Вивчення фізіолого-біохімічних особливостей дріжджів, що утилізують лактозу, для отримання етилового спирту

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ

ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО НАН УКРАЇНИ

На правах рукопису

УДК 663.12:663.031:637.127.2

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ВИВЧЕННЯ ФІЗІОЛОГО-БІОХІМІЧНИХ ОСОБЛИВОСТЕЙ ДРІЖДЖІВ, ЩО УТИЛІЗУЮТЬ ЛАКТОЗУ, ДЛЯ ОТРИМАННЯ ЕТИЛОВОГО СПИРТУ

03.00.07 - мікробіологія

КІШТААРІ МАХМУД

Київ - 1999

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі промислових мікроорганізмів інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України та на кафедрі мікробіології і загальної імунології Національного університету ім. Тараса Шевченка.

Науковий керівник:

Підгорський Валентин Степанович, д.б.н., професор, чл.-кор. НАН України, Інститут мікробіолігії та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділом фізіології промислових мікроорганізмів.

Офіційні опоненти:

Малащенко Юрій Романович, д.б.н., професор, чл.-кор. НАН України, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділом біології газоокислювальних мікроорганізмів;

Поводзинський Вадим Михайлович, кандидат технічних наук, Український державний університет харчових технологій, доцент кафедри біотехнології мікробного синтезу.

Провідна установа - Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, м. Київ.

Захист відбудеться "30" березня 199р. о 10-й годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.233.01 Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (252143, Київ-143, вул. Заболотного, 154. Інститут мікробіології і вірусології ім. Д,К,Заболотного НАН України, зал засідань).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. НАН України.

Автореферат розісланий: "28" лютого 1999 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук Л.М. Пуріш.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Раціональне використання сировинних ресурсів є основою підвищення ефективності суспільного виробництва. Воно досягається шляхом розробки та запровадження безвідходних і маловідходних технологій.

Переробка молока під час виробництва різноманітних молочно-білкових концентратів (сир, твердий сир, казеїн) пов'язана із отриманням сироватки як побічного продукту виробництва.

За даними Міжнародної молочної федерації у теперішній час до 50 % молочної сироватки не використовується. В Україні переважна більшість молочної сироватки зливається у водойми, викликаючи забруднення довкілля. Саме тому способи промислової утилізації сироватки є предметом вивчення багатьох дослідників.

Відомі різноманітні способи використання молочної сироватки: висушування, отримання лактози, виготовлення напоїв тощо. Останнім часом все більшого поширення у її промисловій переробці набувають біотехнологічні способи.

Зараз молочна сироватка використовується для отримання спирту, органічних кислот, ферментів, вітамінів, органічних розчинників, ліпідів, антибіотиків, мікробного білка.

Як продуценти в біотехнологічних процесах для отримання харчових та кормових продуктів на основі молочної сироватки можуть бути використані представники різних таксономічних груп бактерій, дріжджів, мікроскопічних грибів, що мають властивість засвоювати лактозу як джерело вуглецю та енергії.

Одним із перспективних напрямків промислової переробки молочної сироватки є отримання на її основі етилового спирту. Виробництво етанолу на основі нативної сироватки пов'язане зі значними енергетичними витратами на стадії виділення через його низький вміст у бражці. Отримання спирту із концентрованої сироватки пов'язане зі значними витратами на стадії її випарювання та очищення.

Найдоцільнішим є процес переробки молочної сироватки при використанні її як розчинника висококонцентрованих джерел вуглеводів, наприклад меляси. Цим досягається економія води, використовуваної для розведення сировини, що містить вуглеводи, збагачення бродильної суміші ростовими факторами і часткове заміщення традиційних видів сировини у виробництві спирту за рахунок лактози, що міститься у сироватці.

Варто зазначити, що відомості про особливості отримання етанолу на основі суміші молочної сироватки та інших джерел вуглеводів обмежені.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота включає дослідження, виконані в рамках плану науково-дослідних робіт відділу фізіології промислових мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України з теми 04.3. - "Дослідження систематики, екології і фізіології промислово важливих видів дріжджів і актиноміцетів".

Мета роботи. Мета полягає в пошуку активних штамів дріжджів, що засвоюють лактозу, вивченні фізіологічних особливостей їх росту в умовах аеробного і анаеробного культивування та в розробці наукових основ отримання етилового спирту на змішаних субстратах.

Основні завдання наукових досліджень:

1. Вивчити здатність зброджувати молочну сироватку представниками різних таксономічних груп дріжджів і відібрати найбільш активний штам.

