Позаклітинні лектини бактерій роду Bacillus

Таблиця 7. Спорідненість позаклітинних лектинів Bacillus до природних глікоконьюгатів

Таблиця 8. Аглютинація кролячих еритроцитів лектинами Bacillus у присутності Са2+ і ЕДТА (титр-1 РГА)

Одна з важливих характеристик досліджуваних лектинів - це їхня термостабільність. Прогрівання 1 %-них розчинів лектинів при 80 °С протягом майже 5 год. не змінює їхні аглютинуючі властивості, у той час як інші лектини рідко витримують прогрівання вище, ніж 50 °С (Atkinson H.M., Trust T.I., 1980; Dehazya P., Coles R.S., 1982; Huang J. et al., 1988).

Стабільність бацилярних лектинів при зберіганні. Необхідною умовою при роботі з препаратами лектинів є збереження їхніх головних характеристик: активності та вуглеводної специфічності при довгому зберіганні. Дослідження різних способів зберігання позаклітинних лектинів бацил дало можливість установити, що ці речовини у ліофілізованому стані можуть зберігатися роками без особливих втрат активності та специфічності.

Одержані дані щодо гемаглютинуючих властивостей позаклітинних лектинів Bacillus свідчать про те, що ці біополімери мають дуже вузьку вуглеводну специфічність та високий ступінь впізнавання точно певних структур і можуть успішно конкурувати з моноклональними антитілами як аналітичні й діагностичні реагенти. Лектини бацил стійкі до впливу різних факторів зовнішнього середовища (температури, рН, хелатуючих агентів, тривалого зберігання), що є важливі-шою відмінністю від інших бактерійних лектинів і визначає їхні переваги при одержанні та використанні.

Біологічна активність позаклітинних лектинів Bacillus

Гостра токсичність лектинів бацил. Науковий і практичний інтерес до бактерійних лектинів зумовлений їхньою постійною дією на організм макроорганізмів і можливістю регуляції імунологічної реактивності організму за допомогою цих фізіологічно активних речовин. Лектини сапрофітних бактерій можуть стати перспективними медикаментозними препаратами. Визначення одного з головних фармакологічних індексів медикаментозних препаратів - гострої токсичності на двох видах тварин при різних шляхах введення показала, що досліджувані лектини бацил відносяться до помірних та малотоксичних речовин (табл. 9).

Таблиця 9. Середньосмертельні дози лектинів Bacillus за різними шляхами введення

Примітка: тут и далі досліджували сумарні препарати лектинів 668 и 102.

Протипухлинна активність лектинів бацил. Проведене вивчення протипухлинної активності позаклітинних лектинів Bacillus у відношенні штамів пухлин різного генезу дозволило одержати різні результати (рис. 10). Найбільш активну та стабільну протипухлинну дію у відношенні гальмування росту пухлин виявляв лектин 668 (позитивний ефект на 4-х з 5-ти експериментальних пухлин). Близьким до нього за протипухлинним ефектом був лектин 102 (гальмування росту 3-х пухлин). Дія лектина 316 була неоднозначною: цей лектин мав вагомий протипухлинний ефект на одному штамі пухлини, а на двох - стимулював їх ріст. Такі неоднозначні результати цілком пояснюються; відомо, що при трансформації нормальної клітини в пухлинну в складі компонентів поверхні клітини відбувається ряд кількісних та якісних змін: збільшується кількість сіалових кислот, змі-нюється їхній якісний склад, зв'язки з субтермінальним вуглеводом (Глузман Д.Ф. и др., 1989). Досліджувані лектини, які мають тонкі відмінності в пізнаванні різних типів і структур сіалових кислот, можливо, спочатку розпізнають певні компоненти поверхні клітини, а потім чинять імунотропну дію, характерну для кожного лектину, в протипухлинний ефект. Одержані дані відкривають нові сторони фармакологічної дії позаклітинних сіалоспецифічних лектинів Bacillus та дозволяють розглядати їх як вельми перспективні протипухлинні засоби, можливо, у сполученні з іншими терапевтичними препаратами.

