного фермента по сравнению с мезофильным: 48 % и 40 %, соответственно. Белок из термофила содержит значительно большее количество Pro, , Arg, Leu и меньшее количество Asn+Asp, Lys. Проведено сравнение кинетических параметров реакции аминоацилирования, катализируемой термофильной и мезофильной тирРС. Обнаружено повышенное сродство термофильной тирРС к низкомолекулярным субстратам L-тирозину и АТР. Полученные нами экспериментально константы термоинактивации ясно свидетельствуют о повышенной термостабильности структуры тирРС из T.thermophilus по сравнению с аналогичным мезофильным ферментом. При сравнении кривых температурной зависимости термостабильности и пирофосфатного обмена тирозил-тРНК синтетазы из T.thermophilus было обнаружено, что термостабильность фермента значительно возрастает в присутствии низкомолекулярных субстратов - L-тирозина и АТР. Кроме того, в экспериментах по защите тирРС от термоинактивации низкомолекулярными субстратами было установлено, что присутствие АТР или АТР и L-тирозина .в инкубационной смеси позволяло ферменту полностью сохранять свою каталитическую активность в последующей реакции аминоацилирования в отличие от свободного фермента.

Определена нуклеотидная последовательность тРНКTyr из Thermus thermophilus

HB-27. Она имеет длину 86 нуклеотидов и степень ее гомологии с тРНКTyr из E. coli составляет 52%. В составе термофильной тРНК было обнаружено два модифицированных основания- m1A в Т-петле и Gm в Д-петле, комбинация которых может быть причиной более высокой термостабильности этой молекулы. В антикодоновой петле термофильной тРНКTyr обнаружены модифицированые основания, которые не характерны для бактериальных тРНК и встречающиеся только у эукариот. Методами химической модификации этилнитрозомочевиной и нуклеазного гидролиза проведен сравнительный анализ участков взаимодействия тРНКTyr из T. thermophilus и E.coli с гомологичными аминоацил-тРНК-синтетазами. Показано, что тРНКTyr контактирует с гомологичным ферментом в области антикодонового стебля (с 5'-стороны), в антикодоне, в районах вариабельного стебля и вариабельной петли (с 5'-стороны) и акцепторного стебля (с 3'-стороны). В пространственной структуре тРНК 2-го класса эти участки расположены со стороны вариабельного стебля L-формы молекулы. В тРНКTyr из E. coli при образовании комплекса с гомологичной синтетазой обнаружена индукция дополнительных разрывов фосфодиэфирных связей эндонуклеазой V1 с 3'- стороны антикодонового стебля и 5'- стороны Т- стебля, что указывает на возможное изменение конформации тРНК при взаимодействии с ферментом.

Ключевые слова: аминоацил-тРНК синтетаза, тРНК, РНК-белковые взаимодействия.

Yegorova S. P. Tyrosyl-tRNA synthetase from extreme thermophile Thermus thermophilus HB-27 : physical-chemical characteristic of the enzyme and interaction with tRNATyr. - Manuscript. Thesis for degree of Doctor of Philosophy ( Ph.D. ) in Biology, speciality 03.00.03 - Molecular Biology. - Institute of Molecular Biology and Genetics, National Academy of sciences of Ukraine, Kiev, 1999.

The correlation between the thermostability and properties of the structure and function of the TyrRS from extreme bacteria T.thermophilus and interaction of tRNATyr with TyrRSs from T.thermophilus and E.coli in solution has been investigated. It was revealed the considerable increase of quantity of hydrophobic amino acids, in the main Pro and Leu, in amino acid compound of thermophilic TyrRS. It was revealed the change of the catalytic properties of this protein. It was shown that the low moleculars substrates- ATP, ATP and L-tyrosine protects of the enzyme from thermoinactivation.

The interaction sites of tRNATyr from E.coli and T.thermophilus with the cognate aminoacyl-tRNA synthetases has been determined by the chemical modification and nucleases hydrolysis methods. It was shown that TyrRS protects from alkylation by ethylnitrosourea and nucleases hydrolysis 5'- sides of variable and anticodon stems, 3'- side of accteptor stem, anticodon loop. The interaction sites are located on the variable stem side of tRNA of the klass 2.

Key words: aminoacyl-tRNA synthetases, tRNA, RNA-protein interaction.

Размещено на Allbest.ur