2. Оптимізувати умови зброджування молочної сироватки дріжджами.

3. Вивчити здатність селекціонованого штаму дріжджів зброджувати різні вуглеводи.

4. Встановити доцільність використання суміші культур дріжджів для зброджування змішаних субстратів.

5. Вивчити особливості росту селекціонованого штаму дріжджів на молочній сироватці в аеробних умовах та оптимізувати режим його культивування.

Наукова новизна роботи. Вивчена здатність зброджувати молочну сироватку представниками різних таксономічних груп дріжджів. Селекціоновано штам дріжджів Kluyveromyces lactis 42К, що має здатність активно перетворювати лактозу молочної сироватки в етанол.

Показана ефективність використання змішаних культур дріжджів при зброджуванні різних вуглеводів.

Вперше встановлено послідовність ферментативного гідролізу суміші лактози та сахарози чи мальтози дріжджами і подальшого зброджування ними утворених моносахаридів змішаними культурами дріжджів.

Визначені фактори, що впливають на ефективність використання джерела вуглеводного живлення селекціонованим штамом дріжджів. Встановлений оптимальний режим культивування дріжджів на стадії їх накопичення в аеробних умовах.

Практична цінність роботи. Селекціоновано перспективний для промислового отримання етилового спирту на основі молочної сироватки штам дріжджів, що засвоює лактозу.

Показана доцільність використання змішаних культур для зброджування молочної сироватки в суміші з сахарозою чи мальтозою.

Розроблені підходи щодо підвищення ефективності використання лактози в молочній сироватці селекціонованим штамом в аеробних умовах, що можуть бути використані для отримання дріжджів у спиртовій промисловості.

Апробація роботи. Матеріали дисертації були представлені на засіданнях мікробіологічної секції Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України в 1996 та 1998 рр.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 3 наукові роботи. Одержано два патенти України на винаходи.

Особистий внесок дисертанта. Основна частина роботи виконана автором особисто. Селекцію дріжджів, що зброджують лактозу, та визначення послідовності ферментативного гідролізу вуглеводів середовища під час його збродження проведено в Українському державному університеті харчових технологій спільно з професором В.М. Швецом та старшими науковими співробітниками Л.А. Івановою та Т.А. Королюк.

Оптимізація умов періодичного і безперервного культивування селекціонованого штаму дріжджів виконана в Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України спільно зі старшим науковим співробітником М.М. Гавриленко.

Структура та об'єм роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини (3 розділи), обговорення результатів експериментів, висновків, списку цитованої літератури, який нараховує 89 джерел. Робота викладена на 105 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 21 малюнком та 12 таблицями.

ЗМІСТ РОБОТИ

1. Огляд літератури. У розділі наведений склад і властивості молочної сироватки, вказані існуючі способи її утилізації, представлені різні таксономічні групи мікроорганізмів, що використовуються при біотехнологічному способі її переробки у цільові продукти, наведені промислові технології одержання етанолу на основі сироватки.

2. Матеріали та методи досліджень. Об'єктами досліджень слугували 74 штами дріжджів родів Kluyveromyces, Debaryomyces, Cryptococcus, що зберігаються в музеї відділу фізіології промислових мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології НАН України, а також промислові раси дріжджів Saccharomyces cereveisiae V-30, K-81 із музею кафедри біотехнології продуктів бродіння, екстрактів та напоїв Українського державного університету харчових технологій.

Відбір штамів дріжджів, які активно зброджують лактозу молочної сироватки, визначення інтенсивності зброджування вуглеводів селекціонованим штамом та змішаними культурами, вивчення впливу джерел живлення, температури та рН на процес зброджування молочної сироватки проводили в колбах, що мали сірчанокислотні затвори.

Про активність зброджування вуглеводів робили висновок за зменшенням маси колб у результаті виділення діоксиду вуглецю.

Вміст вуглеводів у поживному середовищі, культуральній рідині і бражці встановлювали ферроцианідним методом. Послідовність ферментативного гідролізу та споживання вуглеводів дріжджами досліджували методом паперової хроматографії [Королюк та ін., 1976]. Вміст етилового спирту в зразках бражки та культуральної рідини визначали методом газорідинної хроматографії з використанням хроматографа "Chrom-5" із застосуванням полум'яно-іонізаційного детектора.

