Вплив екзогенних вірусів і ДНК на спонтанний та індукований мутагенез в соматичних клітинах ссавців

На відміну від чинників іншої природи екзогенні нуклеїнові кислоти не здатні спричиняти фізико-хімічні зміни нуклеотидів, так звані аддукти, але можуть впливати на основні матричні процеси, що протікають на клітинній ДНК. В оглядах літератури, присвячених мутагенній дії вірусів, дискутуються, головним чином, два основних шляхи індукції мутацій в системі екзогенна ДНК - клітина:

1) експресія введенних генів і вплив чужорідних продуктів на метаболізм клітинної ДНК (Shapiro, Marshak, Varshaver, 1984);

2) інтеграція екзогенних нуклеотидних послідовностей з клітинною ДНК та індукція інсерційно-делеційного мутагенезу (Гершензон, 1981, Хесін, 1984, Газарян, 1985);

3) інгібування екзогенними ДНК та модифікованими основами репаративних ферментів клітини. Ці чинники відіграють неоднакову роль на різних стадіях еволюції екзогенної генетичної інформації в клітинах ссавців.

Роль інтеграції екзогенних нуклеотидних послідовностей з клітинною ДНК в мутагенезі розглядалась у першу чергу. По-перше, цей механізм забезпечує постійну інтеграцію чужорідних нуклеотидних послідовностей. По-друге, він є джерелом інсерційно-делеційного мутагенезу. Але, як показано на клітинах ссавців in vitro, інсерції екзогенних нуклеотидних послідовностей не перевищують 3-5% у випадку ретровірусного мутагенезу (Varmus et al., 1981, Jenkins et al., 1981). При дослідженні мутантів, індукованих аденовірусом і вірусом групи герпесу, інсерції зовсім не виявлені (Durnam et al., 1986, Pilon et al., 1986). В експериментах на трансгенних тваринах інсерційні мутації становлять приблизно 8% (Макарова і співавт., 1988). Таким чином, переважна більшість індукованих вірусами пошкоджень ДНК, ймовірно, пов'язана з похибками реплікації та репарації, тобто, є наслідком однониткових розривів та похибок включення. Це пояснює як індукцію хромосомних розривів (поодиноких та множинних), так і відсутність інсерцій і делецій серед мутацій, індукованих ДНК-геномними вірусами.

Дійсно, стимуляція реплікації клітинної ДНК під впливом вірусоспецифічних білкових продуктів збігається у часі з індукцією хромосомних розривів і пошкоджень, що призводять до утворення генних мутацій. Онкогенні віруси стимулюють реплікацію клітинної ДНК, діючи на критичну точку R на стадії клітинного циклу G1 (Pardee et al., 1974) або на тривалість фази S (Martin, Oppenheim, 1977). Можливо, ранні вірусоспецифічні білки "розпізнають" точку початку реплікації Alu-повтору і стимулюють реплікацію клітинної ДНК утворенням додаткових репліконів меншого розміру в областях помірних ДНК-повторів (Callan, 1973,Tenen et al., 1977, Хесін, 1984, Ariga, 1994).

Висловлюється думка, що ранні вірусні гени впливають не тільки на реплікативний процес, а й на власну інтеграцію з лабільними ділянками клітинного геному, активними в стадії G1 (Hiscott, Defendi, 1991), що забезпечує їх максимальну експресію і подальшу стабільну трансформацію клітин. Переважна інтеграція вірусних нуклеотидних послідовностей здійснюється в областях скупчення Alu-повторів;це змінює їх оточення і дестабілізує даний район (Gahlman, Doerfler, 1983, Schultz, Doerfler, 1984, Matsumoto et al., 1988, Taruscio, Manuelidis, 1991, Singh, Dauza, 1992). Cаме тут утворюються місця синапсису хромосом при мітотичному кросинговері (Kuhn, Therman, 1986) та виникають хромосомні розриви (Morgan, Crossen, 1977, Bostock, Sumner, 1978, Calabretta et al., 1980).

Аналіз всієї сукупності даних вказує на те, що Alu-елементи можуть виступати як "гарячі точки" рекомбінаційних та мутаційних подій, а також медіаторів гомологічних та негомологічних рекомбінацій (Nicholls, 1987, Лукаш і співавт., 1996). З цієї позиції ген hprt, який має 49 копій цього генетичного елемента у своєму складі, розміщених у сенс- та антисенс-напрямку (Edwards et al., 1990) є перспективним модельним локусом для мутаційних досліджень з використанням екзогенних ДНК.