Вплив лектинів бацил на окремі ланцюги імуногенезу та імунну відповідь макроорганізму. Вивчення впливу позаклітинних лектинів бацил на окремі рівні імуногенезу від початкових етапів (функціонального стану поліпотентної стовбурової клітини кісткового мозку) до функціонування системи імунітету (диференційованої оцінки специфічних реакцій Т- і В- лімфоцитів та їх кооперативної взаємодії в імунній відповіді) дозволило встановити, що всі досліджувані лектини бацил мають виражений та диференційований імуностимулюючий ефект (рис. 10). На ранні етапи імуногенезу (міграцію і проліферацію стовбурової клітини кісткового мозку) найбільшу дію чинить лектин 102 (+44,6-51 %); міграція та функціональна активність Т- і В-лімфоцитів (середні етапи) приблизно однакова при дії всіх трьох лектинів з деякою перевагою для лектину 668 (22,2-35,7 %); однак, вплив лектину 316 на кооперативну взаємодію імунокомпетентних клітин (пізні етапи) значно вища, ніж в інших досліджуваних лектинів (61,4 %).

Імунна відповідь спленоцитів у більшій мірі зростає під впливом лектину 668 (33,0 %), а функціональна активність В-лімфоцитів кісткового мозку значно вища після обробки лектинами 102 і 316 (62,5 та 72,6 % відповідно). Найбільшу дію на В-лімфоцити чинить лектин 668, на Т-клітини - лектин 102. Виявлення вираженого та вибіркового впливу позаклітинних лектинів бацил на різні етапи імуногенезу та імунну відповідь макроорганізму, встановлення можливості селективно модулювати T- і В- системи лімфоцитів має безперечний інтерес з точки зору керованої імунодепресії та імуностимуляції.

Інтерфероногенна активність лектинів бацил. Інтерфероногенні властивості виявлені у вірусів, бактерій та їхніх активних компонентів - ліпополісахаридів (Liener I.E., 1986). Добре вивченими і широко використовуваними у лабораторній практиці є також рослинні лектини: ФГА та КонА (Луцик М.Д. и др., 1981). Аналіз інтерфероніндукуючої здатності позаклітинних лектинів бацил in vivo та in vitro продемонстрував, що всі три лектини є індукторами утворення інтерферону, однак найбільш високий ефект мав лектин 668 (рис. 10). Його інтерфероногенна дія була однаковою з дією стандартних комерційних препаратів рослинних лектинів, а у випадку застосування “праймінгу” перевищувала її. Здатність до індукції синтезу інтерферону лектину 102 була близькою до подібної лектину 668, а для лектину 316 - незначною. Одержані результати свідчать про те, що позаклітинні лектини бацил є сильними індукторами синтезу природного інтерферону; відсутність токсичних та алергічних ефектів дозволяє рекомендувати лектин 668 для широкого використання.

Подібні медико-біологічні властивості лектинів 668 та 102 пояснюються великою схожістю цих лектинів за фізико-хімічними та гемаглютинуючими характеристиками. Лектин 316 відрізняється від них багатьма властивостями і не є винятком у відношенні його біологічної активності.

Одержання активних препаратів сіалоспецифічних лектинів сапрофітних бактерій, вивчення їхніх гемаглютинуючих і фізико-хімічних властивостей та біологічної активності дозволило визначити такі можливі аспекти їх використання. Насамперед, надзвичайна, на наш погляд, тонка вуглеводна специфічність дозволяє застосовувати позаклітинні лектини бацил як цінні аналітичні реагенти та діагностичні препарати, що не поступаються за своєю чутливістю моноклональним антитілам. Медико-біологічні властивості цих біополімерів свідчать про перспективність їхнього використання як протипухлинних та імуномодулюючих лікарських засобів, індукторів синтезу g-інтерферону, а також для конструювання лікарських препаратів на базі бактерійних лектинів (вакцин, молекулярних асоціацій, тощо).

Висновки

1. Проведено широкий пошук продуцентів позаклітинних лектинів серед представників спороутворюючих аеробних бактерій роду Bacillus та виявлено їхню здатність синтезувати та виділяти в середовище росту лектини зі специфічністю, що рідко зустрічається, до сіалових і уронових кислот.