Вивчення процесу зброджування суміші молочної сироватки та меляси, оптимізацію умов аеробного вирощування селекціонованого штаму дріжджів провадили у ферментерах фірми "Biotec" місткістю 3 л.

Вологість дріжджової біомаси та концентрацію дріжджів у культуральній рідині визначали ваговим методом після висушування наважки при температурі 105⁰ С. Розрахунок значень питомої швидкості росту, економічного коефіцієнта, продуктивності процесу культивування, валової швидкості утворення етанолу, виходу спирту відносно до теоретичного здійснювали за загальновживаними формулами [Перт, 1978; Яровенко, 1981].

3. Особливості зброджування вуглеводів дріжджами, які засвоюють лактозу.

3.1 Відбір штамів дріжджів, які активно зброджують лактозу. Досліджено 74 штами, що належать до родів Kluyveromyces, Debaryomyces, Cryptococcus на здатність зброджувати лактозу. Як середовище використовували нативну молочну сироватку. У результаті проведених досліджень відібрано 15 штамів дріжджів роду Kluyveromyces, здатних зброджувати лактозу молочної сироватки. Найбільшу активність мали штами 42К, 317 і 325 (табл. 1).

Таблиця 1. Хіміко-технологічні показники процесу зброджування молочної сироватки дріжджамт Kluyveromyces lactis

Серед штамів, що були відібрані, найкращу здатність зброджувати лактозу має штам Kluyveromyces lactis 42К, тому всі подальші дослідження були проведені саме з цим штамом.

3.2 Оптимізація умов зброджування молочної сироватки дріжджами Kl. lactis 42К. У дослідах було використано нативну молочну сироватку із вмістом лактози 4,0 %. Проведено дослідження впливу температури, рН середовища та додатково внесених джерел азоту, фосфору і магнію на ефективність зброджування сироватки. Як такі використовували сечовину, ортофосфорну кислоту і сульфат магнію. Встановлено, що оптимальна температура зброджування молочної сироватки дріжджами Kl. lactis 42К становить 30-32⁰ С, а рН середовища 4,5-5,0. За таких умов концентрація етанолу в дозрілій бражці складала 2,08-2,10 об. %. При цьому у процесі зброджування молочної сироватки немає необхідності в корекції рН середовища. Під час оптимізації складу середовища, яке зброджували, як джерело азоту використовували сечовину в концентрації 0,1-0,6 %, фосфор додавали у вигляді ортофосфорної кислоти - 0,1-0,3 %, магній у вигляді сульфату - 0,05-0,15 %. При додаванні сечовини до молочної сироватки накопичення спирту виявилося найзначнішим. Найкращі результати було отримано при концентрації сечовини 0,5 %. Збагачення молочної сироватки дозволяє не лише збільшити накопичення спирту, але і зменшити тривалість процесу її зброджування з 72 год. до 48 год. Ортофосфорна кислота має досить незначний вплив на інтенсивність процесу, а сульфат магнію не виявляє ніякого впливу на процес зброджування лактози. На основі експериментальних даних вибрано оптимальні умови зброджування молочної сироватки дріжджами Kl. lactis 42К: температура - 30-32⁰ С; величина рН середовища - 4,5-5,0; кількість сечовини, що додається до сироватки як джерело азотного живлення, становить 5 г/л, а ортофосфорної кислоти, як джерела фосфору - 1,5 г/л.

3.3 Дослідження процесу зброджування різних вуглеводів культурами дріжджів. Зброджування вуглеводів провадили в колбах монокультурами дріжджів Kl. lactis 42К, Sacch. cerevisiae V-30, Sacch. cerevisiae K-81 та асоціацією дріжджів Kl. lactis 42К, Sacch. cerevisiae V-30 чи Sacch. cerevisiae K-81 у співвідношенні 1:2 із використанням синтетичного середовища Рідер. Вміст лактози, мальтози і сахарози в середовищі складав 4 %, що відповідає середньому вмісту цукрів у молочній сироватці.

Процес зброджування дріжджами Kl. lactis 42К окремих цукрів найбільш інтенсивно відбувався протягом 24 год. (рис. 1). За цей період вміст лактози і сахарози в середовищі знижувався на 70 і 75 % відповідно. Мальтоза досліджуваним штамом дріжджів не зброджувалася, а активність зброджування сахарози була нижчою, ніж при використанні Sacch. cerevisiae V-30. Протягом 48 год. Kl._lactis 42К майже повністю зброджує лактозу і сахарозу. Залишковий вміст вуглеводів при цьому не перевищує 0,3 %, а концентрація спирту в бражці становить 2,2-2,4 об. %. Ці дані свідчать про те, що дріжджі Kl. lactis 42К не можуть використовуватися для зброджування мальтози.