Прояв індукованого мутагенезу в системі екзогенна ДНК - клітина пов'язаний не тільки з регуляторним впливом трансформуючих генів або генетичних елементів на реплікацію і рекомбінацію, а також на репарацію пошкоджень. Ми дійшли цього висновку на основі аналізу літературних та власних даних по впливу вірусів на ексцизійну і постреплікативну репарацію клітинної ДНК та інші репаративні системи (Засухіна,1979, Waters et al., 1977, Pegg, 1990, 1995). У даній роботі ми одержали експериментальні підтвердження тому, що екзогенні ДНК з різними матричними якостями та модифікована основа О6-бензилгуанін дійсно підсилюють прояв мутацій, індукованих нітрозогуанідином, внаслідок інгібування унікального репаративного ензиму АГТ. Відкривається перспектива вивчення механізмів репарації пошкоджень при введенні екзогенних нуклеотидних послідовностей, що несуть специфічні первинні пошкодження.

У випадку аденовірусів у підтриманні пухлиноутворюючої здатності клітин вирішальне значення має ранній оперон Е1В (Bernards et al., 1992), який, за нашими даними, є геном-мутатором. Білковий продукт 19К, що кодує оперон Е1В, безпосередньо взаємодіє з клітинним білком р53, який має ключове значення для злоякісної трансформації клітин (Levin, 1994). Також, мутагенна активність екзогенного Alu-повтору, який не кодує білкових продуктів, але є активно експресуючим генетичним елементом (має промотор, і точку початку реплікації, гомологічну відповідному регуляторному елементу ДНК-геномних вірусів), свідчить про можливу роль РНК-транскриптів в мутаційному процесі, ймовірно, через механізм оберненої транскрипції і транспозиції (Хесін, 1984, Акіфєв, Худолій, 1993).

Таким чином, одержані нами дані вказують на можливий напрямок подальших досліджень - вивчення впливу продуктів транскрипції і трансляції екзогенних генів та їх комплексів на мутагенез через основні матричні процеси в соматичних клітинах ссавців.

ВИСНОВКИ

1. Сформульовано і експериментально обгрунтовано концепцію регуляції мутаційного процесу під впливом екзогенних нуклеотидних послідовностей вірусного та клітинного походження в соматичних клітинах ссавців на підставі узагальнення літературних і власних даних. Первинним чинником індукованого мутаційного процесу в системі аденовірус - клітина є експресія ранніх регуляторних генів, відповідальних за стимуляцію реплікації і злоякісну трансформацію клітин. Вторинним чинником дестабілізації є перепрограмування клітинного геному (зміна активності та мутації клітинних генів, транспозиції мобільних генетичних елементів) під впливом експресії вірусних генів та інтеграції їх з хромосомною ДНК. Додатковим чинником мутагенезу, який підвищує ймовірність прояву мутацій, є відтягування репаративних та інших ДНК-зв'язуючих ферментів на взаємодію з молекулами генетичної матриці екзогенного походження.

2. Вперше розроблено і апробовано комплексний методичний підхід: конструювання модельних систем екзогенна ДНК - клітина з використанням регуляторних факторів (генетичні елементи, пухлинний промотор ТРА, нуклеотидтрифосфати), для вивчення онкогенних та мутагенних властивостей екзогенних нуклеотидних послідовностей, а також механізмів їхньої дії. На прикладі фізичних, хімічних та біологічних чинників продемонстровано, що ТРА вибірково підсилює мутагенний ефект тільки тих із них, що мають канцерогенну активність.

3. Встановлено, що біологічно активні аденовіруси, здатні до злоякісної трансформації клітин in vitro, спричиняють статистично достовірне підвищення частоти генних мутацій та хромосомних аберацій:

а) вперше показано, що аденовірус є комплексним мутагеном, результуючий мутагенний ефект якого в непермісивних клітинах визначається взаємодією ранніх регуляторних оперонів: Е1А, Е1В та Е4;

б) максимальний мутагенний ефект виявляється при введенні у клітини in vitro повної трансформуючої області Е1 BAV3-3 у віддалені строки після трансфекції і збігається у часі (3 тижні) з проявом пухлиноутворення при тестуванні трансформованих клітин на сингенних мишах in vivo;

в) різниця в онкогенності та мутагенності досліджуваних аденовірусних клонів BAV3-1 та BAV3-3, можливо, пов'язана з внутрішньою гетерогенністю їх популяцій внаслідок відбору і домінування вірусних часточок з різним рівнем експресії онкогена при культивуванні інфікованих клітин за різних умов.

4. Мутагенна активність раннього оперону Е1В (клоновані фрагменти геному BAV3-1 та BAV3-3) корелює з проявом онкогенної активності і залежить від регуляторних чинників, що впливають на рівень його експресії: присутності енхансера і оперону Е1А, довжини нестабільної нуклеотидної послідовності між оперонами Е1А та Е1В і дії пухлинного промотору ТРА.

5. Мутаторна природа раннього оперону Е1В BAV3-3, відповідального за здатність клітин до пухлиноутворення, остаточно підтверджується в експериментах щодо встановлення мутаційного темпу в популяції трансформованих клітин, що містять інтегровані вірусні послідовності, за допомогою флуктуаційного тесту.