2. Особливостями утворення позаклітинних лектинів сапрофітних культур бацил у процесі їхнього росту є: наявність двох періодів виявлення лектинової активності в динаміці росту бактерій, максимальне продукування лектинів у фазі затримання росту, відокремленість ростових та лектинсинтезуючих процесів. Визначено оптимальні умови утворення позаклітинних лектинів (температура і час вирощування, склад та рН середовища, наявність у ньому біостимуляторів і конкретних вуглеводів), що дозволяє здійснити керований синтез цих біополімерів.

3. Підібрано методи виділення та очищення позаклітинних сіалоспецифічних лектинів бактерій із використанням хроматографії на TSK гелях, гель-фільтрації на різних типах сефароз та ізоелектрофокусування в борат-поліольній системі, які дозволяють одержувати препарати лектинів та їхні ізоформи з високими показниками за активністю, очищенням та ступенем спорідненості до специфічних вуглеводів.

4. У сапрофітних бактерій установлено здатність до продукування двох позаклітинних лектинів, що відрізняються між собою за хімічним складом їхніх молекул, фізико-хімічними характеристиками, активністю та вуглеводзв'язуючими властивостями:

- лектини першої групи відносяться до N-аспарагінзв'язаних глікопротеїнів з вираженими гідрофільними властивостями, молекулярною масою 19-26 кДа, високою гемаглютинуючою активністю та ступенем спорідненості до обох типів сіалових та уронових кислот, а також до фруктозо- 1,6-дифосфату; для першої групи лектинів установлено наявність трьох ізоформ;

- лектини другої групи становлять собою О-серин-треонінзв'язані глікопротеїни, котрі виявляють великі гідрофобні властивості з молекулярною масою 7,7-10,0 кДА, більш низькою активністю і вузькою вуглеводною специфічністю до N-ацетилнейрамінової та D-глюкуронової кислот, лектини цієї групи існують у двох ізоформах.

5. Позаклітинні лектини Bacillus є термостабільними, стійкими до дії рН та детергентів, Ca⁺² - нeзалежними глікополімерами, які зберігають свою активність при тривалому зберіганні, здатними у чистому вигляді утворювати великі агрегати з молекулярною масою 77-260 кДА.

6. Досліджувані лектини розпізнають тонкі відмінності в структурі сіалових кислот та їхніх зв'язках із термінальними вуглеводами; найбільшу спорідненість лектини бацил виявляють до глікоконьюгатів, які містять N-гліколил- та N-ацетилнейрамінові кислоти або ізомер О-ацетильованої форми N-ацетилнейрамінової кислоти з 2,3- та 2,6- зв'язками.

7. Позаклітинні лектини бацил відносяться до помірно й малотоксичних речовин та мають виражені імунотропні властивості: диференційовано стимулюють ведучі ланцюги імуногенезу та імунну відповідь макроорганізму, виявляють вибірковий стимулюючий ефект у відношенні Т- і В-лімфоцитів, чинять селективну протипухлинну дію, виступають індукторами утворення ?-інтерферону в різних біологічних системах.

8. Розроблено лабораторний регламент на отримання позаклітинного сіалоспецифічного лектину (штам B.subtilis 668 1MB), де описуються особливості проведення технологічного процесу і характеристика готового продукту для використання його як імунотропної речовини, індуктора інтерферону та хіміко-аналітичного реагенту. Одержані практичні результати за здатністю лектину B.subtilis 668 ІМВ індукувати синтез інтерферону увійшли як складова частина в ТУ по виробництву інтерферонів свиней та великої рогатої худоби.

9. Позаклітинні сіалоспецифічні лектини сапрофітних бактерій можуть використовуватись у таких напрямках:

- як високочутливі та специфічні аналітичні реагенти (для виділення, очищення, вивчення сіалоспецифічних глікополімерів) та діагностикумів (при пухлинах різного генезу);

- як медикаментозні препарати направленої дії на різні етапи імуногенезу, імунну відповідь макроорганізму, Т- і В-системи імунітету;

- для одержання інтерферонів;

- для профілактики та лікування інфекційних захворювань, злоякісних утворювань та імунодефіцитних станів різної етиології;

- для конструювання на основі бактерійних лектинів принципово нових терапевтичних препаратів.

лектин bacillus хімічний бактерія

Перелік основних праць, опублікованих за темою дисертації

1. Подгорский В.С., Коваленко Э.А., Симоненко И.А. Лектины бактерий. - К.: Наукова думка, 1992. - 203 с.