Встановлено принципову можливість використання Kl. lactis 42К для зброджування поживного середовища, що містить 4 % лактози і 8 % сахарози. Виявлено, що протягом 72 год. загальний вміст вуглеводів знижується до 0,6 %, а концентрація спирту становить 7,1 об. % (рис. 2).

Вивчена здатність змішаних культур зброджувати суміші різних вуглеводів. Показано, що популяція дріжджів, складена з Sacch. cerevisiae V-30 та Kl. lactis 42К, ефективно зброджує середовище, яке містить 4 % лактози і 8 % сахарози. Тоді ж концентрація залишкових вуглеводів у бражці по закінченні процесу складає 0,4 %, а етанолу - 7,5 об. %.

Встановлена можливість асоціації дріжджів Sacch. cerevisiae K-81 та Kl. lactis 42К зброджувати суміш мальтози і лактози. Однак перебіг цього процесу менш активний - через 72 год концентрація вуглеводів в бражці становить 0,8-0,9 %, а етанолу - 6,9-7,0 об. %.

Під час зброджування лактози і сахарози дріжджами Kl. lactis 42К сахароза гідролізується на початку процесу і вже через 6 год повністю відсутня. Лактоза підлягає гідролізному розщепленню менш інтенсивно, про що свідчить поява галактози лише через 12 год. На 24 год лактоза була майже зовсім відсутня. Варто зазначити, що фруктоза як і галактоза утворені при гідролізі сахарози і лактози відповідно, у незначній кількості виявляються в середовищі після 72 год. Під час дослідження процесу зброджування лактози і мальтози асоціацією дріжджів Kl. lactis 42К та Sacch. cerevisiae К-81 встановлено, що на початку процесу відбувається інтенсивний гідроліз мальтози Sacch. cerevisiae К-81. При цьому лактоза не зброджується дріжджами Sacch. cerevisiae К-81. Її гідроліз штамом Kl. lactis 42К відбувається менш активно - ледь помітні плями лактози виявлені через 48 год. Під час зброджування суміші лактози і сахарози асоціацією дріжджів Kl. lactis 42К та Sacch. cerevisiae V-30 у зброджуваному середовищі цукрів залишається менше, ніж під час зброджування лактози і мальтози дріжджами Kl. lactis 42К та Sacch. cerevisiae К-81. Так, наприкінці процесу в бражці у незначних кількостях присутні фруктоза і галактоза. Лактоза при цьому гідролізується практично повністю. Отже встановлена можливість використання Kl. lactis 42К для зброджування лактози і сахарози та їхньої суміші, але не мальтози. Показана ефективність використання змішаних культур різних штамів Sacch. cerevisiae та Kl. lactis 42К для зброджування лактози із сахарозою чи мальтозою.

За ступенем інтенсивності зброджування дріжджами Kl. lactis 42К цукри можна розташувати у наступій послідовності: глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, галактоза. Дослідження зброджування модельних розчинів дають підстави припускати, що цей процес можна прискорити за рахунок постійного перемішування середовища.

3.4 Дослідження особливостей зброджування молочної сироватки у суміші з мелясою. Кількість спирту, отриманого з одиниці об'єму сироватки, у порівнянні з іншими традиційними видами сировини незначна, що пояснюється низьким вмістом зброджуваного цукру у ній. Тому доцільно провадити зброджування сироватки у суміші із сировиною, що містить цукри. Такою сировиною є меляса.

Для проведення експериментів із молочної сироватки і меляси готували середовище, що містило 12 % вуглеводів за співвідношення лактози і сахарози 1:2. Додатково у суміш вносили 0,5 % карбаміду і 0,15 % ортофосфорної кислоти. Зброджування вуглеводів здійснювали в колбах монокультурами дріжджів Kl. lactis 42К і Sacch. cerevisiae V-30, або змішаною культурою, що складали із вказаних штамів у співвідношенні 1:2.

Встановлено, що протягом 72 год найменший рівень накопичення спирту відмічений при зброджуванні суміші дріжджами Sacch. cerevisiae V-30. Проте ефективність зброджування вуглеводів є досить високою і сягає 0,6 мл етанолу/год. Значний вміст залишкових вуглеводів в бражці обумовлений нездатністю вказаного штаму зброджувати лактозу (табл. 2).