6. Показано, що регуляторні гени вірусів (ранні оперони аденовірусу, онкогени ретровірусів, ген тимідинкінази вірусу герпесу), і нуклеотидні послідовності клітинного похождення (ген препроінсуліну, Alu-елемент геному людини), які односпрямовано стимулюють реплікацію та інші матричні процеси на клітинній ДНК, можуть підвищувати при цьому рівень мутацій і підсилювати мутагенну дію один одного.

7. Часткова інактивація екзогенної ДНК за допомогою алкілування призводить до зниження, а повна - до втрати мутагенності. В той же час присутність чужорідної матриці, що є відволікаючим субстратом для ДНК-зв'язуючих ферментів, у першу чергу репаративних мутагенів:

а) порівняно з молекулами активної ДНК алкіловані нуклеотидні послідовності, які є більш спорідненим субстратом до репаративного ферменту АГТ, призводять до значнішого підвищення мутагенного ефекту нітрозогуанідину; мутагенез вірусний генетичний

б) максимальний синергідний ефект спостерігається при комбінованій дії на клітини О6-бензилгуаніну (практично повне пригнічення репаративної активності О6-алкілгуанін-ДНК-алкілтрансферази) та нітрозогуанідину;

в) одержано опосередковані дані (підвищена чутливість клітин гризунів порівняно з клітинами людини до комбінованої обробки), що свідчать про певну роль ексцизійної системи репарації в поновленні пошкоджень, індукованих нітрозогуанідином.

8. Молекулярний аналіз мутацій, індукованих нітрозогуанідином за умов активної та пригніченої репарації, дозволив виявити деякі особливості роботи ферменту АГТ: однакову ефективність стосовно ниток ДНК, що транскрибуються і не транскрибуються, і підвищену точність виправлення пошкоджень на ГЦ-багатих ділянках, які мають більш високу температуру плавлення і довше зберігають двониткову структуру.

9. Екзогенні ДНК вірусного та клітинного походження є розповсюдженими біологічними чинниками, що мають матричні властивості і здійснюють регуляторно-інформаційний вплив на мутагенез в соматичних клітинах ссавців. Це вказує на необхідність визначення ролі цих чинників в мінливості біосистем і на напрямок подальших досліджень механізмів регуляції мутаційного процесу за допомогою нуклеотидних послідовностей певної структури і функцій.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Лукаш Л.Л. Мутационный процес и злокачественная трансформация, индуцированные аденовирусами в клетках млекопитающих // Цитология и генетика. - 1986. - 20, №1. - С. 55-58.

2. Бужиевская Т.И., Лукаш Л.Л. Биологические мутагены окружающей среды // Генетические последствия окружающей среды. -Киев: Наукова думка, 1989. - С. 121-143.

3. Лукаш Л.Л. Взаимосвязь мутагенеза и злокачественной трансформации, эволюционные аспекты // Генетические последствия загрязнения окружающей среды. - Киев: Наукова думка, 1989. - С. 144-164.

4. Лукаш Л.Л. Мутагенез и злокачественная трансформация, вызванные онкогеном аденовируса // Мутагенное действие природных и синтетических полинуклеотидов. - Киев: Наукова думка, 1991. - С. 76-93.

5. Лукаш Л.Л. Мутагенез і антимутагенез - протилежно спрямовані процеси, що визначають рівень генетичної мінливості та стабільності // Биополимеры и клетка. - 1998. - 14, №6. - С. 500-511.

6. Lukash L.L., Buzhievskaya T.I., Varshaver N.B., Shapiro N.I. Oncogenic adenovirus as mutagen for Chinese hamster cells in vitro // Somatic Cell Genetics. - 1981. - 7, №2. - P. 133-146.

7. Чарикова Е.В., Лукаш Л.Л., Залманзон Е.С. Мутагенное действие высокоонкогенного бычьего аденовируса типа 3 (БАВ-3) // Биологические науки. - 1983. - №4. - С. 86-89.

8. Лукаш Л.Л., Кононенко Л.И., Бужиевская Т.И., Быкорез А.И., Шапиро Н.И. Злокачественная трансформация культивируемых клеток // Экспериментальная онкология. - 1984. - 4, №5. - С. 33-35.

9. Рубашевский Е.Л., Лукаш Л.Л., Бужиевская Т.И., Ландау С.М., Сасина Л.К., Стецяк Т.И. Мутагенность ДНК вируса простого герпеса и плазмиды pBR325tk // Доклады АН СССР. - 1984. - 279, №3. - С. 752-754.

10. Лукаш Л.Л., Кононенко Л.И., Бужиевская Т.И., Быкорез А.И., Шапиро Н.И. Усиление с помощью ТФА мутагенного и трансформирующего действия бычьего аденовируса типа 3 на культивируемые клетки мыши // Экспериментальная онкология. - 1985. - 7, №1. - С. 30-32.

11. Лукаш Л.Л., Варшавер Н.Б., Бужиевская Т.И., Шапиро Н.И. Роль онкогена в мутагенной активности бычьего аденовируса типа 3 // Биологические науки. - 1985. - №5. - С. 80-84.

Размещено на Allbest.ru