2. Коваленко Э.А. Внеклеточные лектины бактерий (обзор) //Микробиол. ж. - 1990. - Т. 52, № 3. - С.92-99.

3. Коваленко Э.А. Аминокислотный и моносахаридный состав внеклеточных сиалоспецифичных лектинов бактерий рода Bacillus //Микробиол. ж. - 1997. - Т. 59, № 5. - С. 3-6.

4. Коваленко Э.А. Углеводная специфичность внеклеточных лектинов бактерий рода Bacillus //Микробиол. ж. - 1997. - Т. 59, № 5. - С. 7-13.

5. Коваленко Э.А. Ферменты, обладающие лектиновыми свойствами //Микробиол. ж. - 1984. - Т. 46, № 2. - С. 65-66.

6. Подгорский В.С., Коваленко Э.А., Симоненко И.А. Влияние факторов внешней среды на биосинтез лектинов Bacillus mesentericus //Микробиол. ж. - 1998. - Т. 50, № 2. - С. 12-16.

7. Коваленко Э.А., Колтукова Н.В., Стрельчина Т.В., Подгорский В.С. Использование крахмалсодержащих сред для культивирования Bacillus mesentericus //Прикладная биохимия и микробиология. - 1988. - Т. 24, № 6. - С. 784-788.

8. Подгорский В.С., Коваленко Э.А., Гетьман Е.И., Вьюницкая В.А. Влияние условий культивирования на продуцирование лектинов некоторыми представителями бактерий рода Bacillus //Микробиол. ж. - 1989. - Т. 51, № 5. - С.30-34.

9. Косенко Л.В., Коваленко Э.А. Республиканская конференция “Изучение и применение лектинов” //Микробиол. ж. - 1989. - Т. 51, № 5. - С. 108-110.

10. Коваленко Э.А., Гетьман Е.И., Вьюницкая В.А. Бактерии рода Bacillus - продуценты внеклеточных лектинов //Ученые записки Тартуского ун-та, 869. - 1989. - Т. 1. - С. 72-80.

11. Симоненко И.А., Коваленко Э.А., Подгорский В.С. Лектинпродуцирующая способность Bacillus mesentericus //Ученые записки Тартуского ун-та, 869. - 1989. - Т. 1. - С. 118-123.

12. Подгорский В.С., Коваленко Э.А. Физиологические аспекты регуляции биосинтеза лектинов бактериями рода Bacillus // Ученые записки Тартуского ун-та, 869. - 1989. - Т. 2. - С. 122-126.

13. Коцоурек Я., Франц Г., Этцлер М., Чакрабарти Р., Джильбоа-Гарбер Н., Коваленко Э.А., Косенко Л.В., Лахтин В.М. Лектины и аспекты их изучения (дискуссия). //Микробиол. ж. - 1990. - Т 52, № 1. - С. 84-90.

14. Косенко Л.В., Коваленко Э.А. II-я Международная конференция по лектинам (ИНТЕРЛЕК-II) //Микробиол. ж. - 1990. - Т. 52, №3. - С. 102-105.

15. Скрипаль И.Г., Малиновская Л.П., Токовенко И.П., Коваленко Э.А., Гетьман Е.И. Гидрофобная и водород-связывающая хроматография лектинов // Микробиол. ж. - 1992. - Т. 54, №2. - С. 59-65.

16. Zhigis L.S., Ivanov A.E., Rapoport E.M., Kovalenko E.A., Getman E.I., Zubov V.P. Purification of sialic acid binding protein from saprophytic bacteria by hydrophobic-interaction chromatography on butyl-toyoperl and polymer-coated porous glass //Biotechnology Technique. - 1993 (Sept.) - Vol. 7, № 9. - P. 667-670.

17. Валагурова Е.В., Козырицкая В.Е., Шеремет Л.К., Коваленко Э.А. Способность коллекционных культур стрептомицетов образовывать внеклеточные лектины // Микробиол. ж. - 1994. - Т. 56, №4. - С. 11-15.

18. Kishko Ya.G., Kovalenko E.A. New technology on production of animal gamma-interferons //J. Interferon & Cytokine Research. - 1995. - Vol. 15, Suppl. 1. - P. S84.