Таблиця 2. Покзники процесу зброджування меляси з молочною сироваткою культурами дріжджів

Виявлено можливість використання дріжджів Kl. lactis 42K для зброджування суміші меляси і молочної сироватки. Рівень накопичення спирту в бражці перевищує аналогічний показник при використанні Sacch. cerevisiae V-30 на 15 %. Проте вміст залишкових вуглеводів у культуральній рідині досить значний.

Найкращі результати отримані при використанні змішаної культури дріжджів. У зазначений період штами зброджують до 93 % вуглеводів. Водночас ефективність утворення етанолу з вуглеводів сягає 0,61 мл/г.

В умовах ферментерів тривалість процесу бродіння становила 64-66 год. (рис. 3). В них протягом першої доби зброджується до 70 % вуглеводів. Потім швидкість зброджування знижується, що, вочевидь, пов'язано із переходом дріжджів на зброджування продуктів ферментативного гідролізу лактози, зокрема галактози. Вихід етанолу у бражці, що визріла, складає 0,6 мл/г, а валова швидкість утворення спирту - 25,3 мл/л за добу. Отримані результати свідчать про високу ефективність зброджування суміші молочної сироватки і меляси асоціативною культурою дріжджів Kl. lactis 42K та Sacch. cerevisiae V-30.

4. Особливості росту дріжджів Kl. lactis 42K, що засвоюють лактозу, в аеробних умовах.

4.1 Ріст Kl. lactis 42K на середовищі з різними вуглеводами. Вивчено послідовність засвоєння лактози і сахарози штамом, що досліджувався. В умовах періодичного культивування у середовищі, що містить по 1 % сахарози і лактози, встановлено, що спершу дріжджі використовують сахарозу, а потім лактозу. Під час використання сахарози максимальне значення питомої швидкості росту штаму сягає 0,42 год^-1, а лактози - 0,36 год^-1. Отримані дані свідчать про те, що лактоза використовується штамом гірше, ніж сахароза. Пошук температури, що забезпечує максимальну питому швидкість росту дріжджів, ми провадили у періодичному процесі вирощування при рН 5,5 у середовищі Рідер із 1 % лактози. Встановлено, що ріст досліджуваного штаму спостерігається в діапазоні температур від 22 до 37 ⁰С. Проте температурний оптимум знаходиться у вузьких межах 28-30 ⁰С. Варто відмітити, що штам досить чутливий до змін температури культивування. Так відхилення її на 5 ⁰С від оптимального значення призводить до зниження питомої швидкості росту на 30-35 %. Зазначимо, що найсуттєвіше її зменшення відмічено в зоні супраоптимальних величин.

Вплив концентрації водневих іонів (рН 3,0-8,0) на ріст досліджуваної культури вивчали при оптимальній температурі 26-28 ⁰С. Максимальна питома швидкість росту дріжджів спостерігається при рН 5,0-5,5. При рН нижче 3,2 і вище 7,5 дріжджі не росли.

Вплив РО 2 на питому швидкість росту вивчали при температурі 28 ⁰С та рН 5,5 у середовищі із 1 % лактози в умовах турбідостата. Встановлено, що зміни рО 2 в межах 20-60 % не впливають на питому швидкість, яка досягає 0,36 год^-1. При зменшенні рО 2 від 20 до 10 % відмічено зниження значень m до 0,22 год^-1.

В умовах хемостатного культивування за швидкості розбавляння 0,3 год^-1 вивчено вплив рО 2 на величину економічного коефіцієнта. Встановлено, що при лімітуванні росту джерелом вуглеводного живлення зміни рО 2 від 20 до 50 % не впливають на ефективність використання лактози, що становить 0,28 г АСД/г. Зниження рО 2 від 20 до 8 % викликає суттєве зменшення економічного коефіцієнта, яке супроводжується появою в культуральній рідині етилового спирту.

Здійснені дослідження дозволили визначити оптимальні значення парціального тиску розчиненого в середовищі кисню (20-50 %), що забезпечують досягнення найбільших значень питомої швидкості росту і економічного коефіцієнта за джерелом вуглеводного живлення. Це, зрештою, визначає ефективність використання сировини та продуктивність процесу культивування дріжджів.

Вивчення впливу вмісту лактози на ефективність її засвоєння досліджуваним штамом провадилося в умовах періодичного культивування при оптимальних значеннях температури (28-30 ⁰С), активної кислотності середовища (рН 5,5) та парціального тиску розчиненого в середовищі кисню (рО ₂ 20-50 %). Встановлено, що при вмісті лактози в середовищі до 1,5 % економічний коефіцієнт сягав найбільших значень, що складали 0,27-0,28 г АСД/г. Із збільшенням концентрації вуглецю від 1,5 до 6,0 % ефективність використання лактози поступово знижувалася до 0,11 г АСД/г. Одночасно в культуральній рідині виявлено накопичення етанолу.

4.2 Ріст дріжджів Kl. lactis 42K на молочній сироватці. Вивчення особливостей росту досліджуваного штаму на молочній сироватці здійснювали при оптимальних значеннях температури, рН середовища, рО 2. Для забезпечення дріжджів джерелом азотного та фосфорного живлення до молочної сироватки додавали 6 г/л карбаміду і 2 г/л ортофосфорної кислоти. В умовах періодичного культивування встановлено, що на початку процесу вирощування питома швидкість росту дріжджів не перевищує 0,12 год^-1 (рис. 4). Тоді ж спостерігається накопичення етанолу до 1,5-1,6 об. %. Це свідчить про зброджування лактози навіть в аеробних умовах, що є проявом ефекту Кребтрі. Економічний коефіцієнт по лактозі складає 0,07-0,08 г АСД/г лактози. Зі зниженням концентрації лактози з 4,5 до 1,5 % характер росту культури різко змінюється. Питома швидкість росту штаму зростає до 0,3 год^-1, а ефективність використання лактози до 0,27 г АСД/г. Накопичення етанолу в культуральній рідині припиняється. Аналіз отриманих даних показує, що процес культивування дріжджів, що здійснюється на молочній сироватці, характеризується невисокими середніми значеннями економічного коефіцієнта і валової швидкісті росту, які складають 0,14 г АСД/г і 0,36 г АСД/лЧгод відповідно. Це обумовлено низькою ефективністю використання лактози і швидкістю росту досліджуваного штаму у початковому періоді культивування. лактоза культивування молочна етиловий

Для підвищення ефективності процесу вирощування дріжджів нами рекомендовано використання від'ємно-доливного способу культивування із заміною до 1/3 об'єму культуральної рідини за годину молочною сироваткою. Концентрація лактози в культуральній рідині при цьому не перевищуватиме 1,5 %, що забезпечить високе значення економічного коефіцієнта.

Вивчено ріст дріжджів Kl. lactis 42K на молочній сироватці в умовах безперервного культивування при зміні швидкості розбавлення середовища від 0,1 до 0,35 год^-1. Встановлено, що при лімітуванні росту дріжджів джерелом вуглеводного живлення і зміни Д від 0,1 до 0,3 год^-1 концентрація біомаси в культуральній рідині практично не змінюється і становить 12,4-12,6 г АСД/л (рис. 5). При цьому ефективність використання лактози сягає 0,27-0,28 г АСД/г лактози. Подальше підвищення швидкості розведення до 0,35 год^-1 призводить до вимивання культури з ферментера. Найбільшу продуктивність процесу відмічено при Д=0,3 год^-1. Отримані дані свідчать про можливість використання напів- та безперервного процесу культивування з метою отримання дріжджів для подальшого зброджування суміші молочної сироватки і меляси.

ВИСНОВКИ

1. Вивчено здатність зброджувати лактозу серед 74 штамів дріжджів, що належать до родів Kluyveromyces, Debaryomyces, Cryptococcus. Встановлено, що найефективніше зброджували лактозу дріжджі роду Kluyveromyces. Ефективність зброджування лактози у деяких штамів сягала 80-85 % від теоретичного виходу етанолу. Представники родів Debaryomyces та Cryptococcus мали низьку бродильну активність.

2. Оптимізовано умови зброджування молочної сироватки селекціонованим штамом Kluyveromyces lactis 42К. Найбільший вміст спирту в бражці виявлено при температурі 30-32 ⁰С, рН середовища 4,5-5,0, концентрації сечовини, що додають до сироватки, - 0,5 %, і ортофосфорної кислоти - 0,2 %.

3. Вивчено здатність Kl. lactis 42К зброджувати вуглеводи. Встановлено, що досліджуваний штам здатний утворювати спирт із сахарози, лактози, глюкози, галактози, фруктози, але не з мальтози. За ступенем зброджування вуглеводи можна розмістити в наступній послідовності, що спадає: глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, галактоза.