19. Rapoport E.M., Ivanov A.E., Zhigis L.S., Kovalenko E.A., Getman E.I., Zubov V.P. Purification of lectin ву hydrophobic - interation and size-exlusion chromatography. //IJBS - 1996. - Vol. 2 (1). - P.17-24.

20. Kishko Ya.G., Vasilenko M.I., Podgorsky V.S.,Kovalenko E.A. Lectin of Bacillus subtilis sp. as overinducer of g-interferonogenesis //Микробиол. ж. - 1997. - Т. 59, № 6. - С. 20-26.

21. Kishko Ya.G., Vasilenko M.I., Podgorsky V.S., Kovalenko E.A. Influence of Bacillus subtilis sp. lectin on functional activity on phagocytes //Мікробіол. ж. - 1998. - Т. 60, № 1. - С. 36-42.

22. Ас. СССР SU № 1622397 А1. МКИ С12 Р 19/04. Способ получения бакте-риального лектина, специфичного к сиаловым кислотам /Подгорский В.С., Коваленко Э.А., Симоненко И.А., Лахтин В.М. Заявлено 01.08.88. Опубл. 12.01.91. Бюл. № 3 - 2 с.

23. Ас. СССР SU № 1756357 А1. МКИ С12 Р 19/00. Способ определения молекулярно-массового распределения биологически активных веществ /Воцелко С.К., Иутинская Г.А., Коваленко Э.А., Симоненко И.А. Заявлено 23.12.88. Опубл. 23.08.92. Бюл. № 31 - 14 с.

24. Ас. СССР № 4936807/1341712. МКИ С12 Р 19/04 Способ получения бактериального внеклеточного лектина /Кудря В.А., Симоненко И.А., Захарова И.Я., Подгорский В.С., Коваленко Э.А. Заявлено 15.01.90. Положительное решение 29.09.92.

25. Ас. СССР SU № 1701322. МКИ 5А 61К 45/2. Индуктор g-интерферона /Кишко Я.Г., Иваненко В.К., Подгорский В.С., Коваленко Э.А., Гетьман Е.И., Лазоренко Л.В., Симоненко И.А. Заявлено 12.05.91. Опубл. в Бюл. № 48, 1992. - 10 с.

26. Патент України UA № 1791. МКІ 5С 12Р 19/04 Засіб одержання бактерійного лектину, специфічного до сіалових кислот /Підгорський В.С., Коваленко Е.О., Симоненко І.А., Лахтін В.М. Заявлено 10.08.91. Опубл. 20.10.93. Бюл. № 3 - 2 с.

27. Патент України UA № 8276 А. Спосіб виготовлення гама-інтерферону та пристрій для його здійснення /Кішко Я.Г., Іваненко В.К., Думанський В.Д., Коваленко Е.О., Лазоренко Л.В., Селезньов О.В. Заявлено 23.03.94. Опубл. 29.03.96. Бюл. № 1 - 5 с.

28. Патент України № В 4602486/4 (4506). МКІ С12 Р 1/00. Штам Bacillus subtilis - продуцент позаклітинного сіалоспецифічного лектину /В'юницька В.О., Коваленко Е.О., Гетьман К.І. Заявлено 30.06.94. Позитивне рішення 5.03.97.

29. Патент України № 98052626. Індуктор синтезу гама-інтерферону /Підгорський В.С., Кішко Я.Г., Коваленко Е.О., Гетьман К.І. Заявлено 20.05.98. Позитивне рішення 5.11.98.

30. Подгорский В.С., Коваленко Э.А., Гетьман Е.И. Лабораторный регламент на производство сиалоспецифичного лектина микроорганизма Bacillus subtilis штамм 668 ИМБ. /Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины. - 1993. - 21 с.

31. Кишко Я.Г., Иваненко В.К., Подгорский В.С., Коваленко Э.А. Гамма-бовиферон /ТУ №15 -9.1/17. - 1992. - 17 с.

32. Кишко Я.Г., Иваненко В.К., Подгорский В.С., Коваленко Э.А. Гамма-суиферон /ТУ №16 -9.1/15. - 1992. - 17 с.

Размещено на Allbest.ru