4. З метою інтенсифікації процесу зброджування поживного середовища, що містить лактозу з сахарозою чи мальтозою, показано доцільність використання змішаних культур, що складаються із Kl. lactis 42К та промислових штамів Saccharomyces cerevisiae V-30 чи K-81. Це дозволяє збільшити вміст спирту в бражці і знизити концентрацію залишкових вуглеводів.

5. Вивчено послідовність ферментативного гідролізу і зброджування лактози з сахарозою чи мальтозою змішаними культурами, що складаються із Kl. lactis 42К та Sacch. cerevisiae V-30 чи K-81. Показано, що спочатку гідролізується сахароза чи мальтоза, а потім лактоза. Найінтенсивніше зброджується глюкоза, потім галактоза і фруктоза.

6. Досліджено процес зброджування поживного середовища, що складається з молочної сироватки і меляси, змішаною культурою дріжджів. Встановлено, що протягом 64-66 годин вміст вуглеводів знижується із 12,0 до 0,2 %. Концентрація спирту у зрілій бражці сягає 7,1 об. %, а ефективність зброджування вуглеводів - 0,6 мл спирту/г.

7. Вивчено особливості росту дріжджів Kl. lactis 42К в умовах аеробного культивування в середовищі, що містить лактозу. Встановлено, що в умовах періодичного вирощування найбільші значення питомої швидкості росту і економічного коефіцієнта, які становлять 0,34-0,36 год^-1 і 0,27-0,28 г АСД/г лактози відповідно, досягаються при температурі 28-30 ⁰С; рН середовища 5,0-5,5; рО 2 - 20-50 % і концентрації лактози не більше 1,5 %.

8. З метою досягнення високих концентрацій біомаси вирощування дріжджів в аеробних умовах на молочній сироватці доцільно використовувати від'ємно-доливний спосіб із заміною 0,25-0,30 об'єму культуральної рідини за годину або ж безперервний спосіб, лімітуючи ріст штаму джерелом вуглеводного живлення.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Подгорский В.С., Швец В.Н., Гавриленко М.Н., Нагорная С. С., Иванова Л.А., Королюк Т.А., Киштаари М. Исследование процесса сбраживания углеводов дрожжевыми культурами // Микробиол. журн. - 1995. - № 6, т. 57. - С. 29-33.

2. Подгорский В.С., Швец В.Н., Гавриленко М.Н., Нагорная С.С., Королюк Т.А., Киштаари М. Селекция дрожжей-продуцентов этанола на молочной сыворотке // Микробиол. журн. - 1997. - № 6, т. 59. - С. 3-7.

3. Подгорский В.С., Гавриленко М.Н., Нагорная С.С., Сумневич В.Г., Швец В.Н., Тодосийчук С.Р., Киштаари М. Особенности роста лактозоусваивающих дрожжей в аэробных условиях // Микробиол. журн. - 1998. - № 1, т. 60. - С. 11-16.

4. Патент України на винаходи. № 21298 А від 04.11.97 р. Спосіб виробництва етилового спирту із меляси / Швець В.М., Іванова Л.О., Мислінська С.А., Королюк Т.А., Тодойсійчук С.Р., Підгорський В.С., Гавриленко М.М., Нагорна С. С., Кіштаарі М.; Заявка № 94076017 від 1.07.94 р.

5. Патент України на винаходи. № 22494 А від 03.03.98 р. Спосіб виробництва етилового спирту з крохмалевмісної сировини. / Швець В.М., Іванова Л.О., Мислінська С. А., Королюк Т.А., Кіштаарі М.; Заявка № 95031201 від 16.03.95 р.

АНОТАЦІЇ

Кіштаарі М. Вивчення фізіолого-біохімічних особливостей дріжджів, що утилізують лактозу, для отримання етилового спирту. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 1999 р.

Дисертація присвячена вивченню результатів селекції дріжджів, здатних зброджувати лактозу з утворенням етилового спирту. Вивчено здатність селекціонованого штаму дріжджів зброджувати різні вуглеводи та їхні суміші. Показано доцільність використання змішаних дріжджових культур для зброджування середовища, що містить лактозу та сахарозу чи мальтозу. Це дозволяє значно інтенсифікувати процес накопичення спирту. Вивчена послідовність ферментативного гідролізу і зброджування дисахаридів змішаними культурами. Запропоновано спосіб отримання середовища, що містить молочну сироватку і мелясу. Вивчено особливості фізіології штаму дріжджів, що засвоює лактозу, в умовах аеробного культивування а також оптимальні умови його вирощування. Культивування дріжджів на молочній сироватці рекомендовано проводити від'ємно-доливним чи безперервним способом.

Ключові слова: молочна сироватка, дріжджі, зброджування, етиловий спирт, культивування.

Киштаари М. Изучение физиолого-биохимических особенностей дрожжей, утилизирующих лактозу, с целью получения этилового спирта. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 - микробиология. - Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 1999.

Диссертация посвящена изучению результатов селекции дрожжей, сбраживающих лактозу с образованием этилового спирта. Изучена способность сбраживать лактозу молочной сыворотки у 15 штаммов дрожжей Kluyveromyces lactis. Показано, что исследуемые культуры существенно отличаются по способности накапливать этиловый спирт. На сыворотке с 3,8 % лактозы активные штаммы продуцировали от 1,93 до 2,12 об. % этанола, при этом выход его по отношению к теоретическому составлял 80-85 %. Наибольшие скорость и эффективность сбраживания нативной молочной сыворотки отмечены у селекционированного штамма Kl. lactis 42К. Исследована возможность изученного штамма сбраживать различные углеводы и их смеси.

Показана целесообразность применения смешанных дрожжевых культур при сбраживании сред, содержащих лактозу с сахарозой или мальтозой, что позволяет существенно интенсифицировать процесс накопления спирта. Установлена эффективность использования ассоциаций, состоящих из штамов Kl. lactis 42К и Sacch. cerevisiae V-30. При содержании углеводов в питательной среде 12 % остаточные концентрации сахаров в бражке составляют 0,4-0,9 %, а содержание этанола достигает 6,9-7,5 об. %.

Изучена последовательность ферментативного гидролиза и сбраживания дисахаров смешанными культурами. Предложен способ получения среды, содержащей молочную сыворотку и мелассу.

Изучены особенности физиологии лактозоусваивающего штамма дрожжей в условиях аэробного культивирования. С этой целью было исследовано влияние ряда факторов на рост селекционированного штамма лактозоусваивающих дрожжей Kl. lactis 42К. Найдены оптимальные значения температуры культивирования, рН среды, парциального давления растворенного в среде кислорода и концентрации лактозы, при которых максимальная удельная скорость роста достигает 0,36 ч-1, а эффективность использования источника углеродного питания - 0,28 АСД/г лактозы.

В условиях периодического культивирования исследован рост штамма на среде с сахарозой и лактозой. Показано, что вначале дрожжи ассимилируют сахарозу, а затем - лактозу. Установлены особенности роста штамма на молочной сыворотке. Так, в начале культивирования низкие значения удельной скорости роста и экономического коэффициента штамма обусловлены эффектом Кребтри. После снижения концентрации лактозы в среде до 1,5 %, скорость роста штамма и эффективность использования углевода значительно возрастают.

Для достижения высоких концентраций биомассы и наибольшей продуктивности процесса культивирования штамма на молочной сыворотке предложены хемостатный способ выращивания дрожжей при лимитировании роста источником углеродного питания или отъемно-доливной способ.

Ключевые слова: молочная сыворотка, дрожжи, сбраживание, этиловый спирт, культивирование.

M. Kishtaari. Study of physiological and biochemical peculiarities of yeast fermenting lactose to obtain ethyl spirit. - Manuscript.

Ph.D. thesis pursuing a scientific degree of Doctor of Biological Sciences in specialty 03.00.07 - Microbiology. - Institute of Microbiology and Virology named after D.K. Zabolotnyi, Ukrainian National Academy of Sciences, Kiev, 1999.

5 scientific works are defended on results of selective breeding of yeast fermenting lactose with ethyl spirit formation. It has been studied the ability of selected strain (culture) to ferment different carbohydrates and their mixtures. Expediency of mixed yeast cultures usage while fermenting mediums containing lactose, sucrose or maltose, which allows to intensify process of spirit accumulation substantially, was demonstrated. Sequence of ferment hydrolysis and fermentation of disaccharide by mixed cultures was studied. The way of obtaining mediums containing whey and molasses was offered. Peculiarities of physiology of yeast culture assimilating lactose under conditions of aerobic cultivation were studied. The optimal conditions of its cultivation are determined. It is recommended to cultivate yeast in whey by removal-top-up method or continuous operation.

Key words: whey, yeast, fermentation, ethyl spirit, cultivation.

Размещено на Allbest.ru